玉米Zm-Prx5克隆、克隆方法及表达方法与流程

本发明属于玉米基因克隆技术领域，具体涉及一种玉米zm-prx5克隆、克隆方法及表达方法。

背景技术：

玉米是我国的主要粮食作物，种植面积和总产量仅次于小麦和水稻而居第三位。玉米病害的发生可导致巨大的经济损失，尤其是近年来玉米病害发生日益频繁，病害种类日益增多，严重影响了玉米产业的发展。化学农药的使用在一定程度上提高了对玉米病害的控制作用，但是农药的使用不仅污染了环境，长期使用还会使玉米产生耐药性。因此，在对玉米抗病的研究中，人们致力于寻找既不影响环境又对玉米病害能够有效防治的方法。

prxs家族是一类分子量20到40kda的蛋白，作为一种抗氧化酶广泛存在于各种生物体中。1985年，首次从兔子线粒体中分离得到第一个过氧化物还原酶。根据其在结构上的差异，将其分为6类，分别命名为prx1，prxq，prx6，tpx，ahpe和prx5，而在植物中只发现有prx1，prxq，prx6和prx5四类。近年来，prxs的重要性日趋被人们所关注，有关prxs在植物病害中的研究呈上升趋势。在烟草中过表达一个prxq的同源基因可以提高植物对真菌的抗性，研究发现在杨树亲和性锈病生理小种侵染的时候，prxq呈下调表达的趋势，而在非亲和性生理小种侵染的时候呈现上调表达的趋势。研究发现prx在病害引起的细胞死亡过程中起着负向调控的作用。研究还发现，在氯化铬处理下，prx缺失型拟南芥根的生长发育受到明显影响。但是，上述技术研究的都不是玉米prx家族。为了研究玉米zm-prx5的功能，我们首先需要一种玉米zm-prx5的克隆方法，然而现有技术存在的问题是，缺乏玉米zm-prx5的克隆及表达方法，限制了玉米zm-prx5功能的研究。

技术实现要素：

本发明提供了一种玉米zm-prx5克隆、克隆方法及表达方法，可以有效克隆和表达玉米zm-prx5。

本发明的第一个目的是提供一种玉米zm-prx5的克隆方法，包括以下步骤：

步骤1，提取玉米的总rna备用；

步骤2，将玉米总rna反转录成cdna第一链；

步骤3，基因克隆

合成引物：

zm-prx5f1:5'-aaaaccggttgctattagtac-3'；zm-prx5r1:5'-gaagaaaacaaaatgtctgc-3'；

用步骤2反转录的cdna第一链作为模板进行pcr扩增，pcr扩增体系如下：10×pcrbuffer4μl、10mmdntp1μl、zm-prx5f10.5μl、zm-prx5r10.5μl、cdna模板1.5μl、taq酶0.5μl、灭菌h2o17μl；

pcr结束后琼脂糖凝胶电泳，回收743bp的条带，即获得玉米zm-prx5基因。

本发明的第二个目的是提供一种所述的克隆方法的克隆得到的玉米zm-prx5。

本发明的第三个目的是提供一种所述的玉米zm-prx5的表达方法，包括以下步骤：s1，融合表达载体的构建

s11，合成引物

zm-prx5f2：5'-acccatggatggctcccatcgct-3'；zm-prx5r2：5'-cggcactagtaagcgccttcag-3'；

s12，pcr扩增

以阳性克隆子为模板进行pcr扩增，pcr结束后，1.5％琼脂糖凝胶检测，回收目的dna条带；

s13，融合表达载体重组

回收s12的目的dna条带，并与t载体16℃连接过夜，得到重组质粒pmd-zm-prx5；将重组质粒pmd-zm-prx5和质粒载体pcambia3301分别用ncoi和spei双酶切，1.5％琼脂糖凝胶检测，分别回收750bp左右的pmd-zm-prx5目的片段和线性的质粒载体pcambia3301目的片段；

