专利名称：一种脑肿瘤干细胞分离方法
技术领域：
本发明属于干细胞技术领域，具体地说是一种脑肿瘤干细胞分离方法。
背景技术：
脑肿瘤干细胞(Brain cancer stem cells，BCSCs)研究的首要问题就是如何从异质性的脑肿瘤细胞群中分离出极少量的BCSCs，目前主要有以下几种分离BCSCs的方法。1、利用BCSCs表面的人白细胞分化抗原133 (⑶13 标记分子进行筛选常用的筛选方法有荧光激活细胞分选术(FACQ和磁性激活细胞分选术(MACS)。 其中FACS法是目前应用较广泛的分离方法，通过荧光标记的CD133特异性抗体与细胞表面 CD133分子结合后，将能发出荧光的BCSCs分选出来。2、利用生物学特性进行功能分选(SP细胞分选)用能结合DNA的荧光染料烟酸己可碱33342 (Hoechst 33342)处理细胞，利用肿瘤干细胞可将染料泵出细胞不发出荧光的性质，经过FACS分选，将不被染色或低染色的侧群细胞(SP细胞)筛选出来。但是SP分选法中用到的荧光染料对BCSCs可能有一定的毒性作用，会使分离出的BCSCs的活性与功能发生改变，影响后续的培养研究。上述1、2这两种分选方法均还存在如下不足过程繁琐，时间冗长，费用也比较昂贵，且都存在一定的主观性，可因细胞的制备方法、设门(gating)等不同而有所差异，存在一定的误差，最重要的是经过长时间染色和分选后细胞的活力必然会受到影响，进而影响下一步的培养或者生物学特性研究。3.利用BCSCs体外成神经球生长的特性进行分选脑肿瘤细胞在添加了生长因子的无血清神经干细胞培养基中生长，其中的BCSCs 增殖而形成致密球状，保持不分化状态；而脑肿瘤非干细胞则贴壁生长，且在无血清条件下生长速度缓慢。有科学家将脑肿瘤手术标本制成单细胞悬液后，用无血清神经干细胞培养基(DMEM/F12培养基+B27添加剂+表皮生长因子(FGF) +表皮生长因子(FGF))进行培养可形成肿瘤球，此肿瘤球细胞经过免疫组化检测显示细胞表面高表达CD133和巢蛋白(nestin)分子(两者均为正常神经干细胞的表面标记)，且肿瘤球中的部分细胞移植到免疫缺陷小鼠体内可致瘤，说明脑肿瘤球中存在一定比例的BCSCs。但是BCSCs在体外悬浮培养的过程中有可能分化成脑肿瘤非干细胞，且利用已有方法得到的BCSCs纯化程度低 (20% 30% )，不能很好地满足后期大量研究的需求。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种脑肿瘤干细胞分离方法， 该方法既能抑制脑肿瘤干细胞的分化并促进其增殖分裂，又能杀死脑肿瘤非干细胞亚群， 获得大量高纯度脑肿瘤干细胞。为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下一种脑肿瘤干细胞分离方法，包括如下步骤
4
获取原代脑肿瘤细胞；原代脑肿瘤细胞的消化传代将所述脑肿瘤细胞接种至第一无血清干细胞培养基中，再加入蛋白酶体抑制剂MG-132进行培养后，用第一无血清干细胞培养基进行换液， 然后加入多烯紫杉醇和阿霉素进行二次培养，获得原代脑肿瘤球细胞；蛋白酶体抑制剂 MG-132在第一无血清干细胞培养基中的含量为10 25ymol/L ；原代脑肿瘤球细胞的收集传代将所述原代脑肿瘤球细胞洗涤收集，再接种至第二无血清干细胞培养基中进行培养传代，获得所述的脑肿瘤干细胞；其中，所述第二无血清干细胞培养基中含有重组白血病抑制因子ESGR0。上述脑肿瘤干细胞分离方法先通过原代脑肿瘤细胞的消化传代，有效的抑制了原代脑肿瘤细胞的分化，同时杀死肿瘤非干细胞亚群，再通过对原代脑肿瘤球细胞的收集传代，进一步抑制脑肿瘤细胞中脑肿瘤干细胞的自发分化，促进BCSCs的增殖分裂，达到快速高效地获得大量纯化脑肿瘤干细胞的目的，经测定得知，该脑肿瘤干细胞分离方法获得的脑肿瘤干细胞纯度高达到50% 60%。其中，在原代脑肿瘤细胞的消化传代步骤中，蛋白酶体抑制剂MG-132能有效的干扰原代脑肿瘤细胞原有的增殖、分化和凋亡，使得原代脑肿瘤细胞停滞于细胞周期的&/M期，多烯紫杉醇与阿霉素能有效杀死原代脑肿瘤细胞中的脑肿瘤非干细胞亚群，该蛋白酶体抑制剂MG-132与多烯紫杉醇和阿霉素有效地实现了协同作用，有效达到抑制原代脑肿瘤细胞的分化，杀死肿瘤非干细胞亚群的目的；在原代脑肿瘤球细胞的收集传代步骤中，重组白血病抑制因子ESGRO能有效抑制脑肿瘤干细胞的分化、 促进其增殖的目的，实现对脑肿瘤干细胞在培养体系中的有效富集和纯化。另外，该脑肿瘤干细胞分离方法显著的节约了脑肿瘤干细胞分离所需的费用和时间，降低了脑肿瘤干细胞的分离的成本。
