专利名称：红豆杉干细胞培养、分离方法
技术领域：
本发明具 体涉及一种植物干细胞分离方法，特别涉及一种红豆杉干细胞培养、分离方法。
背景技术：
从药用植物红豆杉中提取的药用成份紫杉醇对于多种癌症的治疗有着重要的应用价值和前景。由于野生红豆杉是珍稀保护植物，法律禁止砍伐。生产上采用大量种植红豆杉的办法为分离提取紫杉醇提供原料。但由于红豆杉生长周期长，占用耕地；又由于只有红豆杉树皮中才含有紫杉醇，且含量极低，大约10吨树皮中才能提取I公斤紫杉醇，所以这种传统的生产技术的成本极高。另外，提炼紫杉醇的过程中，由于有外加的化学溶剂，导致提炼后余下不能清除的有毒残余物，超出指定的剂量而影响治疗的功效。现有技术是通过离体悬浮培养红豆杉的细胞来生产紫杉醇，这种方法不受红豆杉生长季节的限制就可以通过规模化生产来获得紫杉醇。通常取红豆杉的茎或叶片为外殖体在特定培养基上培养，经过脱分化阶段诱导成具有分裂能力的愈伤细胞，进一步将该细胞悬浮培养来生产紫杉醇。但目前已有的技术在分离红豆杉细胞时，均采用已经分化的组织器官为外殖体，通过离体培养阶段的培养(脱分化过程)将其诱导为具有分化能力的愈伤细胞。但这种细胞的本质是来源于已经分化的体细胞，所以分裂能力有限，抗逆能力不强。在工业化量产过程中，经常会出现细胞系退化，分裂能力弱，很难进行超大体积的培养。
发明内容
本发明的目的是提供一种红豆杉干细胞培养、分离方法，用于解决现有技术中的问题，提供一种具有无限分裂能力且分裂能力强的处于未分化状态的红豆杉干细胞的培养、分离方法，该干细胞由于本身的性质，在通过离体悬浮培养方法可以进行超大体积的培养，得到大量的干细胞，从而可以大量生产紫杉醇。本发明解决问题采用的技术方案是:红豆杉干细胞培养、分离方法，其特征在于:首先将东北红豆杉的直径为I厘米的当年生嫩枝经过0.1 %的升汞消毒处理10分钟，然后从嫩枝上切下包含周皮、韧皮部和形成层在内的外殖体切片，放置在含有0.2-2.0mg.L-1毒莠定与0.2-1.5mg.L-1萘乙酸的B5培养基上，25°C黑暗下培养；两周后将形成层明显增殖的外殖体取出，分离形成层干细胞并转移到转继代培养基上培养；继代培养基为含有0.2-2.0mg.L-1毒莠定与0.2-1.5mg.L-1萘乙酸的B5培养基上，每两周继代一次，短期内可以获得大量的干细胞。本发明的有益效果:本发明中培养的干细胞是处于未分化状态的细胞，具有无限分裂的能力，所以悬浮培养中如果采用干细胞将可以避免脱分化体细胞的缺点，可以得到大量的干细胞，从而可以大量的生产紫杉醇，满足患者的需要。
图1是本发明红豆杉外植体切段图；图2是本发明红豆杉形成层干细胞诱导增殖图；图3是 本发明红豆杉干细胞继代增殖图。
具体实施例方式实施例1:本发明红豆杉干细胞的培养、分离方法，首先将东北红豆杉的直径为I厘米的当年生嫩枝经过0.1 %的升汞消毒处理10分钟，然后从嫩枝上切下包含周皮、韧皮部和形成层在内的外殖体切片(见附图1)，放置在含有0.5mg.L-1毒莠定与0.5mg.L-1萘乙酸的B5培养基上，25°C黑暗下培养。由于形成层的干细胞分裂速度快，导致形成层干细胞团自然与外殖体其余部分分裂开来(见附图2)，这种干细胞团质地致密，表面较光滑平整。两周后将形成层明显增殖的外殖体取出，分离形成层干细胞并转移到转继代培养基上培养(见附图3)。