用dnat4连接酶连接，得到融合表达载体pcambia1304-zm-prx5；

s14，融合表达载体重组

融合表达载体pcambia1304-zm-prx5转化大肠杆菌dh5α感受态细胞；

s2，制备农杆菌感受态细胞

s3，pcambia1304-zm-prx5-gfp质粒转化杆菌农杆菌感受态细胞，得到重组质粒转化菌；

s4，重组质粒转化菌转化植物体，并使zm-prx5在植物体中表达。

与现有技术相比，本发明提供的一种玉米zm-prx5克隆、克隆方法及表达方法至少具有以下有益效果：

本发明提供了一种玉米zm-prx5的克隆及表达方法，可以有效克隆和表达玉米zm-prx5，为玉米zm-prx5功能的研究奠定了基础。本发明还现有了不同处理方式对zm-prx5表达的影响，结果显示：在干旱处理、盐胁迫处理、高温处理和激素处理下，zm-prx5均可表达。

附图说明

图1是本发明玉米总rna和玉米18scdna第一链的电泳图；

图1a是玉米总rna，1、2泳道均是玉米总rna；图1b是玉米18scdna第一链，m泳道为dl2000，1-4泳道均是玉米18scdna第一链；

图2是zm-apxf1、zm-apxr1引物扩增和5个阳性克隆子的检测结果；

图2a是zm-prx5f1、zm-prx5r1引物扩增结果，其中m号泳道是dl2000，1号泳道是扩增产物；图2b是5个阳性克隆子的检测结果，其中m号泳道是dl2000，1-5号泳道是阳性克隆子；

图3是zm-prx5r5、zm-prx5f5引物pcr产物电泳结果和pcambia1304-zm-prx5-gfp质粒的ncoi和spei双酶切检测结果；

图3a是zm-prx5r5、zm-prx5f5引物pcr产物，其中m号泳道是bm5000，1-2号泳道是pcr产物；图3b是pcambia1304-zm-prx5-gfp质粒的ncoi和spei双酶切检测结果，其中m号泳道是dl2000，1-2号泳道是双酶切产物；

图4是zm-prx5亚细胞定位结果；

图4a、图4b、图4c是pcambia1304空载体转化到烟草表皮细胞中，对照组；图4d、图4e、图4f是重组pcambia1304-zm-prx5载体转化到烟草表皮细胞中，实验组；图4a和图4d是明场下的烟草表皮细胞图片；图4b和图4e是共聚焦显微镜下荧光信号图片；图4c是图4a和图4b叠加后的图片；图4f是图4d和图4e叠加后的图片。

具体实施方式

为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。

下面各实施例以及上述发明内容中未注明具体条件的试验方法，均按照本领域的常规方法和条件进行，所用的材料若无特殊说明均为市售。玉米自交系b73为河南农业大学农学院保存。大肠杆菌dh5α购自上海北诺生物科技有限公司，rna提取试剂trizolreagent，反转录试剂盒，琼脂糖凝胶dna回收试剂盒，t载体、pmd18-t载体，taq酶，质粒提取试剂盒，限制性内切酶，t4连接酶，depc水均购自宝生物工程有限公司，测序和引物合成分别在华大和上海生工进行。玉米自交系b73取样方式如下：玉米自交系b73种植后，待四叶一心时取玉米叶片-80℃保存备用。

实施例1本发明提供了一种所述zm-prx5的克隆方法，具体步骤如下：

步骤1，采用rna提取试剂trizolreagent提取玉米自交系b73叶片的总rna，获得玉米总rna备用。用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1a所示，图1a中1、2泳道均包括28s、18s为核糖体的大、小两个亚基，最下面那条条带为5.8s和5s(因为长度差距不大，故5.8s和5s很难在电泳中区分出来)，说明rna完整性良好，可以用作后续试验。

步骤2，提取玉米基因组dna

用植物基因组dna提取试剂盒(天根)提取玉米基因组dna，备用。

步骤3，cdna第一链的合成和检测

(1)cdna第一链的合成

按照反转录试剂盒的说明，将玉米总rna反转录成cdna第一链。

cdna第一链的合成体系为：步骤1的玉米总rna6μl、oligo(dt)1μl、depc水4μl。65℃温浴5min，然后冰上放置2min，再加入如下试剂：rnase抑制剂1μl、m-mlvbuffer4μl、dntp(25nml)3μl、m-mlv反转录酶1μl；其中，oligo(dt)的核苷酸序列如下：5’-d(tttttttttttttttttt)-3’。反转录pcr程序如下：42℃1h，72℃10min，4℃forever；-20℃保存备用。