图1是本发明实施例脑肿瘤干细胞组成结构示意图；图2是本发明实施例脑肿瘤干细胞分离方法工艺流程示意图。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。研究显示，脑肿瘤细胞是由极少量的脑肿瘤干细胞(BCSCs)和大量的脑肿瘤非干细胞组成，如图1所示。要提高脑肿瘤细胞群中BCSCs的比例，必须首先杀死一部分脑肿瘤非干细胞。基于上述思路，本发明实施例提供了一种既能抑制脑肿瘤干细胞的分化并促进其增殖分裂，又能杀死脑肿瘤非干细胞亚群，获得大量高纯度脑肿瘤干细胞的脑肿瘤干细胞分离方法。该脑肿瘤干细胞分离方法的工艺流程如图2所示，包括如下步骤步骤Sl 获取原代脑肿瘤细胞；步骤S2 原代脑肿瘤细胞的消化传代-将所述脑肿瘤细胞接种至第一无血清干细胞培养基中，再加入蛋白酶体抑制剂MG-132(下文均简称MG-132)进行培养后，用第一无血清干细胞培养基进行换液，然后加入多烯紫杉醇和阿霉素进行二次培养，获得原代脑肿瘤球细胞；MG-132在第一无血清干细胞培养基中的含量为10 25 μ mol/L ；步骤S3 原代脑肿瘤球细胞的收集传代-将所述原代脑肿瘤球细胞洗涤收集，再接种至第二无血清干细胞培养基中进行培养传代，获得所述的脑肿瘤干细胞；其中，所述第二无血清干细胞培养基中含有重组白血病抑制因子ESGRO(下文均简称ESGR0)。这样，上述脑肿瘤干细胞分离方法先通过原代脑肿瘤细胞的消化传代，有效的抑制原代脑肿瘤细胞的分化，同时杀死肿瘤非干细胞亚群，再通过对原代脑肿瘤球细胞的收集传代，进一步抑制脑肿瘤细胞中脑肿瘤干细胞的自发分化，促进BCSCs的增殖分裂，达到快速高效地获得大量纯化脑肿瘤干细胞的目的，经测定得知，该脑肿瘤干细胞分离方法获得的脑肿瘤干细胞纯度高达到50% 60%。其中，在原代脑肿瘤细胞的消化传代步骤中， MG-132能有效的干扰原代脑肿瘤细胞原有的增殖、分化和凋亡，使得原代脑肿瘤细胞停滞于细胞周期的&/M期，多烯紫杉醇与阿霉素能有效杀死原代脑肿瘤细胞中的脑肿瘤非干细胞亚群，该MG-132与多烯紫杉醇和阿霉素有效地实现了协同作用，有效达到抑制原代脑肿瘤细胞的分化，杀死肿瘤非干细胞亚群的目的；在原代脑肿瘤球细胞的收集传代步骤中， ESGRO能有效抑制脑肿瘤干细胞的分化、促进其增殖的目的，实现对脑肿瘤干细胞在培养体系中的有效富集和纯化。另外，该脑肿瘤干细胞分离方法显著的节约了脑肿瘤干细胞分离所需的费用和时间，降低了脑肿瘤干细胞的分离的成本。具体地，上述步骤Sl中，获取原代脑肿瘤细胞方法优选为直接采用已有的获取脑肿瘤细胞株或者采用原代脑肿瘤细胞的分离培养方法获取。如采用原代脑肿瘤细胞的分离培养方法获取时，该原代脑肿瘤细胞的分离培养方法优选为取l-2cm3脑肿瘤组织，在无血清的RPMI-1640培养液中清洗，去血管，剪碎后置于胶原酶溶液中进行处理后，反复吹打胶原酶处理后的溶液，并经滤网过滤，制成脑肿瘤单细胞悬液，接着将该脑肿瘤单细胞悬液离心，获得所述原代脑肿瘤单细胞，然后将该原代脑肿瘤单细胞接种至含血清肿瘤细胞培养基中进行培养。其中，为了最大限度的保证原代脑肿瘤细胞的活性，优选将离体后的肿瘤组织在 4°C下保存，并30min内进行分离。胶原酶的浓度优选为0. 5 1. 5mg/ml，更优选为lmg/ml。 脑肿瘤组织在胶原酶溶液中进行处理的温度优选为37°C，处理时间优选为1小时。滤网优选为200目的滤网，脑肿瘤单细胞悬液优选在2000rpm的转速下离心Smin。