一种与KEAP1结合并调节NRF2蛋白稳定性的蛋白多肽的制作方法

本发明涉及生物医学领域，具体地说，是一种与keap1结合并调节nrf2蛋白稳定性的蛋白多肽，蛋白多肽竞争性结合keap1，使细胞抗氧化调控关键蛋白nrf2泛素化降解减少，从而增强肿瘤抗氧化能力。

背景技术：

rmp(rnapolymeraseiisubunit5-mediatingprotein，rmp亦被称作uri，unconventionalprefoldinrpb5interactor)最早是在1998年由日本研究者寻找hbx转录调节相关蛋白过程中发现：rna聚合酶ⅱ第五亚基(rnapolymeraseiisubunit5，rpb5)与hbx直接结合，同时两者通过各自的结合位点与tfⅱb结合，此三者形成的复合体促进hbx的转录；而他们发现rmp在hbx含量较低情况下，竞争性结合rbp5，覆盖后者蛋白结构中与hbx和tfⅱb结合位点，从而抑制hbx的转录。2011年，瑞士科学家报道uri作为癌基因在卵巢癌中发挥促肿瘤作用：uri与pp1γ结合形成复合体并抑制其磷酸酶活性，从而破坏了后者与s6k1-bad组成的负反馈通路，bad磷酸化增加，细胞凋亡减少，存活增加(j.p.theurillat，s.c.metzler，n.henzi，etal.uriisanoncogeneamplifiedinovariancancercellsandisrequiredfortheirsurvival[j].cancercell,2011,19(3):317-32.)。随后，更多的研究发现rmp在前列腺癌、多发性骨髓瘤、子宫内膜癌等各类恶性肿瘤中发挥促肿瘤作用。此外，也有报道发现rmp能易化p65与il-6启动子区结合，促进其转录，使肝癌细胞分泌更多il-6，通过il-6/stat3信号通路，促进肝癌转移和自我更新。

ros(reactiveoxygenspecies)对于肿瘤发生发展具有重要作用。细胞内过多ros造成关键基因突变促进细胞增殖和肿瘤发生。肿瘤在生长过程中，需要应对各种内外环境因素变化。其中ros大量产生和释放，会引起细胞内氧化还原平衡状态打破，导致一系列诸如dna损伤、细胞膜结构破坏、细胞器破坏等现象，最终导致细胞凋亡的发生。因此，探索肿瘤发生发展过程中细胞抗氧化调控机制，具有非常重要的意义。

keap1-nrf2-are信号通路是在细胞抗氧化过程中起重要作用。keap1(kelch-likeech-associatedprotein1)在细胞质中与肌动蛋白锚定，同时能够通过kelch区域与nrf2结合。keap1为e3泛素连接酶cul3提供支架，而后者能够通过泛素-蛋白酶体介导nrf2降解。正常情况下，通过上述机制，nrf2仅维持较低水平，以保证日常生命活动。氧化应激时，上游相关刺激介导nrf2降解终止并蓄积，最终进入细胞核。入核的nrf2与抗氧化反应元件(antioxidantresponseelement(are))结合，促进抗氧化相关基因的转录，参与细胞抗氧化相关的各项生理活动中。(johnp.fruehauf，frankl.meyskens,jr.reactiveoxygenspecies:abreathoflifeordeath？[j].clinicalcancerresearch,2007,13(3):789-794.)

针对性的干预抗氧化相关通路中重要分子，对于肿瘤发生和发展均具有重要作用，亦对于肿瘤治疗提供个性化药物指导。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种rmp蛋白分子中一段能够竞争性结合keap1，稳定nrf2蛋白，提高细胞抗氧化能力的蛋白多肽rmp-d2。本发明还提供上述蛋白多肽rmp-d2的编码基因、含有上述编码基因的重组载体、重组菌、重组细胞或表达盒，及其在在制备调节肿瘤抗氧化能力的药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明的第一方面，提供一种rmp-d2多肽，其氨基酸序列如(i)或(ii)所示：

(i)如seqidno.1所示的氨基酸序列；

(ii)如seqidno.1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列。

rmp蛋白既往研究主要认为其通过与pp1γ结合形成复合体并抑制其磷酸酶活性，从而破坏了后者与s6k1-bad组成的负反馈通路，bad磷酸化增加，细胞凋亡减少，存活增加。该机制被用于解释rmp促进多种肿瘤进展的原因。但是本发明人在长期的研究过程中首次发现rmp蛋白通过其蛋白分子164-288氨基酸之间含有e**e结构域的区域竞争性结合keap1蛋白分子中nrf2结合位点，增强nrf2蛋白稳定性，进而调控细胞抗氧化能力。该rmp蛋白分子164-288氨基酸组成的肽段氨基酸序列及核苷酸序列如seqidno.1所示。需要说明的是，将seqidno.1所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且具有细胞抗氧化能力的衍生序列，也属于本发明的保护范围。