(2)cdna第一链的检测

设计玉米18s基因引物如下：18sr1：5'-cctgcggcttaattgactc-3'，如seqidno.2所示；18sf1：5'-gttagcaggctgaggtctcg-3'，如seqidno.3所示；目的产物片段174bp。

配置18scdna第一链的pcr检测体系如下：premixtaq12.5μl、18sf11μl、18sr11μl、cdna第一链1μl、ddh2o9.5μl。设置pcr扩增程序如下：95℃预变性5min；95℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸20s，35个循环；72℃延伸10min；4℃forever。pcr结束后取10μl进行2％琼脂糖凝胶电泳检测。18scdna第一链的检测电泳如图1b所示，从图中可以看出18s目的条带清晰，说明反转录的cdna质量良好，可以用作后续试验。

步骤4，zm-prx5的克隆

根据步骤3所得到的zm-prx5基因的cdna第一链全长序列设计引物：

zm-prx5f1:5'-aaaaccggttgctattagtac-3'，如seqidno.4所示；zm-prx5r1:5'-gaagaaaacaaaatgtctgc-3'，如seqidno.5所示；目标片段长度743bp。

用步骤3反转录的cdna第一链作为模板进行pcr扩增，pcr扩增体系如下：10×pcrbuffer4μl、dntp(10mm)1μl、zm-prx5f10.5μl、zm-prx5r10.5μl、cdna模板1.5μl、taq酶0.5μl、灭菌h2o17μl。pcr反应程序如下：95℃预变性5min；95℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min；4℃forever。

pcr结束后样品加入5μlloadingbuffer混匀后进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。zm-prx5f1、zm-prx5r1引物扩增结果如图2a所示，检测得到一条743bp的条带，和目的片段大小一致。目的片段送华大公司进行测序，结果为743bp。

步骤5，zm-prx5基因pcr扩增产物的回收、连接与转化

①无抗性lb液体培养基配方：分别称取tryptone10g、yeastextract5g、nacl10g于三角瓶中；加入800ml蒸馏水，充分搅拌；用naoh将ph调整为ph＝7；加蒸馏水定容至1l；封口，灭菌后4℃保存。②抗性lb液体培养基配方：无抗性lb液体培养基灭菌后按100μl/100ml的浓度加入50mg/ml氨苄霉素，制成氨苄霉素液体抗性培养基；或者按100μl/100ml的浓度加入50mg/ml卡那霉素制成卡那霉素液体抗性培养基。③无抗性lb固体培养基：每升无抗性lb液体培养基中加入15g琼脂。④抗性lb固体培养基配方：lb固体培养基灭菌后按100μl/100ml的浓度加入50mg/ml的氨苄霉素，倒入培养皿中制成氨苄霉素固体抗性培养基；或者按100μl/100ml的浓度加入50mg/ml的卡那霉素，倒入培养皿中制成卡那霉素固体抗性培养基。

(1)zm-prx5基因pcr扩增产物的回收：利用琼脂糖凝胶dna回收试剂盒回收步骤4zm-apxf2/zm-apxr2引物扩增的目的片段，-20℃保存备用。

(2)目的片段的链接反应：连接体系如下：pmd18-t载体1μl、无菌去离子水6μl、步骤5(1)目的片段8μl；16℃反应过夜，得连接产物，备用。

(3)大肠杆菌感受态细胞的制备：按照宝生物公司的感受态制备试剂盒制备大肠杆菌dh5α感受态细胞，液氮速冷后放入-80℃冰箱中保存。

(4)转化：大肠杆菌感受态细胞从-80℃取出冰上融化，将步骤5(2)的连接产物全部加入步骤5(3)大肠杆菌dh5α感受态细胞中，混匀，冰上放置30min后，42℃热击90s，快速移至冰上放置5min，加入1ml无抗性lb液体培养基，37℃、180rpm震荡培养2h，5000rpm/min离心3min，吸出多余的上清液，留100μl将沉淀的菌体混匀，用灭菌后的涂布器将混匀后的菌体均匀的布在所述氨苄霉素固体抗性培养基平板上，封口，倒置，于37℃培养过夜。

