专利名称：抗结核分枝杆菌单克隆抗体及其识别的抗原表位和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及单克隆抗体，尤其涉及一种抗结核分枝杆菌CsdA单克隆抗体以及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，本发明还涉及与该单克隆抗体特异性结合的一个表位多肽以及它们的用途，本发明属于抗结核分枝杆菌CsdA单克隆抗体领域。
背景技术：
结核病是严重危害人类健康的重要传染病，对公共卫生安全造成了极大的威胁。 中国是结核病的高发国家，结核病人数居世界第二并有上升趋势，结核病的防控不容乐观。 全球耐药结核病的发生率上升和广泛传播给结核病控制工作带来了严重威胁，为了寻找新的作用靶点，尤其是一些功能特殊的蛋白质(冷休克蛋白)是开发新药物的重要途径。冷休克蛋白(Cold shock protein, CSP)是广泛存在于革兰氏阳性菌和阴性菌中的应激蛋白，在保护机体和帮助细胞适应低温环境方面起着重要的作用。CSP是RNA分子伴侶，其与细胞中的mRNA结合，稳定mRNA，调节蛋白质的表达。在某些病原菌中，CSPs对于其致病、传播以及应对宿主免疫系统等起着重要的作用。有研究表明，CSP与生物被膜的形成有关，生物被膜对于许多致病菌(如铜绿假单胞菌等)的致病有着重要的作用，还发现冷休克蛋白是细菌低温存活的关键蛋白，因而深入研究结核分枝杆菌冷休克蛋白的功能，能为抑制结核分枝杆菌生长提供新思路，并探索其与结核分枝杆菌致病和免疫方面的关系，可以便于寻找特异菌体抗原的靶向药物从而实现结核病的预防与治疗。Dead-box蛋白家族属于冷休克蛋白家族中的一类蛋白，CsdA (cold-shock DEAD-box protein Α)属于Dead-box蛋白家族非常重要的一个蛋白，常温下表达量极低，而在低温时会大量表达，具有RNA酶解旋活性，是核糖体结合蛋白，其功能与细胞分裂增殖有关。目前，最常用的方法是应用基因敲除或者RNA干扰技术研究CsdA蛋白在结核分枝杆菌内的作用机理，那么能否成功敲除CsdA基因或者RNAi成功，需要抗结核分枝杆菌CsdA单克隆抗体进行验证，迄今为止，尚缺乏一种抗结核分枝杆菌CsdA的单克隆抗体。因此，制备抗CsdA单克隆抗体对于研究结核分枝杆菌的低温存活机制具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的之一是提供一株分泌抗结核分枝杆菌CsdA的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本发明的目的之二是提供一种抗结核分枝杆菌CsdA的单克隆抗体以及与该单克隆抗体特异性结合的一个表位多肽。本发明目的之三是提供所述单克隆抗体以及与该单克隆抗体特异性结合CsdA的表位多肽的用途。本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的一株稳定分泌抗结核分枝杆菌CsdA的单克隆抗体的杂交瘤细胞株(A3GQ，其微生物保藏号是=CGMCC No. 5077 ；保藏时间为2011年7月22日；其分类命名是杂交瘤细胞株；保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。所述杂交瘤细胞株通过以下途径制备得到用CsdA-his融合蛋白免疫BALB/c小鼠，取免疫的小鼠脾脏细胞和小鼠骨髓瘤SP2/0细胞经融合、筛选、克隆、传代和反复冻存、 复苏后获得小鼠杂交瘤细胞系，最终筛选出一株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株 A3G5。本发明进一步从杂交瘤细胞上清液中或从注射杂交瘤细胞的动物腹水中，获得结核分枝杆菌CsdA的单克隆抗体。所述CsdA-his融合蛋白由以下方法获得将含有结核分枝杆菌CsdA核苷酸序列的pEI^8a-CsdA质粒载体转化大肠杆菌，IPTG诱导下获得低尿素浓度可溶的CsdA-his融合蛋白，对CsdA-his融合蛋白进行纯化，得到所述的CsdA-his融合蛋白。本发明所述的 IPTG(Isopropyl-β -d-thiogalactopyranoside，异丙基-β -Dii 代半乳糖苷)可以诱导蛋白表达，能对乳糖操纵子产生极强的诱导效应，是强诱导物。具体的，所述单克隆抗体由如下方法制备得到(1)免疫原的准备将pET-^a-CsdA载体转化DE3大肠杆菌，在IPTG诱导下，分子量约64ku的CsdA以低尿素浓度可溶的形式存在。