原代脑肿瘤单细胞的接种量优选为2X IO5个细胞/ml，原代脑肿瘤单细胞的培养优选在(X)2体积百分含量为4 6%，温度为36 38°C的条件下保温培养，更优选在(X)2体积百分含量为5%，温度为37°C的条件下保温培养1-3天。具体地，上述步骤S2 中，加入的 MG_132(EMD Millipore, Cat. No 474790)是一种有效、可逆的细胞渗透蛋白酶抑制剂(Ki = 4nM)，能快速进入细胞，其活性和特异性强， 通过抑制细胞内泛素-蛋白酶体的活性，阻断泛素-蛋白酶体通路，影响细胞周期蛋白、 信号分子和细胞因子的表达，从而干扰细胞的增殖、分化和凋亡过程，特别是对恶性增殖的肿瘤细胞的敏感性更加明显。发明人在研究中发现，MG-132能使恶性增殖的脑肿瘤细胞停滞于细胞周期的&/M期，并对脑肿瘤细胞有抑制增殖和诱导凋亡的作用，且具有一定的剂量依赖性和时间依赖性，在一定浓度下，它可以选择性抑制脑肿瘤细胞内的蛋白酶体 (Proteasome)，导致脑肿瘤细胞停留在有丝分裂的间期。因此，为了能更有效的干扰原代脑肿瘤细胞原有的增殖、分化和凋亡，使得原代脑肿瘤细胞停滞于细胞周期的&/M期，在第一无血清干细胞培养基中的含量优选为20 μ mol/L。该优选浓度，能进一步干扰原代脑肿瘤细胞原有的增殖、分化的效果。在上述步骤S2中，经MG-132干扰原代脑肿瘤细胞原有的增殖、分化，并将原代脑肿瘤细胞调整至细胞周期的&/M期后，采用第一无血清干细胞培养基进行对该原代脑肿瘤细胞进行洗脱，换液，以达到降低或除去MG-132的浓度，实现消除MG-132对原代脑肿瘤细胞的干扰，脑肿瘤细胞可以由有丝分裂间期同步进入到有丝分裂后期，从而使得脑肿瘤细胞对细胞周期特定化疗药物敏感。此时，再向第一无血清干细胞培养基加入多烯紫杉醇和阿霉素，多烯紫杉醇是特异性针对M期的周期依赖性化疗药物，阿霉素是特异性针对( 期的周期依赖性化疗药物，两者能有效的杀死原代脑肿瘤细胞中的脑肿瘤非干细胞亚群，其中，该多烯紫杉醇在第一无血清干细胞培养基中的含量优选为5 15 μ mol/L,更优选为 10 μ mol/L,阿霉素在第一无血清干细胞培养基中的含量优选为0. 5 2 μ mol/L,更优选为 1 μ mol/L。该优选浓度的多烯紫杉醇和阿霉素能更有效的杀死原代脑肿瘤细胞中的脑肿瘤非干细胞亚群，达到初步纯化BCSCs的目的。发明人进一步研究发现，MG-132、多烯紫杉醇和阿霉素对GO期的BCSCs作用不大，且由于BCSCs细胞膜上高表达耐药泵，可将MG-132、多烯紫杉醇和阿霉素药物排出细胞外，使得BCSCs免受伤害。因此，采用MG-132与多烯紫杉醇和阿霉素周期依赖性化疗药物联用其到了协同作用，有效达到了的杀死脑肿瘤非干细胞亚群，纯化BCSCs的目的。
在上述步骤S2中，该第一无血清干细胞培养基优选包含如下配方组份 DMEM/F12 培养基93 ~ 98.5 ν/ν %
Β27 添力口剂1 ~ 5 ν/ν %
胰岛素(insulin)2 ~ 6U/L
人重组表皮生长因子(hrEGF)10 ~ 30ng/ml
人重组碱性成纤维细胞生长因子(hrbFGF) 5 ~ 15ng/ml
抗生素 P/S/G0.5 ~ 2 ν/ν %
在本发明一优选实施例中，上述第一无血清干细胞培养基包含如下配方组份
DMEM/F12 培养基97 ν/ν %
氏7添加剂2ν/ν%
胰岛素(insulin)4 U/L
人重组表皮生长因子(hrEGF)20 ng/ml
人重组碱性成纤维细胞生长因子(hrbFGF)10 ng/ml
抗生素 P/S/G1 ν/ν %。
