棉酚降解酶HIGD及其编码基因和应用的制作方法

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及棉酚降解酶higd及其编码基因和应用。

背景技术：

棉酚(gossypol)又称棉毒素，通常存在于锦葵科棉属植物的根、茎、叶和籽实中，是一种由色素腺体分泌生成的多酚二萘衍生物，相对分子质量为518.54，分子式为c30h30o8，熔点为181-183℃，具有很强的酸性，极易氧化，氧化后颜色加深。棉籽粕中含棉酚0.15％-1.8％，按其存在的形式可以分为游离状态棉酚(freegossypol，fg)和结合状态棉酚(boundgossypol，bg)，fg对动物的毒性伤害很大，它可以引起动物中毒，导致动物机体胃肠炎消化系统及生殖系统等出现病症。bg是游离状态的棉酚，与氨基酸、小肽等分子结合后形成的衍生化合物，其毒副作用小。无论是反刍动物还是非反刍动物，喂食一定量的含棉酚饲料，均会出现中毒现象。游离棉酚易溶于有机溶媒也易溶于油脂，因此在消化道很容易被吸收，而引起中毒，进入消化道刺激胃肠粘膜，导致胃肠道炎症，这是它的肠毒作用，其吸收后对机体各器官系统都有毒副作用，特别是神经系统，可造成神经机能紊乱，出现兴奋、抑制、神经症状，损伤肝细胞。游离棉酚还对生殖系统有严重的损伤，棉酚慢性中毒时，雄性动物表现为授孕率降低，精子的活性降低，精量减少，造成不育；对于雌性动物，则使其卵巢、输卵管萎缩，最终可导致流产。

根据棉酚的脱除方法和性质，棉籽粕的脱毒工艺分为物理法、化学法以及生物降解法等。传统的物理和化学法虽然能部分地降解饲料和饲料原料中的棉酚，但这些方法具有效果不稳定、营养成分损失大、影响饲料适口性和难以规模化生产应用等不可避免的缺点，而且在饲料和饲料原料中添加化学试剂也会将一些不确定的危害因素引入动物生产环节中。因此，棉酚的生物降解法越来越受到重视。棉酚的生物降解法主要是指微生物、植物或其代谢时产生的酶与棉酚发生作用，并使棉酚分子结构中毒性基团被破坏，从而生成无毒代谢产物。由于微生物及其生物酶降解棉酚的方法能够彻底将其去除，同时，该方法的专一性强、对饲料无污染、不会影响饲料的营养价值，因此，该方法在动物饲料和饲料原料中的应用具有广阔的发展前景。

一种应用漆酶降解棉籽蛋白中棉酚的方法(申请号201710374880.2)公开了利用漆酶和氧化辅助物联合，在20～40℃下保持10～30个小时对棉籽蛋白进行棉酚脱毒的方法；发明专利一种应用氧化酶降解棉籽饼粕中棉酚的方法(申请号201310294701.6)公开了将氧化酶水溶液和氧化辅助物喷洒到棉籽饼粕表面，在20～40℃下保持10～30个小时进行棉酚脱毒的方法。因此，现有技术利用生物酶降解棉酚的过程中都需要额外添加辅助化合物。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种棉酚降解酶higd。

本发明的再一目的在于提供编码上述棉酚降解酶higd的基因。

本发明的再一目的在于提供包含棉酚降解酶higd基因的重组表达载体。

本发明的再一目的在于提供包含棉酚降解酶higd基因的重组菌株。

本发明的再一目的在于提供上述棉酚降解酶higd的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述棉酚降解酶higd的应用。