在本发明的一个优选实验方案中，以低尿素浓度、加入去垢剂和咪唑梯度洗脱对融合蛋白进行了纯化，并以纯化过的蛋白作为抗原免疫小鼠；(2)动物免疫用上述纯化过的CsdA融合蛋白免疫BALB/c小鼠。每只小鼠以 IOOug的量进行背部皮下注射，每两周一次共三次，第四次加强免疫一次，3天后待融合，获得免疫小鼠。(3)杂交瘤细胞系的建立取免疫小鼠的脾脏细胞作为能够产生抗体的浆细胞， 与同系动物的骨髓瘤细胞(SP2/0)以聚乙二醇(PEG3500)介导进行融合。融合后细胞经 HAT培养基选择性培养，以间接酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选阳性克隆。用有限稀释法对阳性孔的杂交瘤细胞进行克隆化培养直至克隆化细胞抗体阳性率为100%。将杂交瘤细胞经体外连续传代和反复冻存、复苏，直到细胞系能稳定分泌单克隆抗体。(4)单克隆抗体的制备与纯化将建系的杂交瘤细胞注射到经石蜡油预处理的小鼠腹腔，诱生腹水。诱生的腹水用亲和层析法获得纯化的单克隆抗体。单克隆抗体的反应特异性试验结果表明，本发明所制备的单克隆抗体是针对结核分枝杆菌CsdA的特异性的抗体，对结核分支杆菌CsdA具有反应特异性。经鉴定，该单克隆抗体Ig亚类为IgGl，轻链属于κ型，命名为A3G5。本发明还涉及所述的单克隆抗体针对结核分枝杆菌CsdA的特异性肽段的筛选。 本发明利用12肽库的噬菌体展示技术，利用间接酶联免疫吸附试验(elisa)对单克隆抗体的表位进行3轮淘选，进行滴度测定、阳性噬菌体克隆测序和竞争抑制试验，最终证明所述单克隆抗体对seq id no. 1所示核苷酸序列的第1327-1353位核苷酸编码的多肽具有特异性，所述多肽的氨基酸序列为cp印=Apdpplsrr(seq id no. 2)。总之，本发明提供了一种抗结核分枝杆菌CsdA单克隆抗体及产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，本发明还提供了与所述单克隆抗体特异性结合CsdA的一个表位多肽，为进一步明确CsdA在结核分枝杆菌的作用机理提供了基础，进而能为抑制结核分枝杆菌生长提供新思路，并探索其与结核分枝杆菌致病和免疫方面的关系，可以便于寻找特异菌体抗原的靶向药物从而实现结核病的预防与治疗。
图 1 为 CsdA-his 融合蛋白诱导表达的 SDS-PAGE(PolyAcrylamide Gel Electrophoresis，聚丙烯酰胺凝胶)；1为空载体对照；2为未加IPTG诱导对照；3为重悬液超声沉淀；4为重悬液超声的上清。图2为纯化后CsdA-his融合蛋白的SDS-PAGE ； 1-4为纯化的CsdA-his融合蛋白。图3为抗结核分枝杆菌CsdA单抗纯化后SDS-PAGE ； 1为纯化的单克隆抗体。图4为A3G5单克隆抗体经ELISA方法进行亚型鉴定。图5为免疫印迹杂交检测A3G5单克隆抗体特异性的结果；1为诱导重组菌；2为诱导空质粒菌。图6噬菌体克隆ELISA检测。图7阳性克隆测序分析。图8合成肽的竞争抑制试验。图9噬菌体克隆的竞争抑制试验。图10不同噬菌体克隆免疫小鼠血清与Cp印肽的反应试验。图11不同噬菌体克隆免疫小鼠血清与Cp印肽的反应试验。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例ICsdA原核表达载体的构建以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板，采用PCR方法扩增出1690bp的 csdA(cold-shock Dead-box protein Α)基因，经限制性酶(BamH I 和 Sal I)切后， 与pET28a载体连接，转化到大肠杆菌BL21中，并经酶切和PCR鉴定后获得重组质粒 pET28a-csdA。实施例2CsdA-his融合蛋白的表达与纯化1、重组蛋白的诱导挑取含有pEDSa-CsdA质粒的单克隆菌落，接种于5ml含有卡那青霉素的LB培养基，37°C 220rpm振荡过夜。次日，以1 100稀释到含卡那青霉素的500ml LB培养基中， 37°C培养至0D600约为0. 6，加入IPTG使其浓度为0. 2mM转至16°C诱导20小时，离心收集沉淀。2、重组蛋白的纯化1)用 12mL 重悬液(20mM Tis, 150mM NaCl)将沉淀悬起，超声 30 分钟，再 12000rpm 离心20分钟，收集沉淀；2)用 12mL 溶解液(20mM Tris, 150mM NaCl，2M 尿素 0. 5% NP40)重悬沉淀并超声 30分钟，超清;