第二天从lb固体培养基平板上分别挑取5个单菌落于500μl所述氨苄霉素液体抗性培养基中，分别编号1-5，37℃，180rpm/min震荡培养4h，pcr检测，pcr体系和反应程序同步骤4。5个阳性克隆子的检测结果如图2b所示。挑选2号菌液的pcr扩增产物回收，并连接至pmd18-t载体，阳性克隆送去takara公司进行测序。测序结果经bioxm2.6处理得到zm-prx5的orf序列，其中atg为起始密码子(seqidno.1下划线碱基)，终止子为tag(seqidno.1下划线碱基)，编码区全长486bp，结果如seqidno.1所示。

accaccccacccattcactcgcgtgcgctccctcgccgccccagttccccaccccctgctcacccacccgtcccctcctgctcgcccatggctcccatcgctgtcggcgacgccctccccgacggccagctcgggtggttcgacgagaacgaccagctgcagcaggtctccgtccacgcgctcgccgccggcaagaaggtcatcctcttcggcgtccccggcgccttcaccccgacctgcagcaaccagcatgtgccaggcttcatcacacaggctgagcggctcaaagccaagggtgtagacgagatcctgcttatcagcgttaacgaccccttcgtcatgaaggcgtgggcgaagacctaccccgagaacaagcacgtgaagttcctcgccgacggatctggagcgtacaccaaggcgctcgacctcgagctcgatctcacggacaaagggctgggcgtgcgctcgaagaggttcgctctcctggccgacgacctcacggtcaccgtcgcaaacatcgaggaaggcgggcagttcacgatctccggcgctgaggagatcctgaaggcgctttagaggctccgtctcctctagaagccgcagcaacgatcggtctatagtttgaactcgcctttgaataacttgtcgttgggcaaggtctagttcggtgttgtgtatggaacggtcgtcactgagtcatgcacgatttggtatccgtgttgtttatgttcgccggtttgagt

为了获得zm-prx5的完整dna序列，我们三对引物对步骤2提取的玉米基因组dna进行扩增，三对引物序列分别如下：

prxf1：5’-ccaccccacccattcactc-3’，seqidno.13所示，

prxr1：5’-ccccttaactctcccgtacac-3’，seqidno.14所示；

prxf2：5’-tgtcacgtgcacaacaacta-3’，seqidno.15所示，

prxr2：5’-actcggtcgttctctcagga-3’，seqidno.16所示；

prxf3：5’-gggatccaaacgccctgtaa-3’，seqidno.17所示，

prxr3：5’-ctgctcagcctgtgtgatga-3’，seqidno.18所示；

扩增产物经连接、转化、测序、拼接，获得了3386bp的zm-prx5的dna序列，通过和其cdna序列比对，发现zm-prx5基因dna序列含有3个外显子(seqidno.6下划线部分)和2个内含子(seqidno.6非下滑下部分)，结果如seqidno.6所示。