本发明提供棉酚降解酶higd，其氨基酸序列如seqidno.1所示：

mgqvgslvnvlytakavlsqyqtnglspwgtfnaprlppfltnnplphgfpwgkltddknnqytdyprtgvkryyqfnvsrgviapdgyhrdvllvndqfpgplieanwgdtivvdvhnnieelaegtsihwhgflqhntpwedgapgitqcpippgksyryefladlygttwyhahysaqysggivgpivihgptrqkydidlgpvmlsdwyhkeyfdiikemlmpnadprvfsdnnlingkmhfdcsqvqegdttpcttnaglskfmfkrnkvhrlrlinsgadgvqrfsidghsmtviaedfvpvkpyetqvvtlgvgqrtdvlvkanrnpgaywirsnltscssarqpnalavvyyegtdtnatptstawdipdpgtcanqdldkteplypiplkrptleqtlaidmfrnesnitlwkfngvsmrthynkpvlleanagnldfplewnvlnfsgntsvrliiqnngpishpmhlhghnfqllhegpgewdgtivrpsnprrrdaylvrpgghlvvqfdaapgvwavhchvawhasggffatllvepdrvkrwkipskvqqncdlwdvwsqnnhvhqidsgt

其中，该酶包括585个氨基酸，未预测到信号肽序列，蛋白理论分子量为65.7kda。

本发明的编码上述棉酚降解酶higd的基因higd，其编码基因序列如seqidno.2所示：

atgggccaggttggcagcctcgtcaacgtgctgtacacagcaaaggccgtgctatctcagtatcagaccaacggactctcgccctggggcacgtttaatgctcctcgcctgccccccttcctcaccaacaaccccttgcctcacggctttccatggggcaagttgacagacgacaaaaacaaccaatacacggactatccgcgaaccggagtcaaacgatactatcagttcaacgtcagccgtggtgtcatcgctccggacgggtaccacagagatgtgcttctcgtcaacgaccagttcccagggcccttgatcgaggctaactggggtgataccatcgtggttgacgtgcacaacaacatcgaagaactggcagagggaacttccattcactggcacggcttcttgcaacacaataccccgtgggaggacggcgctcctggtatcactcagtgcccgattccgcctgggaagagctaccgctatgaattcctcgctgacttgtacggcactacctggtatcatgcccattactcggcccagtactccgggggcattgtcggtcccatcgtgatccacgggccaacccgacagaaatatgacatcgacctagggccagttatgttgagcgactggtaccacaaagaatacttcgacatcattaaggagatgctcatgccaaacgcggacccgcgcgtcttctcggacaacaacctgatcaatggcaagatgcactttgactgctctcaagtccaagagggcgataccactccatgcaccaccaatgccggcctgtccaagttcatgttcaagcgcaacaaggtccaccgcttgcgcctcatcaactcgggcgccgacggcgtccagcgcttctccatcgatggccacagcatgaccgttatcgccgaggactttgtgcccgtcaagccctacgaaacccaagtcgtgacgctcggcgtgggccagcgcaccgacgtcctcgtcaaggccaaccgcaatccaggcgcgtattggattcgttccaacctcacctcgtgctcgtcggcgcgacagcccaacgcgctcgccgtcgtctactacgaaggcaccgacaccaacgccactcccaccagcacggcctgggacatcccggacccgggcacctgcgcgaatcaggacctggacaaaacggagccgctgtacccgatcccgctcaagaggccgacgcttgagcagaccttggccatcgatatgttcaggaacgaatcgaacattaccttgtggaagttcaacggggtgtcgatgcgcacgcactataacaaacccgtgttgctggaagcgaacgcagggaacttggacttcccattggagtggaacgtgttgaatttttccggaaacacgtctgtcaggctcatcatacagaacaatgggcctatttcccatccgatgcacctccacgggcacaacttccaactgcttcacgaaggtccaggggagtgggacggcaccatcgttcgtccgtccaacccgcgcaggagggatgcgtatctggtccgcccgggaggccacctcgtcgtccagtttgatgctgcacctggcgtttgggccgtccactgccacgtcgcatggcatgcctccggtggcttctttgcgacgctactcgtcgaacccgatcgcgtcaagagatggaagattccttccaaagtccagcaaaactgcgatttgtgggatgtgtggtcgcaaaataaccatgtccatcagattgatagtgggacgtaa