继代培养基为含有0.5mg.L-1毒莠定与0.5mg.L-1萘乙酸的B5培养基，每两周继代一次，短期内可以获得大量的干细胞。实施例2:首先将东北红豆杉的直径为I厘米的当年生嫩枝经过0.1%的升汞消毒处理10分钟，然后从嫩枝上切下包含周皮、韧皮部和形成层在内的外殖体切片，放置在含有0.2mg.L-1毒莠定与1.5mg.L-1萘乙酸的B5培养基上，25°C黑暗下培养；两周后将形成层明显增殖的外殖体取出，分离形成层干细胞并转移到转继代培养基上培养；继代培养基为含有0.2mg.L-1毒莠定与1.5mg.L-1萘乙酸的B5培养基上，每两周继代一次，短期内可以获得大量的干细胞。实施例3:首先将东北红豆杉的直径为I厘米的当年生嫩枝经过0.1%的升汞消毒处理10分钟，然后从嫩枝上切下包含周皮、韧皮部和形成层在内的外殖体切片，放置在含有2.0mg.L-1毒莠定与0.2mg.L-1萘乙酸的B5培养基上，25°C黑暗下培养；两周后将形成层明显增殖的外殖体取出，分离形成层干细胞并转移到转继代培养基上培养；继代培养基为含有2.0mg.L-1毒莠定与0.2mg.L-1萘乙酸的B5培养基上，每两周继代一次，短期内可以获得大量的干细胞。另外可以考虑通过显微操作分离茎尖生长点、根尖生长点或形成层出的干细胞，然后直接在离体条件下培养分离出来的干细胞。但这种方案的操作难度较大，成功的几率很低。针对已有的红豆杉细胞悬浮培养体系中体细胞的缺点，本发明注重培养和分离红豆杉的干细胞。因为干细胞是处于未分化状态的细胞，具有无限分裂的能力，且分裂能力强，所以悬浮培养中如果采用干细胞进行培养将可以避免脱分化体细胞的缺点，且短期内可以得到大量的干细胞，有利于紫杉醇的大量生产，满足患者的需求。
权利要求
1.红豆杉干细胞培养、分离方法，其特征在于:首先将东北红豆杉的直径为I厘米的当年生嫩枝经过0.1 %的升汞消毒处理10分钟，然后从嫩枝上切下包含周皮、韧皮部和形成层在内的外殖体切片，放置在含有0.2-2.0mg.L-1毒莠定与0.2-1.5mg.L-1萘乙酸的B5培养基上，25°C黑暗下培养；两周后将形成层明显增殖的外殖体取出，分离形成层干细胞并转移到转继代培养基上培养；继代培养基为含有0.2-2.0mg.L-1毒莠定与0.2-1.5mg.L-1萘乙酸的B5培养基上， 每两周继代一次，短期内可以获得大量的干细胞。
全文摘要
红豆杉干细胞培养、分离方法，其特征在于首先将东北红豆杉的直径为1厘米的当年生嫩枝经过0.1％的升汞消毒处理10分钟，然后从嫩枝上切下包含周皮、韧皮部和形成层在内的外殖体切片，放置在含有0.2-2.0mg.L-1毒莠定与0.2-1.5mg.L-1萘乙酸的B5培养基上，25℃黑暗下培养；两周后将形成层明显增殖的外殖体取出，分离形成层干细胞并转移到转继代培养基上培养；继代培养基为含有0.2-2.0mg.L-1毒莠定与0.2-1.5mg.L-1萘乙酸的B5培养基上，每两周继代一次，短期内可以获得大量的干细胞。本发明中培养的干细胞是处于未分化状态的细胞，具有无限分裂的能力，可以得到大量的干细胞，从而可以大量的生产紫杉醇，满足患者的需要。
文档编号C12N5/02GK103087974SQ20111033083
公开日2013年5月8日 申请日期2011年10月27日 优先权日2011年10月27日
发明者黄涛 申请人:鹭港生物药业有限公司