atggctcccatcgctgtcggcgacgccctccccgacggccagctcgggtggttcgacgagaacgaccagctgcagcaggtctccgtccacgcgctcgccgccggcaagaaggtcatcctcttcggcgtccccggcgccttcaccccgacctgcaggtccctacgccctgtcccctgccccgtctcttcctcccactctctcggagatctccgagccttttggcccctgtgttttgggggagaacggtctcggtcggttcggcgggcggttatatgggctctcttgggattagttccagtccggattcggaatgaatactagtggtttagttttgagcaacagatctacgaggaaaaaattgggcgggggtgggggttgagtttttttagccatgccagctgcgctttctgctgcaagtgggtatccggcagagaagagcaaccatgcttgtgcgctgagaggatcgtgaaatagtctggccttaaattgcagcacaaccggttccacctcctagtcagcgtcatgcgcgttgctggcagtaaggagcggaacctctcaacgttgggtcagcaagaaaaccacggccgtcaagtggagggaggggtctatggacgcaggggcggagccagaattatgttatatgaggggcccagcaaatttatcaaatcctataacgcaccgtttggatcattggaattgaatttcattctaataacgccccgtttggatcactggaattgaattccattctaataatagtaatttaggcatatatcaattaagctaattcacttttatacaaaatatatttgtatactcttattagcaagatgtcctagatatttatgtgctacatttttactatagagtagtagaacgaagagtgtcatgtaagttacagattagaaacaaattctaatcatgcataaaatcatttcctatcctccaccctatgaatttgagataggcttatatctgaattttggaaaatggtggaatgccaaattccaaactaaataagttactttattgagtgaattccaattcctttaaaatgaagggatccaaacgccccgtaatagtaatttagccatataccaattaagctaattcggttttatgcaaaatatgtctgtatactattattagcaagatgtcagagatatttatttgctatatttttactataaaggagtgagttgaagagcgtcctataagttatagagtagaaacaaattctactaataaataaaattatttttcatcttccaccccatgaatttgtgataggcttatatctgaactttagaaactggtggaatgtcaaattccaagctaaataggttactttattaagtgaattcaattcctctaaaataaagggatccaaacgccctgtaaggtacaaaatataataggatatatacacatgtatatactaatttgcgtatatcaataaattattaaaaaaaatacttacaccatataattgtaaattaattaattccaacagagatcaaaataattagcctgtacgatgatcgaccaaattaaaagcttcgattatattatgagtcatagttgtcaattctatatcaatatagatcgatgatcaagtaactttacataaaaactttacataaaatcatctaccattttatttcgtagatgtgctttgataagttttgtagctaaaaggctctctcaatggttgcagttgagattagaagggtgatcattaatcttaataatccgtaaaccatttgatacatggaacttttacacaatttaagatggttttttactaaattggtaagtgatcgtaatgtatttggctctagatggttgtataatcaaggtgaaacatcaaatttgtcacgtgcacaacaactatttggtgacaacattggactgaaattcgtcgattttattattagaaacgaatttgatgcttcaaattttgcaacaaaattttagttggatagagaaatttattttaaccaaagaaacttttatgtttcatagtatgtgtacgggagagttaaggggggccaaggtccctgacccttgtctctatcttcttaatatttatctaaaacgcagtcctcctgcgtttttcgagaaaaaaggcccctgcccccttgctccgcccctgtattgaggcgctattctgaacctctaaactactaatagttagctgctaaaattagctgagtgatttagaacatgtcagctaattgttagttatgcctctcaaatagcatagctattagttgttagctgctccaacccacccaaaaccagctaatgacttattagttgactaacaattaggtgttgtttggttcatatatttgtaacgtaatgggtagccgataactttacatcatgtttttttaagtccaaccataatcagatatcacactagggactaatatcgacatattcaaagtttcaaacttgttaccactggtactcgggtgtgaaccatttccatttacgttacatttcgtgaaccaaacaacaccttagctctagaggcttggaacaggtcttagttcgcccaactgtacatgcaacttgaataaggactgcgattgttgagatctgagccttcaagcagcacccatcccacaaacgatgggaagagaaagtgtcgcgcatgtagaaagatccgcatcttcagtggaaaccacggccccctcccaattaatggattgtgattgtgattgtgtaggcaggtccttcttgattaattgtccctttacagaccagtgtatttttcatgcattgtagctttcctcttgtagctactgaattttatctagtctaactacagcccatgattccagtttatagtgtgaacaaaaggtattatctcttgttttggttatttacggatcatagctagtttgagttagtgcttattactcctctattccaaattgtaagccgttttgggttttctaggtgcatagcaaaggcgcatagatatacattattgtctatacacgcagtaaaaagtaaaaagtatatgtatataaaaaggtcagaacggcataccaattttggaatgaaaagggagtactaacctaaaattgcttagctgctttagttcgagaagctcaatggaaaattgcaaactacttaaaatctaaaaggattagatttgaaggtaaattccactaaccgaagccagtagttttgttgcttcctatatctctgaaatctttctactgttctgtgaaaagctgaagcactcatgctgtctctattccgtgcgtgtcttctatgttcatagcaaccagcatgtgccaggcttcatcacacaggctgagcagctcaaagccaagggtgtagacgagatcctgcttatcagcggtacgtttccagcatatgtttgcctgtctgtcttttttttttttgcttatttcttcatcgtcaaatgtttaaagcttaaaacaaaagcaaaatcctgacctactatcctgttttacacggactgaataccatcagtttgccatgttgcgcgtgtatggcctcctcgaccaaaagcagctagtaggccagccagagccagatcatgacagaacttgtttccgctgtgacatgcagttaacgaccccttcgtcatgaaggcgtgggcgaagacctaccccgagaacaagcacgtgaagttcctcgccgacggatctggagcgtacaccaaggcgctcgacctcgagctcgatctcacggacaaagggctgggcgtgcgctcgaagaggttcgctctcctggccgacgacctcacggtcaccgtcgcaaacatcgaggaaggcgggcagttcacgatctccggcgctgaggagatcctgaaggcgctt