本发明的第二方面，提供一种如上所述的rmp-d2多肽的编码基因，其核苷酸序列如(i)或(ii)所示：

(i)如seqidno.2所示的核苷酸序列；

(ii)如seqidno.2所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列。

将上述核苷酸序列经过一个或几个碱基的置换和/或缺失和/或插入、且编码出的肽段具有同上述氨基酸序列的肽段相同抗氧化能力的衍生序列，也属于本发明的保护范围。

本发明的第三方面，提供一种重组载体、重组菌、重组细胞或表达盒，其含有如上所述的rmp-d2多肽的编码基因。

进一步的，所述的重组载体为慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺病毒载体中的一种。

进一步的，所述的重组载体在所述的多肽的编码基因的上游或下游含有促进所述的编码基因表达的增强子(通常指组成型专一性增强子如cmv、sv40、pgk增强子等)。

本发明的第四方面，提供一种如上所述的rmp-d2多肽在制备调控细胞抗氧化能力药物中的应用。

进一步的，所述的rmp-d2多肽，能够竞争性结合keap1，从而减少nrf2降解，增强nrf2蛋白稳定性，提高细胞抗氧化能力。

本发明还提供一种如上所述的rmp-d2多肽在制备竞争性结合keap1，减少nrf2降解，增强nrf2蛋白稳定性，提高细胞抗氧化能力药物中的应用。

本发明的第五方面，提供一种如上所述的rmp-d2多肽的编码基因在制备调控细胞抗氧化能力药物中的应用。

本发明的第六方面，提供一种如上所述的重组载体、重组菌、重组细胞或表达盒在制备调控细胞抗氧化能力药物中的应用。

本发明的第七方面，提供一种如上所述的rmp-d2多肽、编码基因、重组载体、重组菌、重组细胞或表达盒在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的第八方面，提供一种如上所述的rmp-d2多肽、编码基因、重组载体、重组菌、重组细胞或表达盒在制备辅助缓解肿瘤细胞对其他化疗药物耐药性的药物中的应用。

进一步的，所述的肿瘤为原发于肝脏的各种类型肿瘤，特别是各种类型胆管癌。

本发明的第九方面，提供一种调控细胞抗氧化能力的药物，所述的药物包含如上所述的rmp-d2多肽、编码基因、重组载体、重组菌、重组细胞或表达盒。进一步的，所述的药物还包含药学上可以接受的辅料。

本发明的第十方面，提供一种抗肿瘤药物，所述的药物包含如上所述的rmp-d2多肽、编码基因、重组载体、重组菌、重组细胞或表达盒。进一步的，所述的药物还包含药学上可以接受的辅料。

本发明优点在于：

本发明提供的多肽即rmp-d2多肽，能够竞争性结合keap1，从而减少nrf2降解，增强nrf2蛋白稳定性，提高细胞抗氧化能力。它可以作为调控细胞抗氧化能力的靶点，可应用于制备抗肿瘤药物或者辅助缓解肿瘤细胞对其他化疗药物耐药性。

氧化应激调控在肿瘤发生发展过程中具有重要作用，nrf2作为细胞抗氧化关键分子，影响nrf2表达和蛋白稳定性的因素对于调节细胞氧化应激耐受能力以及化疗药物抵抗性都具有重要作用。本发明在rmp基础上提出一种竞争性结合keap1的蛋白多肽，它通过增强nrf2蛋白稳定性，提高细胞抗氧化能力。本发明对调控细胞抗氧化能力，提供了有用的靶向目标。

附图说明

图1为本发明实施例的keap1蛋白能够分别与rmp蛋白和nrf2蛋白的结合，但是rmp和nrf2蛋白没有相互作用关系。

图2为本发明实施例的rmp蛋白通过其d2区域与keap1结合。

图3为本发明实施例的不同物种rmp蛋白d2区域存在保守的类似于nrf2蛋白分子中keap1结合位点e**e。

图4为本发明实施例的rmp蛋白分子能够与含有kelch重复结构域的keap1截断体质粒相互结合。

图5为本发明实施例的rmp蛋白分子能够与nrf2蛋白分子竞争性结合keap1蛋白。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或者制造商建议的条件进行。