本发明提供包含上述棉酚水解酶基因higd的重组载体，优选为pht43-higd。将本发明的棉酚降解酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的棉酚降解酶基因插入到质粒pht43上的bamhi和smai限制性酶切位点之间，得到重组枯草芽孢杆菌表达质粒pht43-higd。

本发明还提供包含上述棉酚水解酶基因higd的重组菌株，优选所述菌株为枯草芽孢杆菌wb600。

本发明提供一种制备棉酚降解酶higd的方法，包括以下步骤：

1)用包含棉酚降解酶基因higd的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组棉酚降解酶higd表达；

3)回收并纯化所表达的棉酚降解酶higd。

本发明的棉酚降解酶higd为在枯草芽孢杆菌中表达得到。为了测定棉酚降解酶的性质，通过如硫酸铵沉淀，透析、超滤和层析方法纯化棉酚降解酶。

本发明还提供了上述棉酚降解酶higd的应用，包括生物质能源、食品工业和饲料工业等方面的应用。

本发明利用枯草芽孢杆菌高效表达棉酚降解酶higd，经hplc分析可有效降解棉酚，可直接降解棉酚，无需加入氧化辅助物，在适宜的条件下快速地降解棉酚底物。其最适ph为7，最适温度为40℃，在生产实践中具有重要价值。

附图说明

图1显示hplc法测定棉酚降解酶higd酶活的情况；

图2显示棉酚降解酶higd的最适ph和ph稳定性情况；

图3显示棉酚降解酶higd的最适温度和温度稳定性情况。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：枯草芽孢杆菌wb600、表达载体pht43。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶、连接酶。

3、枯草芽孢杆菌培养基lb(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％nacl，ph自然)。

实施例1重组棉酚降解酶higd表达载体的构建及其在枯草芽孢杆菌中的表达

提取特异腐质霉humicolainsolensy1的rna，以提取的rna为模板，在37℃15min，85℃5s条件下反转录，得到cdna。以humicolainsolensy1的cdna为模板，利用特异性引物higd-f、higd-r对higd基因进行扩增。

采用酶切、连接的方法构建游离型枯草芽孢杆菌表达载体pht43-higd。表达载体pht43为游离型穿梭载体，大小约8kb，大肠杆菌中表现为氨苄青霉素抗性，芽孢杆菌中表现为氯霉素抗性，带有芽孢杆菌淀粉酶分泌信号肽，具有芽孢杆菌pgrac强启动子，滚环复制。

设计表达引物higd-f、higd-r，分别含有bamhi和ecorv的酶切位点，扩增片段大小为1.76kb。表达载体用bamhi和smai进行酶切，由于ecorv和smai都是平末端的限制性内切酶，可以有效的进行酶切连接。

higd-f：5＇-cgtaggatccatgggccaggttggcagcctcg-3＇

higd-r：5＇-caggatatcttacgtcccactatcaatctgatggaca-3＇

将连接产物42℃热激转化trans1-t1大肠杆菌感受态细胞，涂布抗性lb平板(含amp100μg/ml)。过夜培养后随机挑取平板上的8个单克隆，进行pcr检测。将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，选取扩增条带在约1.8k处的克隆，测序分析。将测序正确的克隆转接小瓶lb液体培养基(含amp100μg/ml)，37℃、200r/min摇床培养过夜。待菌体长起后，一部分菌液加甘油后-70℃冰箱保存，另一部分菌液提取质粒，即表达载体pht43-higd构建完成。

枯草芽孢杆菌wb600感受态细胞的制备：

lb平板划线活化wb600菌株，37℃培养2d以形成芽孢，将一个单菌落接种小瓶gmⅰ液体培养基(100ml三角瓶，装液量20％)，30℃、150r/min摇床培养过夜。次日以2ml接种量转接小瓶gmⅱ液体培养基(100ml三角瓶，装液量18ml)，37℃、200r/min摇床培养3.5h。再以20ml接种量转接大瓶gmⅱ液体培养基(1l三角瓶，装液量180ml)，37℃、200r/min摇床培养1.5h，室温8000r/min离心5min收集菌体。以10ml离心后的上清液悬浮菌体，分装至1.5ml无菌ep管中(每支约200μl)，置于-70℃冰箱保存。