实施例2一种zm-prx5的表达方法，具体包括以下步骤：

s1，融合表达载体的构建

s11，合成引物

根据实施例1中zm-prx5基因的orf序列(seqidno.1)设计过表达载体引物，如下：zm-prx5f2：如seqidno.7所示；zm-prx5r2：如seqidno.8所示。zm-prx5f2引物中ccatgg为ncoi酶切位点，为保护碱基。zm-prx5如引物中下划线actagt的是spei的酶切位点，为保护碱基。

s12，pcr扩增

以实施例1步骤5(4)阳性克隆子为模板进行pcr扩增，pcr反应体系如下：阳性克隆子1μl、2×gcbufferi12.5μl、dntp2.0μl、zm-prx5f21.0μl、zm-prx5r21.0μl、la-taq0.3μl、ddh2o7.2μl；总体积25μl。pcr反应程序如下：95℃预变性5min；95℃变性1min，62℃退火1min，72℃延伸40s，35个循环；72℃延伸10min；4℃forever。1.5％琼脂糖凝胶检测，pcr产物电泳结果如图3a所示，扩增出大约为750bp左右的目的条带。

s13，融合表达载体重组

回收s12的目的dna条带，并与t载体16℃连接过夜、转化大肠杆菌感受态细胞、涂lb板(a⁺)、挑斑、pcr检测、测序，测序正确的菌液提取质粒，得到重组质粒pmd-zm-prx5；将重组质粒pmd-zm-prx5和质粒载体pcambia3301分别用ncoi和spei双酶切；酶切体系如下：质粒20μl、kbuffer5μl、ncoi2μl、spei2μl、bsa(牛血清蛋白)1μl、ddh2o20μl；总体积50μl；37℃酶切过夜(大于等于12h)后，1.5％琼脂糖凝胶检测，分别回收750bp左右的pmd-zm-prx5目的片段和13000bp左右线性的质粒载体pcambia3301目的片段。用dnat4连接酶连接，连接体系如下：质粒载体pcambia3301目的片段3μl、pmd-zm-prx5目的片段12μl、10×t4-ligasebuffer2μl、10×bsa1μl、t4dnaligase2μl；总体积20μl；16℃连接过夜(≥12h)，得到融合表达载体pcambia1304-zm-prx5。图3b为pcambia1304-zm-prx5-gfp质粒的ncoi和spei双酶切检测结果。

s14，融合表达载体重组

融合表达载体pcambia1304-zm-prx5转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，ncoi和spei双酶切检测，测序。将检测、测序正确的质粒，构建成pcambia1304-zm-prx5-gfp质粒，备用。

s2，制备农杆菌感受态细胞

取农杆菌gv3101(市售)单菌落于3ml的yeb液体培养基中，28℃振荡培养过夜；取过夜培养菌液2ml接种于100mlyeb液体培养基中，28℃振荡培养至od600为0.5-0.8(约3-4h)；4℃，5000rpm/min离心10min，收集菌体；加40ml预冷的50mmcacl2溶液，轻轻悬浮农杆菌细胞，4℃，5000rpm/min,离心10min收集沉淀；加40ml预冷的50mmcacl2溶液，轻轻悬浮农杆菌细胞，4℃，5000rpm/min,离心10min收集沉淀；加入5ml预冷的含50mmcacl2悬浮细胞，加体积分数7％dmso(350μl)，得到农杆菌感受态细胞；每管200μl分装农杆菌感受态细胞，液氮速冻后于-80℃保存备用。

s3，pcambia1304-zm-prx5-gfp质粒转化杆菌农杆菌感受态细胞

取-80℃保存的农杆菌感受态细胞于冰上融化。加入2μl的pcambia1304-zm-prx5-gfp质粒，混匀。液氮中速冻5min后，37℃热击5min，取出后迅速放置冰上2min。加入1ml无抗性yep培养基，28℃，200rpm/min震荡培养4h。3000rpm/min离心1min收集菌体，将菌液均匀的涂布于含有50μg/ml卡那、50μg/ml利福平的yep平板培养基上，28℃培养72h。挑取平板上的单菌落于1ml含有50μg/ml卡那、50μg/ml利福平的液体培养基中，200rpm/min震荡培养6h后，将生长正常的单菌落，得到重组质粒转化菌，保存备用。