3)将树脂混勻并取出2mL放入小瓶中，静止沉淀后弃去乙醇。再用适量水洗树脂。 再加入6mL溶解液(20mM Tris, 150mM NaCl，2M尿素，0. 5% NP4tl)悬起树脂，重力沉降后排出上清；4)将超声后液体12，OOOrpm离心20min，上清与上述3)中树脂结合；5)低温结合振荡混勻30min，结合完毕后开始上柱；6)反复挂柱3次；7)用 30mL 洗杂液 1 (20mM Tris 150mM Nacl 2M 尿素 0. 5% NP40 20mM 咪唑 pH = 8. 0)清洗柱子，收集排出的液体，每次清洗均需彻底悬浮树脂，通过重力使其沉降；8)用 30mL 洗杂液 2 (20mM Tris 300mM Nacl 2M 尿素 0. 5% NP40 20mM 咪唑 pH = 8. 0)清洗柱子，收集排出的液体；9)用 30mL 洗杂液 3 (20mM Tris 150mM Nacl 3M 尿素 0. 5% NP40 20mM 咪唑 pH = 8. 0)清洗柱子，收集排出的液体；10)用 30mL 洗杂液 4 QOmM Tris 150mM Nacl 3M 尿素 0. 5% NP4tl 20mM 咪唑 pH = 8. 0)清洗柱子，收集排出的液体；11)用 5mL 洗脱液(20mM Tris 150mM Nacl 3M 尿素 0. 5% NP40 500mM 咪唑 pH = 8. 0)洗掉树脂结合的蛋白；12)并以Iml每管分装洗脱下的蛋白，并用分光光度计进行蛋白定量；13)用IOOml的纯水过柱清洗；14)用20%乙醇过柱，并将其4°C保存。实施例3抗血清的制备将纯化的CsdA-his融合蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合并乳化后，皮下多点免疫6-8周龄雌性BALB/c小鼠，注射剂量为100μ g/只；共免疫三次，后两次用等体积的弗氏不完全佐剂，免疫剂量也为IOOyg/只。第三次免疫后7天，尾部静脉采血，分离血清作为阳性血清，并用不加佐剂的蛋白腹腔注射进行加强免疫，剂量也为IOOyg/只。实施例4单克隆抗体的制备1、饲养细胞铺板在融合前一天，取一只无免疫的BALB/c小鼠，脱颈处死，并将其完全浸泡于75% 的酒精中约5min。用剪刀小心剪开腹部皮肤，但不要剪开腹膜。酒精棉球对腹膜进行消毒， 20ml的注射器吸取5ml HAT筛选培养基，小心推入小鼠腹腔，取饲养细胞，然后注入到培养皿中。再加入约36ml完全培养基混勻，用排枪加入四块96孔培养板中，ΙΟΟμΙ/孔。观察生长，防治污染。2、免疫后的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合无菌条件下取出加强免疫的BALB/c小鼠脾脏，在基础培养液中洗掉结缔组织。再将脾脏移入另一盛有基础培养基中进行二次清洗，然后过100目钢丝网，将其捣碎，将悬液转入离心管中，IOOOrpm离心lOmin，用基础培养液悬起脾细胞，进行计数。收集生长状态良好并处于对数生长期的SP2/0细胞，进行计数。按比例为1 10的脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合，转速IOOOrpm进行7-lOmin的离心。轻轻震动离心管，使细胞轻微的悬浮起来，便于融合剂的渗入细胞之间。将离心管放入37°C水中，加入lmlPEG1450，不能过快，并边滴边摇晃离心管。静止lmin，然后按着lmL/min、3mL/min，6mL/min速度分步滴加培养基，最后再慢慢滴加到45mL，起到彻底终止作用。IOOOrpm离心lOmin，吸尽上清，用37°C预热准备好的含有20%胎牛儿血清的HAT选择培养基，轻轻悬起沉淀细胞，并定容到40mL，然后转移到高压过的平皿中，按每孔100 μ L的量加入96孔细胞培养板中，放入细胞培养箱进行培养。HT培养基的配制方法将100倍浓缩的HT液体(Iml)放入含有20%胎牛儿血清的DMEM99ml液体培养基中。HAT培养基的配制方法将100倍浓缩的HAT液体(Iml)放入含有20%胎牛儿血清的DMEM99ml液体培养基中。3杂交瘤细胞的筛选用显微镜观察融合后细胞的生长情况及时用固体NaOH颗粒清除污染的细胞。每3 天更换培养基一次，所用培养基根据换液时间而有所不同，在融合后的第3、6天用HAT培养基进行半换液，第9天改用HT培养基进行半换液，第12天用HT培养基进行全换液。当在 15天时融合的细胞形成小集落，大约达到板底面积的1/4时，取上清100 μ 1用于抗体水平的检测。利用间接ELISA方法，对细胞分泌抗体的水平进行检测。用移液器小心吹打阳性孔，使细胞混勻悬浮。