转化与菌株筛选：

从-70℃冰箱取出枯草芽孢杆菌化学感受态细胞，室温下融化，约200μl感受态细胞加入10μlpht43-higd质粒，37℃水浴中静置30～60min，37℃、200r/min摇床培养2～4h，涂布抗性lb平板(含氯霉素15μg/ml)，37℃培养过夜。待平板长出单克隆后，随机挑取若干个单克隆，进行pcr检测和提取质粒酶切验证。

验证正确后，将重组菌株wb600-pht43-higd，37℃、250rpm培养8小时左右，当od600约为1.0时。将1miptg储液加入到此培养物中，使iptg终浓度达到0.1mm，维持摇床的转速不变，继续诱导8小时。诱导上清液检测棉酚降解酶活性，同时通过蛋白sds-page检测。

实施例2棉酚降解酶higd降解棉酚底物hplc分析

配制0.05m的ph7.0的tris-hcl缓冲液，然后分别加入ph7.0的缓冲液320ul，40ul经过适当稀释的酶液，40ul用dmso溶解的浓度为1000mg/l的分析纯棉酚，共计400ul的反应体系。37℃水浴，反应30分钟后，加入1200ul的dmso终止反应同时浸提反应体系中的剩余棉酚，12000rpm离心10分钟，取上清液经过0.45um的微孔滤膜过滤后，用高效液相(hplc)分析。对照加入煮沸灭活的酶液，其中棉酚标品的终浓度为25ng/ul。另外，棉酚标准品的浓度为50ng/ul。

结果如图1所示，棉酚降解酶higd单独降解棉酚，降解率可达99％。

实施例3棉酚降解酶higd的最适ph及ph稳定性

配制0.05m的不同ph的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，然后分别加入缓冲液320ul，40ul经过适当稀释的酶液，40ul用dmso溶解的浓度为1000mg/l的分析纯棉酚，共计400ul的反应体系。37℃水浴，反应30分钟后，加入800ul的dmso终止反应同时浸提反应体系中的剩余棉酚，12000rpm离心10分钟，取上清液经过0.45um的微孔滤膜过滤后，用高效液相(hplc)分析。对照加入煮沸灭活的酶液。以ph7.0水解率为100％。

结果如图2所示，棉酚降解酶higd的最适ph为7，是一个中性酶。当ph为6～8时，棉酚降解酶higd能保持80％以上的酶活，当ph为3～5时，也存在30％～60％的酶活。

实施例4棉酚降解酶higd的最适温度及温度稳定性

配制0.05m的ph7.0的tris-hcl缓冲液，然后分别加入ph7.0的缓冲液320ul，40ul经过适当稀释的酶液，40ul用dmso溶解的浓度为1000mg/l的分析纯棉酚，共计400ul的反应体系。25、30、35、40、45，50℃水浴，反应30分钟后，加入800ul的dmso终止反应同时浸提反应体系中的剩余棉酚，12000rpm离心10分钟，取上清液经过0.45um的微孔滤膜过滤后，用高效液相(hplc)分析。对照加入煮沸灭活的酶液，以40℃的水解率为100％。

结果如图3所示，棉酚降解酶higd的最适温度为40℃，当温度为35～43℃时，棉酚降解酶higd能保持80％以上的酶活，当温度为25℃时，存在50％以上的酶活，温度为55℃时，也能保持30％的酶活。

序列表

<110>中国农业科学院饲料研究所

<120>棉酚降解酶higd及其编码基因和应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>585

<212>prt

<213>特异腐质霉y1(humicolainsolensy1)

<400>1

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151015

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