该优选配方的第一无血清干细胞培养基有利于BCSCs增殖，形成原代脑肿瘤球细胞。在上述步骤S2中，脑肿瘤细胞的接种密度优选为IX IO5 3X IO5个细胞/ml，进一步优选为2 X IO5个细胞/ml ；加入MG-132进行培养和加入多烯紫杉醇和阿霉素进行二次培养均优选是在(X)2体积百分含量为4 6%，温度为36 38°C的条件下保温培养6 10 小时，进一步优选在(X)2体积百分含量为5%，温度为37°C的条件下保温培养8小时。该优选的培养条件，有利于BCSCs的增殖，形成致密球状即原代脑肿瘤球细胞。进一步地，在上述步骤S2中，如果上述步骤Sl中的原代脑肿瘤细胞是采用原代脑肿瘤细胞的分离培养方法获取是，经含血清肿瘤细胞培养基培养后，如经l-3d培养后，原代脑肿瘤细胞会贴培养瓶壁生长为致密单层，此时，在将原代脑肿瘤细胞接种至第一无血清干细胞培养基中进行培养前，应对原代脑肿瘤细胞进行前期预处理，具体包含的步骤优选为先吸弃含血清肿瘤细胞培养基，加入IOml杜氏磷酸缓冲液(DPBS)洗涤，再加入2ml 胰蛋白酶，并使胰蛋白酶均勻布满瓶壁，待瓶壁的贴壁细胞漂浮起来后，迅速加入约IOml 消化终止液，并用移液管将细胞从瓶壁上完全吹打下来，得到细胞悬液，然后将细胞悬液转入离心管中离心，吸弃上清。其中，消化终止液包含体积百分比的93 97%的DPBS和3 7 %的胎牛血清(FBQ，该消化终止液进一步优选包含体积百分比的95 %的DPBS和5 %的胎牛血清(FBS)。具体地，上述步骤S3中，原代脑肿瘤球细胞洗涤收集的方法优选为用DPBS洗涤后，用第二无血清干细胞培养基将原代脑肿瘤球细胞吹打重悬。用DPBS洗涤的目的是以除去培养体系中的多烯紫杉醇和阿霉素化疗药物。这是因为，发明人在研究中同时发现， BCSCs具有很强的自我更新和多向分化能力，在体外分离培养的过程中，部分BCSCs会分化成脑肿瘤非干细胞，因此要提高BCSCs在脑肿瘤细胞中的比例，除了杀灭其中大量的脑肿瘤非干细胞外，如何维持BCSCs的多潜能特性、抑制其分化也是一个关键问题。因此，发明人在本步骤中采用添加ESGRO来解决该问题。ESGRO是经过优化的重组白血病抑制因子，比普通白血病抑制因子的抑制作用更强，当用于脑肿瘤细胞培养时，能高效抑制脑肿瘤细胞中BCSCs的自发分化，且能促进BCSCs的增殖分裂。但是发明人在研究中还发现，ESGRO的促增殖作用与上述多烯紫杉醇和阿霉素化疗药物对增殖细胞的杀伤作用会产生抵触，若同时存在于培养体系中，化疗药物可能会杀死一部分处于增殖分裂的BCSCs。为了解决此问题，发明人采用化疗药物与ESGRO分步骤使用，在培养前期通过添加化疗药物“MG132+多烯紫杉醇+阿霉素”选择性杀灭脑肿瘤细胞群中的非干细胞，培养后期通过在第一无血清干细胞培养基的基础上添加ESGRO即第二无血清干细胞培养基来抑制BCSCs的分化、促进增殖， 这两方面共同保证了 BCSCs在培养体系中的有效富集和纯化。因此，在上述步骤S3中，第二无血清干细胞培养基优选含如下配方组份
DMEM/F12 培养基93 ~ 98.5 ν/ν %B271 力口齐 1J 胰岛素
人重组表皮生长因子
人重组碱性成纤维细胞生长因子5 ~ 15ng/ml
抗生素P/S/G
在本发明另一优选实施例中，上述第二无血清干细胞培养基包含如下配方组份
DMEM/F12 培养基97 ν/ν %
氏7添加剂2ν/ν%
胰岛素(insulin)4 U/L
人重组表皮生长因子(hrEGF)20 ng/ml
人重组碱性成纤维细胞生长因子(hrbFGF) 10 ng/ml 抗生素 P/S/G1 ν/ν %
ESGRO1000 U/ml。该优选配方的第二无血清干细胞培养基能有效的促进BCSCs增殖的同时，有效的抑制BCSCs分化成脑肿瘤非干细胞，实现BCSCs即原代脑肿瘤球细胞的收集传代。在上述步骤S3中，原代脑肿瘤球细胞的接种密度优选为IX IO5 3X IO5个细胞 /ml，进一步优选为2X IO5个细胞/ml，并优选以1 2或1 3的比例进行传代3 5代； 原代脑肿瘤球细胞的培养传代优选是在(X)2体积百分含量为4 6%，温度为36 38°C的条件下保温培养6 10小时，进一步优选在(X)2体积百分含量为5%，温度为37°C、湿度为 100%的条件下保温培养8小时。在培养过程，为了保证第二无血清干细胞培养基的营养恒定，优选每隔3天添加新鲜的hrEGF和hrbFGF。该优选的培养条件，更有利于抑制BCSCs的分化，使得BCSCs快速增殖，实现对脑肿瘤干细胞在培养体系中的有效富集和纯化。