胆管癌细胞系hucct1和hek-293t细胞均购置中科院细胞所。pcdna3.1a-gfp，野生型pcdna3.1a-rmp质粒及相应的截短体质粒均购于上海端砚生物技术公司。keap1截短体质粒由新泽西药剂与牙医大学(theuniversityofmedicineanddentistryofnewjersey,umdnj)夏斌教授提供(也可根据以下文献方法制备得到：j.ma，h.cai，t.wu，etal.palb2interactswithkeap1topromotenrf2nuclearaccumulationandfunction[j].molcellbiol,2012,32(8):1506-1)。其他所用试剂或者仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1：keap1蛋白能够分别与rmp蛋白和nrf2蛋白的结合，但是rmp和nrf2蛋白没有相互作用关系。

取出proteina/g琼脂糖磁珠(mag25k/proteina/g，英芮诚生化科技，p28-002)根据其说明书先进行磁珠预处理：移液器吹打或漩涡振荡器混匀磁珠，取50μl磁珠悬浮液(10％，v/v)至离心管中，1.5ml磁力架磁性分离去除保存液；加入100μlpbs混匀磁珠(颠倒30秒或者旋涡振荡器混匀)，磁性分离去除上清液(重复2次)；再进行抗体结合：用100μlpbst(pbst，ph7.4:pbswith0.02％tween-20)稀释2～20μg抗体样品，稀释后加入到装有磁珠的离心管中；将上述混合物放入摇床或旋转混合仪室温或37℃颠倒混匀或者涡旋混匀10～15分钟；将装有磁珠和抗体的离心管放入磁力架，待磁珠完全贴壁后，去除上清液；用100μlpbst洗涤磁珠-抗体复合物3次。抗原沉淀反应：抗原吸附：向上一步装有磁珠-抗体复合物的离心管中加入制备好的细胞裂解液100～1000μl，用移液枪吹打混匀；37℃颠倒混匀或者低速涡旋混匀15～20分钟，使抗原和结合抗体的磁珠结合；将上一步的离心管和混合物放入磁力架，吸取上清(上清可丢弃也可保存做后续分析)；取200μlpbs洗涤磁珠-抗体-抗原复合物3次；洗涤完成后用100μlpbs重悬磁珠，用于下一步操作。抗原洗脱：将装有磁珠-抗体-抗原复合物的离心管放入磁力架，待磁珠贴壁完全后吸去上清；向上述离心管中加入25μlelutionbuffer(100mmglycine,ph2.8)和5μl5xsds-pageloadingbuffer再用移液器重悬复合物；95～100℃煮沸5～10分钟；将煮沸后的离心管放入磁力架取上清做后续分析。

收集培养于10cm培养皿hucct1细胞，生理盐水清洗后加入1ml细胞裂解液，bca蛋白定量后，将细胞裂解液分成蛋白含量1600ug的两份，再加入适量蛋白裂解液定容至体积为500ul，剩余蛋白制作input组。根据上述免疫共沉淀实验步骤，分别使用rabbitigg和keap1抗体进行孵育。免疫沉淀后产物通过westernblotting实验，使用sds-page分离胶将不同分子量蛋白进行分离，转膜至nc(硝酸纤维素)膜，一抗和二抗孵育后在odysseyclx成像系统(licor)进行分析。图1a所示keap1抗体既能将nrf2又能将rmp蛋白分子从胆管癌hucct1细胞蛋白裂解液中免疫共沉淀。图1b是使用rmp抗体将keap1蛋白分子从胆管癌hucct1细胞蛋白裂解液中免疫共沉淀。图1c是hucct1细胞外转keap1质粒基础上同时转染pcdna3.1agfp，rmp质粒，36小时后给予250μmh2o2处理8小时，外转rmp细胞能够观察到keap1与rmp结合增加，而与nrf2结合减少。