另外，参照上述s3方法，用pcambia1304空载体转化s2的农杆菌感受态细胞，得到空质粒转化菌，备用。

s4，烟草种植及重组质粒转化菌转化本氏烟草

s41，将本氏烟草(nicotianabenthamiana)种子播撒在育苗盘中，2周后移至小花盆，3～4周后即可作为转化受体。

s42，重组质粒转化菌转化本氏烟草

s421，将s3得到的重组质粒转化菌在加有卡那霉素50μg/ml和利福平50μg/ml的yeb培养基中黑暗培养。将1ml过夜培养的重组质粒转化菌转接到25mlyeb液体培养基中，yeb液体培养基中加有卡那霉素50μg/ml和利福平50μg/ml。检测过夜培养的菌液od600的值。

s422，od600为0.6-1.0时，4℃、5000r/pm离心15min集菌，弃去上清，用重悬液重悬菌体至20ml，最终od600为0.6-1.0。此步骤可重复一次，以去除残留的抗生素。重悬浮液至少室温放置3h后得到活化菌液，备用。

s423，注射时可用白色枪头在本氏烟草叶片上扎数个小孔，或者用去掉针头的注射器轻轻擦除无主脉处的下表皮蜡质，形成注射点，然后用去掉针头的一次性2ml注射器吸取s42的活化菌液，在叶背小孔处轻推注射器活塞利用渗透压使菌液沿小孔注入叶片组织空隙。每个点注射量以注射液无法在叶背面扩散为止，每个叶片注射不超过4个点，完成转化操作。

注射后，烟草叶片会出现湿润的现象，用记号笔标记注射区域，便于取样观察。为了防止操作失误引起的注射液喷射，在注射的过程中要带口罩、手套和眼镜。如果同时进行多个工程菌的注射，在注射不同的菌前更换1次手套，防止交叉污染。注射后将植物置于弱光60μm·m^-2·s^-1条件下培养一天，然后放于光下正常培养，3d-5d后取样观察，作为实验组。

参照s4的步骤，将空质粒转化菌介导瞬时转化本氏烟草，作为对照组。

s5，烟草下表皮细胞的激光扫描共聚焦显微镜观察

s4注射后，实验组和对照组第4天将瞬时表达的本氏烟取一小片(1cm²左右)注射液扩散范围的烟草下表皮，放在载玻片上(滴1-2滴ddh2o)，盖上盖玻片，设置激发光波长488nm，用荧光共聚焦显微镜观察gfp绿色荧光在本氏烟叶片内的分布。图4是zm-prx5亚细胞定位结果。结果显示，pcambia1304空载体的gfp荧光信号在细胞核、细胞质、细胞膜都表达(图4b和图4c)，融合蛋白pcambia1304-zm-prx5只在细胞质中有表达(图4e和图4f)，这说明zm-prx5是一个细胞质蛋白。

实施例2通过dna重组技术成功构建了pcambia1304-zm-prx5荧光表达载体，在农杆菌od600为0.8时，通过农杆菌介导的方法将zm-prx5基因整合到烟草幼苗中，经过3-5天的培养后，撕下烟草下表皮细胞进行共聚焦显微镜观察，发现在空载对照中，zm-prx5在细胞的各个部位均有表达；在转pcambia1304-zm-prx5基因的烟草表皮中，发现绿色荧光在细胞质中表达明显，说明zm-prx5是一个细胞质蛋白。

实施例3zm-prx5在非生物胁迫下的定量表达试验

(1)不同生长方式处理

正常生长条件：采用水培的方法，营养液是改良后的hoagland’ssolution(improvementofinvitrodatepalmplantletacclimatizationratewithkinetinandhoaglandsolution.(2017；1637:185-200))，ph＝5.8。光照时间14h/10h(白/夜)，光照强度150μm·m-2s-1；湿度70％。

干旱处理：先把玉米播种在沙土中，光照时间14h/10h(白/夜)，光照强度150μm·m-2s-1；温度26℃/22℃；湿度70％。生长3周后，正常浇水。处理前3天停止浇水。三天后开始取样。