进一步优选地，上述脑肿瘤干细胞分离方法还包括对BCSCs含量的测定，测定方法优选包含如下步骤(1)将上述步骤S3中收集的脑肿瘤球细胞重悬计数后转IO6个细胞到5ml离心管中，用预冷的含有体积百分含量2%热灭活小牛血清的HBSS溶液(HBSS/2%HICQ洗两次(1000rpm，5min)，再用100 μ 1 HBSS/2% HICS重悬。加入5μ 1免疫球蛋白溶液(lmg/ ml)，冰上孵育IOmin后，用HBSS/^2% HICS洗两次，再用100 μ 1 HBSS/2% HICS重悬细胞。 以1μ 1/106个细胞的浓度加入荧光标记的抗体PE-⑶133，冰上孵育20min后，用HBSS/^W HICS洗两次，再用0. 5ml含有7氨基放线菌素(7AAD)的HBSS/2% HICS重悬细胞(7AAD在体系中的终浓度为lyg/ml)。(2)流式细胞仪检测使用流式细胞仪如BD FACSCalibur流式细胞仪在488nm波
9长的光源激发待测细胞，检测出其中抗原分子⑶133阳性的(⑶133+)BCSCs的百分比。按照上述方法测定，本发明脑肿瘤干细胞分离方法分离的脑肿瘤干细胞纯度高达 50% -60%。本发明中，上述“ ν/ν % ”均表示体积百分含量。现以具体的脑肿瘤干细胞分离方法为例，对本发明进行进一步详细说明。实施例1脑肿瘤干细胞分离方法，即采用“MG-132+多烯紫杉醇+阿霉素+ESGRO实验模型” 包括如下步骤Sll.试剂及溶液的配制(1)试剂细胞培养所需试剂DPBS、胰蛋白酶(Gibco公司)、胶原酶、胎牛血清(FBS)、DMEM 培养基、DMEM/F12培养基、RPMI-1640培养基、B-27添加剂(无血清和维生素A)、胰岛素 (insulin)、人重组表皮生长因子(human recombinant epidermal growth Factor,hrEGF, Sigma公司)、人重组碱性成纤维细胞生长因子(human recombinant basic fibroblast growth factor, hrbFGF, Sigma 公司)、ESGRO(Chemicon 公司)、MG_132(EMD Millipore, Cat. No 474790)、多烯紫杉醇、阿霉素、抗生素P/S/G(青霉素/链霉素/庆大霉素)。溶液配制MG-132用二甲基亚砜(DMSO)溶解，配成80 μ mol/L的溶液待用，_20°C 避光保存，使用前稀释至终浓度；多烯紫杉醇和阿霉素溶于生理盐水，-20°C保存。流式细胞检测所需试剂PE_CD133抗体(Miltenyi公司)、HBSS缓冲液、小牛血清、免疫球蛋白、7AAD。(2)培养基的配制含血清肿瘤细胞培养基的培养组份DMEM 培养基 89v/v%FBS10v/v%抗生素P/S/G lv/v%。第一无血清干细胞培养基的培养组份
DMEM/F12 培养基 97 ν/ν % B272 ν/ν %
insulin4 U/L
hrEGF20 ng/ml
hrbFGF10 ng/ml
抗生素 P/S/G1 v/v %。第二无血清干细胞培养基的培养组份DMEM/F12 培养基 97 ν/ν %
hrbFGF
hrEGF
B27
insulin
抗生素P/S/G
2 ν/ν % 4U/L 20 ng/ml 10 ng/ml
1 ν/ν %
ESGRO
lOOOU/ml。(3)消化终止液的配制DPBS (95v/v% ) +FBS (5v/v% )S12 :脑肿瘤干细胞分离方法的具体步骤S121 原代脑肿瘤细胞的分离培养①取手术切除的新鲜脑肿瘤组织2cm3，在无血清的RPMI-1640培养液中清洗、去血管，用消毒的手术剪刀尽快剪碎后置于50ml离心管中；②加入一定量的lmg/ml的胶原酶溶液，37°C水浴Ih后，用移液管反复吹打，将细胞悬液经200目滤网制成单细胞悬液；③2000rpm，8min离心后细胞用含血清肿瘤细胞培养基吹打重悬，接种到175cm2 培养瓶，密度约为2 X IO5个细胞/ml，置于37°C，5v/v%的(X)2环境中进行培养；S122.