OsProT3基因及其编码的蛋白在转运脯氨酸中的应用的制作方法

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及osprot3基因及其编码的蛋白在转运脯氨酸中的应用。

背景技术：

脯氨酸对植物在各种胁迫条件下的生长具有十分有益的作用。在不同的环境条件下，如干旱、高盐度(choudhary,n.l.etal.2002.ind.j.biochem.biophys)、高光照(yoshiba,y.etal.1995.plantj.)和紫外线照射(saradhi,p.p.1995.etal.biochem.biophys.res.commun)、重金属(schat,h.etal.1997.physiol.plant.)、氧化应激(yang,s.l.etal.2009.plantphysiol.)和生物应激反应(fabro,g.etal.2004.mol.plant–microbeinteract；haudecoeur,e.etal.2009.proc.natl.acad.sci.u.s.a.)等，脯氨酸在植物体内大量积累以应对这些逆境条件。

脯氨酸的合成及降解是植物处于逆境条件下累积脯氨酸的重要途径。脯氨酸的合成主要在叶绿体和细胞质进行，有两种途径，谷氨酸途径和鸟氨酸途径。谷氨酸途径在渗透胁迫和氮素不足的情况下，对脯氨酸的合成起主导作用，而鸟氨酸途径在氮素充足的情况下，对脯氨酸的合成起主导作用(sekhar,p.n.etal.2007.jmolgraphmodel.)。在谷氨酸途径中，谷氨酸(glu)经吡咯啉-5-羧酸合成酶(p5cs)催化，生成吡咯啉-5-羧酸(p5c)，然后p5c在吡咯啉-5-羧酸还原酶(p5cr)作用下生成脯氨酸(shamsul,h.etal2012.plantsignaling&behavior)。而在鸟氨酸途径中，鸟氨酸(orn)经鸟氨酸转氨酶(oat)的作用，生成吡咯啉-5-羧酸(p5c)，然后经吡咯啉5-羧酸还原酶(p5cr)的催化下生成脯氨酸(sekhar,p.n.etal.2007.jmolgraphmodel.)。脯氨酸的降解主要发生在线粒体。脯氨酸的降解基本是合成反应的逆过程。脯氨酸在脯氨酸脱氢酶(pdh)氧化作用下，生成吡咯啉-5-羧酸(p5c)，然后在吡咯啉-5-羧酸脱氢酶p5cdh的作用下，生成谷氨酸(shamsul,h.etal2012.plantsignaling&behavior)。

除了合成和降解以外，脯氨酸的转运系统也参与了脯氨酸的累积(cirousseetal.,1996,plantphysiol.；schwackeetal.,1999,plantcell；lehmannetal.,2011,j.exp.bot.)，但水稻中的这一过程并不十分清楚。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供osprot3基因及其编码的蛋白在转运脯氨酸中的应用，所述osprot3基因编码的蛋白具有转运脯氨酸的功能。

本发明提供了osprot3基因在转运脯氨酸中的应用。

本发明还提供了osprot3基因在酿酒中的应用。

优选的，将所述osprot3基因在酿酒酵母中表达，实现提高酿酒酵母对酿酒原料中脯氨酸的利用率。

本发明还提供了osprot3基因在提高植物抗胁迫能力中的应用。

优选的，将所述osprot3基因转入到植物中，实现提高植物抗胁迫能力。

优选的，所述植物包括水稻。

本发明还提供了osprot3基因编码的蛋白在转运脯氨酸中的应用。

本发明还提供了osprot3基因编码的蛋白在提高植物抗胁迫能力中的应用。

本发明提供了osprot3基因及其编码的蛋白在转运脯氨酸中的应用，所述osprot3基因编码的蛋白具有转运脯氨酸的功能。

附图说明

图1为分析osprot3的跨膜结构域，图上部横线加粗部分指示跨膜区域；

图2为osprot3转运脯氨酸的特性确定，图中ev所示列表示转化p426-gpd空载体的酵母，osprot3所示列表示转化p426gpd-osprot3载体的酵母；nh4所示行表示以铵根作为氮源，pro所示行表示以脯氨酸作为氮源；

图3为测定osprot3对外界¹⁵n标记的脯氨酸的吸收能力，图中ev表示转化p426-gpd空载体的酵母，osprot3表示转化p426gpd-osprot3载体的酵母，图中数据表示平均值±sd，n＝4；

图4为测定表达osprot3基因的酵母的生长曲线和底物转运特性，图中纵坐标表示酵母菌的od600吸光值，横坐标表示底物脯氨酸浓度，图中数据表示平均值±sd，n＝3；

图5为qrt-pcr分析osprot3基因的表达量，图中柱子表示osprot1在地上部的相对表达量，以osactin1作为内参基因，图中数据表示平均值±sd，n＝3。