高温(ht)处理：维持正常生长条件，用37℃的高温环境处理玉米苗。同时26℃的玉米苗做为对照。

盐协迫处理：维持正常生长条件，温度22-26℃，用nacl处理玉米苗，使营养液中的nacl的浓度为350mm。同时不加nacl处理的玉米苗做为对照。

激素处理：维持正常生长条件，温度22-26℃，用水杨酸处理玉米苗，使营养液中的水杨酸的浓度为1mm。同时不加水杨酸处理的玉米苗做为对照。

(2)试验方法

参照实施例1步骤1的方法提取玉米总rna，然后参照实施例1步骤3的方法分别合成不同生长方式处理下玉米叶片的cdna第一链，然后利用这些cdna第一链进行荧光定量pcr。荧光定量pcr目的基因引物(跨内含子引物)：

p-5f：5'-caaagccaagggtgtagacga-3'，如seqidno.9所示，p-5r：5'-cgatgtttgcgacggtga-3'，如seqidno.10所示；pcr扩增片断236bp；

荧光定量pcr内参基因18s引物：

18s6f：5'-cctgcggcttaattgactc-3'，如seqidno.11所示，

18s6r：5'-gttagcaggctgaggtctcg-3'，如seqidno.12所示；pcr扩增片段174bp。

荧光定量pcr体系如下：premixtaq12.5μl、20×sybr染料1μl、zm-prx5f50.6μl、zm-prx5r50.6μl、模板cdna第一链1μl、ddh2o9.3μl，总体积25.0μl。荧光定量pcr体系在lightcycler480ii上进行扩增，程序如下：95℃预变性3min；95℃变性10s，58℃退火20s，72℃延伸20s，40个循环；72℃读取荧光值；循环结束后60℃1min，进行熔解曲线分析，由熔解曲线判定pcr反应的特异性。

(3)试验结果

检测所取每份样品中zm-prx的表达量，计算试验结果。盐协迫处理结果如下：盐处理后0h、3h、6h、12h、24hzm-prx的相对表达量分别为0.99、0.42、1.05、1.41、0.38，盐处理后zm-prx5的表达出现先减后增再减的趋势，处理后3h表达量下降，在处理后12h达到最大值为对照的1.4倍。在处理后3h出现下降可能是植物在外界胁迫条件下，会有一个适应过程，先对植物照成一定的生理伤害，之后植物本身会作出一系列的抵抗反应，从而增强自身的抵抗能力。

干旱处理结果如下：干旱处理后0d、1d、2d、3d、4d、5d、6d、7dzm-prx的相对表达量分别为0.99、0.79、0.49、0.87、1.89、8.45、3.77、1.01，可知：在干旱处理后的1-3天内，zm-prx5的表达基本稳定，之后会出现上升，第5天时表达量达到最大为对照的8.5倍左右，而第6天下降至3.7倍，第7天表达量下降至对照水平。从表型上看，玉米幼苗在第4天时大多会出现萎奄，在第7天时大多干枯死亡。

高温处理结果如下：0h、3h、6h、12h、24hzm-prx的相对表达量分别为0.99、0.42、2.94、0.66、0.35，高温处理后3h,zm-prx5表达量下降，6h后表达量最大为对照的3倍左右，处理12小时后降为对照的一半左右，处理后24h与处理后3h的表达量相似，为对照的0.2倍左右。

激素处理结果如下：0h、3h、6h、12h、24hzm-prx的相对表达量分别为0.99、1.50、1.18、5.81、0.84，在sa处理后的一段时间内(0h～6h)zm-prx5的表达量基本稳定，在处理后12hzm-prx5的表达量急速增至对照的6倍左右，但在处理24h后又迅速下降至对照水平。sa诱导zm-prx5在玉米中上调表达。

需要说明的是本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，本发明描述了优选的实施例。本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110>河南农业大学

<120>玉米zm-prx5克隆、克隆方法及表达方法

<160>18

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>743

<212>dna

<213>玉米

<400>1

accaccccacccattcactcgcgtgcgctccctcgccgccccagttccccaccccctgct60

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<210>2

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<212>dna

<213>人工序列

<400>2

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<210>3

<211>20

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<213>人工序列

<400>3

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<210>4

<211>21

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<213>人工序列

<400>4

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<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

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<210>6

<211>3866

<212>dna

<213>玉米

<400>6

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