原代脑肿瘤细胞的消化传代①按上述步骤S121的培养条件进行培养3d，待细胞贴壁生长为致密单层后，吸弃培养液，加入IOmlDPBS洗涤两次后，加入2ml胰蛋白酶，使其均勻铺满瓶壁，待瓶壁的贴壁细胞漂浮起来，迅速加入约IOml消化终止液，摇晃均勻，并用移液管将细胞从瓶壁上完全吹打下来；②吹打完全后将细胞悬液转入50ml离心管中，IOOOrpm离心8min，吸弃上清，用第一无血清干细胞培养基吹打重悬细胞；③细胞计数后接种到175cm2培养瓶中，密度约为2X IO5个细胞/ml，另外加入 MG-132(终浓度20μπιΟ1/υ至培养瓶中。置于37°C，5v/v% CO2环境中进行培养，培养他后，用PBS清洗3次，并进行换液后，加入多烯紫杉醇(ΙΟμπιοΙ/L)和阿霉素(Ιμπιο /L)继续培养。以上步骤重复2次；S123.脑肿瘤球的收集传代按上述步骤S122的培养条件进行培养①按上述步骤S122的培养条件进行培养7d后，出现悬浮细胞球，收集原代肿瘤球细胞，用DPBS洗涤两次后，用第二无血清干细胞培养基将细胞吹打重悬，按2 X IO5个细胞/ml的密度以1 2的比例进行传代，在传代培养过程中，每隔3天添加新鲜的hrEGF和 hrbFGF，培养条件为 37°C，5v/v% CO2，湿度 100% ；②使用第二无血清干细胞培养基连续传4代后，收集脑肿瘤球细胞，即可淘汰绝大部分脑肿瘤非干细胞，得到大量纯度较高且保持活力的BCSCs ；S13.脑肿瘤球细胞中CD133+BCSCs的含量测定①流式细胞检测前的细胞染色将上述步骤S123中收集的脑肿瘤球细胞重悬计数后转IO6个细胞到5ml离心管中，用预冷的含有2V/V%热灭活小牛血清的HBSS溶液 (HBSS/2 % HICS)洗两次(lOOOrpm, 5min)，再用 100 μ 1HBSS/2 % HICS 重悬，加入 5 μ 1 免疫球蛋白溶液(lmg/ml)，冰上孵育IOmin后，用HBSS/2% HICS洗两次，再用100 μ 1 HBSS/2% HICS重悬细胞，以1 μ 1/106个细胞的浓度加入荧光标记的抗体PE-⑶133，冰上孵育20min 后，用HBSS/2% HICS洗两次，再用0. 5ml含有7AAD的HBSS/2% HICS重悬细胞(7AAD在体系中的终浓度为lyg/ml)；②流式细胞仪检测使用流式细胞仪BD FACSCalibur在488nm波长的光源激发待测细胞，检测出其中⑶133+BCSCs的百分比；本实施例1的脑肿瘤干细胞分离方法共选取5个样本进行分离，并均经上述步骤S13测量，本实施例1脑肿瘤干细胞分离方法所获得的脑肿瘤干细胞纯度平均高达 57. 82%，具体参见下述表1中数值。对比实例1脑肿瘤干细胞分离方法，该分离方法采用“MG-132+ESGR0实验模型”，包括如下步骤S31.试剂及溶液的配制参照实施例1中步骤Sll ；S32.脑肿瘤干细胞分离方法的具体步骤S321.原代脑肿瘤细胞的分离培养参照实施例1中步骤S121 ；S322.原代脑肿瘤细胞的消化传代①按上述步骤S321的培养条件进行培养3d，待细胞贴壁生长为致密单层后，吸弃培养液，加入IOmlDPBS洗涤两次后，加入2ml胰蛋白酶，使其均勻铺满瓶壁，待瓶壁的贴壁细胞漂浮起来，迅速加入约IOml消化终止液，摇晃均勻，并用移液管将细胞从瓶壁上完全吹打下来；②吹打完全后将细胞悬液转入50ml离心管中，IOOOrpm离心8min，吸弃上清，用第