然后取100 μ 1放入2mL的DMEM的基础培养液中，充分混勻，进行计数。取约100个细胞的混合液，放入IOmlHT培养液中，并用100 μ 1的排枪吸到铺有饲养层细胞的96孔板中。经常观察细胞生长状态，培养液变黄进行换液，测ELISA值，筛选阳性单一杂交瘤细胞群。再用相同方法进行阳性杂交瘤细胞的克隆，最终筛选到一株能够稳定分泌抗结核分枝杆菌CsdA的单克隆抗体的杂交瘤细胞株(A3GQ，其微生物保藏号是CGMCC No.5077。实施例5单克隆抗体的腹水的制备及纯化取8-10周龄的BALB/c小鼠腹腔注射液体石蜡0. 5mL/只，一周后接种生长状态良好的单克隆杂交瘤细胞(A3G5)，大约0. 5X IO6个细胞，待一周左右，小鼠腹部会膨大影响其生理功能，抽取腹水，一只小鼠大约能抽5mL，离心取上清，分装到1. 5ml的干净的离心管里，-20°C备用。用饱和硫酸铵沉淀法将腹水进行初步提纯，之后用ftOtein A亲和层析法将其进一步纯化，结核分枝杆菌CsdA单克隆抗体纯化后的SDS-PAGE图见图2。该图显示了单克隆抗体的轻链和重链的电泳图，单抗的纯度很高。实验例1抗结核分枝杆菌CsdA单克隆抗体A3G5效价及亚型鉴定用间接ELISA方法，检测纯化后单克隆抗体的效价为10万以上(表1)。采用 Southern Biotech抗体亚类试剂盒对获得的单抗A3G5进行单抗亚类进行鉴定，结果表明 单克隆抗体A3G5重链为IgGl，轻链是κ链，见图4。表1为纯化后的A3G5单克隆抗体ELISA方法检测效价结果
稀释度1:20001:40001:80001:16000 1_: 32000 1_: 64000 1: 1280001:256000A3G5 OD 值2. 462. 2121. 9211. 619 1331 1—.101 0.6760. 382实验例2单克隆抗体的反应特异性诱导重组菌和空质粒菌，进行SDS-PAGE，半湿转到NC膜上，分别用阳性杂交瘤细胞上清作为一抗进行western-blot分析，见图5，说明该单克隆抗体是针对结核分枝杆菌 CsdA的特异性的抗体。
实验例3阳性噬菌体的富集分析利用噬菌体展示随机12肽库Ph. D-12 按照说明书上所述的淘选方法，通过3轮噬菌体淘选，按照公式回收率(％)=(洗脱的噬菌体数/筛选加入的噬菌体数)X100%， 计算出3轮试验的回收率。经过3轮淘选，第三轮的噬菌体的回收率OX10—2)为第一轮回收率(3.0X10_5)的670倍。可见，经过淘选后，噬菌体得到显著的富集，见表2。表权利要求
1.一株分泌抗结核分枝杆菌CsdA的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，其微生物保藏号是CGMCC No. 5077。
2.由权利要求1所述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。
3.权利要求2所述的单克隆抗体在定位结核分枝杆菌中的应用。
4.权利要求2所述单克隆抗体在制备检测或诊断结核分枝杆菌CsdA试剂或药物中的用途。
5.与权利要求2所述单克隆抗体特异性结合的一个表位多肽，其特征在于其氨基酸序列为SEQ ID No. 2所示。
6.权利要求5所述的表位多肽用于CsdA蛋白功能研究中的用途。
7.权利要求5所述的表位多肽在制备免疫干预治疗结核病药物中的用途。
全文摘要
本发明公开了抗结核分枝杆菌单克隆抗体及其所识别的抗原表位和用途。本发明提供了一株稳定分泌抗结核分枝杆菌CsdA的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其微生物保藏号是CGMCCNo.5077。本发明进一步提供了由该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，该单克隆抗体对结核分支杆菌CsdA具有反应特异性，是针对结核分枝杆菌CsdA的特异性的抗体。本发明还提供了与所述单克隆抗体特异性结合的一个表位多肽，为进一步明确CsdA在结核分枝杆菌的作用机理提供了基础，进而能为抑制结核分枝杆菌生长提供新思路，便于寻找特异菌体抗原的靶向药物从而实现结核病的预防与治疗。
文档编号C12N5/20GK102399751SQ20111026916
公开日2012年4月4日 申请日期2011年9月13日 优先权日2011年9月13日
发明者于申业, 于秀婷, 刘思国, 刘慧芳, 司微, 朱婷, 王华南, 王秀梅 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所