实施例2：rmp蛋白通过其d2区域与keap1结合。

根据既往文献报道rmp蛋白各功能区功能，设计成含有不同结构域的截短体(d.dorjsuren，y.lin，w.wei，etal.rmp,anovelrnapolymeraseiisubunit5-interactingprotein,counteractstransactivationbyhepatitisbvirusxprotein[j].molcellbiol,1998,18(12):7546-55；j.p.theurillat，s.c.metzler，n.henzi，etal.uriisanoncogeneamplifiedinovariancancercellsandisrequiredfortheirsurvival[j].cancercell,2011,19(3):317-32.；stefanburén，anal.gomes，anateijeiro，etal.regulationofogtbyuriinresponsetoglucoseconfersc-myc-dependentsurvivalmechanisms[j].cancercell,2016,30(2):290-307.)。图2a中所示rmp截短体和突变体质粒示意图。上述截短体质粒制备首先是根据蛋白片段分析相应的cdna片段，设计有效引物，以hindiii-apai作为克隆位点，pcdna3.1(+)/myc-his作为载体，将载体与片段连接，选择有效克隆并扩增。鉴定上述质粒表达效果后，使用pei转染试剂将上述各截短体质粒、pcdna3.1(+)/myc-hisgfp和rmp质粒分别与野生keap1质粒一同转染至293t细胞。培养36小时后，收集蛋白，定量，按照实施例1所述步骤进行免疫共沉淀实验。图2b中所示野生型keap1质粒只能与含有d2区域的rmp截短体(d2、d4、d5)蛋白分子相互作用。

实施例3：不同物种rmp蛋白d2区域存在保守的类似于nrf2蛋白分子中keap1结合位点e**e。

大量文献报道keap1与nrf2的结合过程中，存在于nrf2neh2结构域中etge(强结合位点)和dlg(弱结合位点)是重要的keap1结合位点(m.rojodelavega，e.chapman，d.d.zhang.nrf2andthehallmarksofcancer[j].cancercell,2018,34(1):21-43；hannam.leinonen，emiliakansanen，petrietal.roleofthekeap1–nrf2pathwayincancer[j].2014,122:281-320；p.canning，f.j.sorrell，a.n.bullock.structuralbasisofkeap1interactionswithnrf2[j].freeradicbiolmed,2015,88(ptb):101-107.)。通过ncbi查询人rmp蛋白序列，仅d2区域存在有类似于etge序列。又查询小鼠、挪威大鼠、斑马鱼、猩猩、鸡等物种中rmp蛋白序列，将上述序列进行比对分析，如图3所示这些物种的d2区域是相对保守的区域，而且这些蛋白序列中d2区域两个含有类似于nrf2分子中keap1结合位点e**e。图3中rmp蛋白的氨基酸序列如seqidno.3-seqidno.8所示。

实施例4：rmp蛋白分子能够与nrf2蛋白分子竞争性结合keap1蛋白。

hek-293t细胞外转nrf2，keap1质粒同时梯度转染野生型rmp质粒(2μg，6μg，12μg)，转染36小时后，收集蛋白，按照上述实施例1所述进行免疫共沉淀，如图4a、4b所示，通过分析发现，随着rmp表达量增加，竞争性与keap1结合增多，而nrf2结合减少。

实施例5：rmp蛋白分子能够影响nrf2蛋白稳定性。

通过慢病毒体系构建rmp过表达hucct1细胞系，使用蛋白合成抑制剂chx(cycloheximide)按照时间梯度0，15，30，60，120，180min处理对照和过表达细胞。加蛋白裂解液收集蛋白，bca定量，制备上样样品，如图5a、5b所示通过westernblotting实验分析发现rmp过表达抑制nrf2蛋白降解。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

序列表

<110>中国人民解放军第二军医大学

<120>一种与keap1结合并调节nrf2蛋白稳定性的蛋白多肽

<130>/

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>125

<212>prt

<213>人工序列(artificial)

<400>1

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151015

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202530

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115120125

<210>2

<211>375

<212>dna

<213>人工序列(artificial)

<400>2

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agtcagttgaactgt375

<210>3

<211>53

<212>prt

<213>智人(homosapiens)

<400>3

gluleutrpalaargleuglugluleugluargglnglugluleuleu

151015

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202530

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<210>4

<211>51

<212>prt

<213>小鼠(musmusculus)

<400>4

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151015

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50

<210>5

<211>52

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<213>挪威大鼠(rattusnorvegicus)

<400>5

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151015

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50

<210>6

<211>52

<212>prt

<213>斑马鱼(daniorerio)

<400>6

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151015

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50

<210>7

<211>52

<212>prt

<213>黑猩猩(pantroglodytes)

<400>7

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151015

glygluleuaspserlysproaspthrvalilealaasnglygluasp

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50

<210>8

<211>52

<212>prt

<213>鸡(gallusgallus)

<400>8

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151015

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50