一无血清干细胞培养基吹打重悬细胞；③细胞计数后接种到175cm2培养瓶中，密度约为2X IO5个细胞/ml，另外加入 MG-132(终浓度20μπιΟ1/υ至培养瓶中。置于37°C，5v/v% CO2环境中进行培养。S323.脑肿瘤球的收集传代①按上述步骤S322的培养条件进行培养7d后，出现悬浮细胞球，收集原代肿瘤球细胞，用DPBS洗涤两次后，用第二无血清干细胞培养基将细胞吹打重悬，按2 X IO5个细胞/ml的密度以1 2的比例进行传代，在传代培养过程中，每隔3天添加新鲜的hrEGF和 hrbFGF，培养条件为 37°C，5v/v% CO2，湿度 100% ；②使用第二无血清干细胞培养基连续传4代后，收集脑肿瘤球细胞。即可淘汰绝大部分脑肿瘤非干细胞，得到大量纯度较高且保持活力的BCSCs。S33.脑肿瘤球细胞中⑶133+BCSCs的含量测定参照实施例1中步骤S13 ；本对比实施例1的脑肿瘤干细胞分离方法共选取5个样本进行分离，并均经上述步骤S13测量，本对比实施例1脑肿瘤干细胞分离方法所获得的脑肿瘤干细胞纯度参见下述表1中数值。对比实例2脑肿瘤干细胞分离方法，该分离方法采用“ESGR0实验模型”，包括如下步骤
S41.试剂及溶液的配制参照实施例1中步骤Sll ；S42.脑肿瘤干细胞分离方法的具体步骤S421.原代脑肿瘤细胞的分离培养参照实施例1中步骤S121 ；S422.原代脑肿瘤细胞的消化传代①按上述步骤S421的培养条件进行培养3d，待细胞贴壁生长为致密单层后，吸弃培养液，加入IOmlDPBS洗涤两次后，加入2ml胰蛋白酶，使其均勻铺满瓶壁，待瓶壁的贴壁细胞漂浮起来，迅速加入约IOml消化终止液，摇晃均勻，并用移液管将细胞从瓶壁上完全吹打下来；②吹打完全后将细胞悬液转入50ml离心管中，IOOOrpm离心8min，吸弃上清，用第
一无血清干细胞培养基吹打重悬细胞；③细胞计数后接种到175cm2培养瓶中，密度约为2X IO5个细胞/ml，置于37°C， 5V/V%C02环境中进行培养；S423.脑肿瘤球的收集传代①按上述步骤S422的培养条件进行培养7d后，出现悬浮细胞球，收集原代肿瘤球细胞，用DPBS洗涤两次后，用第二无血清干细胞培养基将细胞吹打重悬，按2 X IO5个细胞/ml的密度以1 2的比例进行传代，在传代培养过程中，每隔3天添加新鲜的hrEGF和 hrbFGF，培养条件为 37°C，5v/v% CO2，湿度 100% ；②使用第二无血清干细胞培养基连续传4代后，收集脑肿瘤球细胞。即可淘汰绝大部分脑肿瘤非干细胞，得到大量纯度较高且保持活力的BCSCs ；S43 脑肿瘤球细胞中⑶133+BCSCs的含量测定参照实施例1中步骤S13。本对比实施例2的脑肿瘤干细胞分离方法共选取5个样本进行分离，并均经上述步骤S13测量，本对比实施例2脑肿瘤干细胞分离方法所获得的脑肿瘤干细胞纯度参见下述表1中数值。空白对照实例3脑肿瘤干细胞分离方法，该分离方法采用“ESGR0实验模型”，包括如下步骤S41.试剂及溶液的配制参照实施例1中步骤Sll ；S52.脑肿瘤干细胞分离方法的具体步骤S521.原代脑肿瘤细胞的分离培养参照实施例1中步骤S121 ；S522.原代脑肿瘤细胞的消化传代参照对比实例2中步骤S422 ；S523.脑肿瘤球的收集传代①按上述步骤S522的培养条件进行培养7d后，出现悬浮细胞球，收集原代肿瘤球细胞，用DPBS洗涤两次后，用第一无血清干细胞培养基将细胞吹打重悬，按2 X IO5个细胞/ml的密度以1 2的比例进行传代，在传代培养过程中，每隔3天添加新鲜的hrEGF和 hrbFGF，培养条件为 37°C，5v/v% CO2，湿度 100% ；②使用第一无血清干细胞培养基连续传4代后，收集脑肿瘤球细胞。S53 脑肿瘤球细胞中⑶133+BCSCs的含量测定参照实施例1中步骤S13 ；本空白对照实例3的脑肿瘤干细胞分离方法共选取5个样本进行分离，并均经上述步骤S13测量，本空白对照实例3的脑肿瘤干细胞分离方法所获得的脑肿瘤干细胞纯度参见下述表1中数值。
表权利要求
1.一种脑肿瘤干细胞分离方法，包括如下步骤获取原代脑肿瘤细胞；原代脑肿瘤细胞的消化传代将所述脑肿瘤细胞接种至第一无血清干细胞培养基中， 再加入蛋白酶体抑制剂MG-132进行培养后，用第一无血清干细胞培养基进行换液，然后加入多烯紫杉醇和阿霉素进行二次培养，获得原代脑肿瘤球细胞；蛋白酶体抑制剂MG-132在第一无血清干细胞培养基中的含量为10 25ymol/L ；原代脑肿瘤球细胞的收集传代将所述原代脑肿瘤球细胞洗涤收集，再接种至第二无血清干细胞培养基中进行培养传代，获得所述的脑肿瘤干细胞；其中，所述第二无血清干细胞培养基中含有重组白血病抑制因子ESGR0。
2.根据权利要求1所述的脑肿瘤干细胞分离方法，其特征在于在所述原代脑肿瘤细胞的消化传代的步骤中，加入所述多烯紫杉醇在第一无血清干细胞培养基中的含量为5 15 μ mol/L,阿霉素在第一无血清干细胞培养基中的含量为0. 5 2 μ mol/L。
3.根据权利要求1所述的脑肿瘤干细胞分离方法，其特征在于所述第一无血清干细胞培养基包含如下配方组份DMEM/F12 培养基93 ~ 98.5 ν/ν %Β27 添力口剂1 ~ 5 ν/ν %胰岛素2~6U/L人重组表皮生长因子10~30ng/ml人重组碱性成纤维细胞生长因子5 ~ 15 ng/ml抗生素 P/S/G0.5 ~ 2 ν/ν %
4.根据权利要求1至3任一所述的脑肿瘤干细胞分离方法，其特征在于在所述原代脑肿瘤细胞的消化传代的步骤中，所述脑肿瘤细胞的接种密度为1X IO5 3Χ IO5个细胞/ ml ；所述加入蛋白酶体抑制剂MG-132进行培养和加入多烯紫杉醇和阿霉素进行二次培养是在(X)2体积百分含量为4 6%，温度为36 38°C的条件下保温培养6 10小时。
5.根据权利要求1所述的脑肿瘤干细胞分离方法，其特征在于所述重组白血病抑制因子ESGRO在第二无血清干细胞培养基中的含量为800 1200U/ml。
6.根据权利要求5所述的脑肿瘤干细胞分离方法，其特征在于所述第二无血清干细胞培养基还包含如下配方组份DMEM/F12 培养基93 ~ 98.5 v/v %B27 添加剂l~5v/v%胰岛素2~6U/L人重组表皮生长因子10~30ng/ml人重组碱性成纤维细胞生长因子5 ~ 15ng/ml抗生素 P/S/G0.5 ~ 2 v/v %。
7.根据权利要求1所述的脑肿瘤干細胞分离方法，其特征在于在所述原代脑肿瘤球 細胞的收集传代的步骤中，所述原代脑肿瘤球細胞的接种密度为1 X IO5 3X IO5个细胞/ ml ；所述培养传代是在(X)2体积百分含量为4 6%，温度为36 38°C的条件下保温培养 6 10小时。
8.根据权利要求1所述的脑肿瘤干細胞分离方法，其特征在于获取原代脑肿瘤細胞 的方法为取Icm3 2cm3脑肿瘤组织，在无血清的RPMI-1640培养液中清洗，去血管，剪碎 后置于胶原酶溶液中，在36 38°C处理0. 5 15小时后，反复吹打胶原酶处理后的溶液， 并经滤网过滤，制成单细胞悬液，然后将所述单細胞悬液离心，获得所述原代脑肿瘤单细 胞，然后将所述原代脑肿瘤单细胞接种至含血清肿瘤細胞培养基进行培养。
9.根据权利要求8所述的脑肿瘤干細胞分离方法，其特征在于含血清肿瘤细胞培养 基包含如下体积百分比的配方组份DMEM培养基83 94. 5 %胎牛血清 5 15%抗生素P/S/G 0. 5 2%。
10.根据权利要求1所述的脑肿瘤干細胞分离方法，其特征在于在原代脑肿瘤球細胞 的收集传代步骤之后，还包含測定抗原分子CD133阳性的脑肿瘤干細胞含量的步骤。
全文摘要
本发明提供了一种脑肿瘤干细胞分离方法，包括的步骤有获取原代脑肿瘤细胞；原代脑肿瘤细胞的消化传代将所述脑肿瘤细胞接种至第一无血清干细胞培养基中，再加入MG-132进行培养后，用第一无血清干细胞培养基进行换液，然后加入多烯紫杉醇和阿霉素进行二次培养，获得原代脑肿瘤球细胞；MG-132在第一无血清干细胞培养基中的含量为10～25μmol/L；原代脑肿瘤球细胞的收集传代将所述原代脑肿瘤球细胞洗涤收集，再接种至第二无血清干细胞培养基中进行培养传代，获得所述的脑肿瘤干细胞；其中，所述第二无血清干细胞培养基中含有ESGRO。该方法能抑制脑肿瘤干细胞的分化并促进其增殖分裂，获得大量高纯度脑肿瘤干细胞。
文档编号C12N5/095GK102286430SQ20111026921
公开日2011年12月21日 申请日期2011年9月13日 优先权日2011年9月13日
发明者刘韬 申请人:刘韬, 深圳市博泰生物医学科技发展有限公司