具体实施方式

本发明提供了osprot3基因在转运脯氨酸中的应用。

在本发明中，所述osprot3基因的核苷酸序列如seqidno.1所示，具体序列如下：

aggagcagaaggaggccccccaggagaacggggtgacggcgctgctgctgccccaggccagtctacctgcaagatgaacatcgacatggccaattccgacgacaaggctctcatctccgaggatacagcgcaccagattagcgctggtaatttttcatctatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatgttctcttgtttgttttattatcagtacctgactcaacaaagatgaacaccacaactcatgcttatgtatgagcctatcatacatatgccagcgtataaagtcgcacttttgtgcgactataacctctctctttgttaaatgtgttaacattagcttaagtgtttgaagaaaataacttgcacgagttgtagctgtaacacatgtttatattaatttgtaactaagaatattgtcataacaacaaacaaatttaccatacaatgtcatttgtagtaatattgtaaataggcatgtaatttgaaatatctaggtcgagttcttatctctactttctcaactcatctccctcgttttccgcgcgcacgcttttcaaattgctaaacggtgtgttttttgcaaaaattttctatataaaagttccttttaaaaaaatcatattaatctatttttcaaatttattttagctaatacttaattaatcatacgctaaacgctatttcgttttgcgtgctaggagtgagggttcccgaacacacctctagccatttttcagcttaataaaatggtgagtgtagtcttttcctcctctattctaccctccttatctatgtaaccataatcgcccactttgttgtcgcttgagccgtcgcgttagcgtcatctccgtcgctgcatgacccccatcctcctcttatgtatcctaggtccagctgctacataagatgttacattcctactacatctgttgtttcatgaccatgtttatttttcgcttgtgatacctatattttatcaaacttgaattgcaattagtcgttagaactaatatttaccaatgtcccaatagcccatttatgaaccaataggccaattataaatttatatttgtagcatgcgcccgtttaattattagaaataaaattgtcaaatggatatacattacatgttcacaattttgagtagttttagggtctagaatattaatttaaataatacatgatatcgattataattataaacaaacatacggagttacacataaataaagctttgtagtattaattagataattttataatatagtattaaaataaggggttgtctgctaatggcctaaacttggcccaaagccttagtaggaaaggtgatgtagtggcgctttcctcttctttttctctatacatctagaagtctcctctctcatccaacggttgtgctttgccatgctttttttctttatgtggacccaacgctattgttttgcaacttatgtggctcattttattacattttgggattcccttttcacttgtagagatatgtctcatcataacttagggtatgttttgattgatgccaaaatgaaccttacaaaatttttggcaatggcaaaattatggcaaattggcaacattgctaaaattttttaggattggcttaataatgttaccaaaatttcatacacattgccaatatttggtaacaaactaaatgtagccacataattgtcaattttaccaaataatggtatggtttaaaatatcatcaatctaaacaggtccctagtgccaaaatagacgctatccacggctagattgaaaacaaaaggcttcttctgtcagctcattcatgttcatcatcctgcagagaccccgttcatgttcatagatgaagtaatttcctttcttaatttcatatattttcagtgatgcctgttcttatttctgtttatctgattcctctacccaaaattagagtcatgtcacttcggcctgaaccaaaggagagaaagagaaagagagagcaaacgaccttatggtctttcaagtcaatctgcatatcagtaccatggcttcacatttcaatcttcaaagtagcatgtatgattactgattaactcctgaaagtcttctttccttttcactttcagatccttggtatcaagttggattcgttctgacaactggggtgaatagtgcatatgttctgggatactctggatcagtcatggtccctttaggttggattggtgggacatgtggcttgatcctagctgctgcaatatctctgtatgccaatgctctccttgctcgccttcacgaaatcggaggcaaacgacatattagatacagagatcttgctgggcacatatatggtaaatatttctatgaggtctacttgatatttgataatgcggtgtttcattctcttttcctttttttttctcttttgtcctgtgacggtcaattttagaaatcaaccatcatttccttaatttattcccccttgcatcatatctctgaaatttcatacttgttttattggatttttaatgcatttctgtggttttgtttattaatagaaaaggtgtgattgaatttcctttattctggtgactacaggtagaaaaatgtattcgcttacatgggctctgcaatatgttaatctattcatgatcaacactggctttataatattagctggccaagccttgaaggtacagactacagagtaacgatacccagcttttgttatggtgaaaaccaatctggtgaaaattccatgttgctctatccatatttattccctgcaatatctggcccttctatatctcagtatctaagtttagaaattttgccagaatgcacgtgttgaatttatttccagaaagaataaattagttgatggcatatgaagtcttttcccctcctgaactcactttgtgaacttcctctgtgcaggcaacatatgtattgttcagggatgatggagttctaaagctaccctactgtatagcattatctgggtttgtctgtgctctttttgccttcggaattccttatctctctgctctcaggatttggttgggattctcaacatttttcagtctcatctatattactatagcatttgtgctatcgcttagagatggtattacacattgtttctttgttcaactgtcctgccaattttgagaccatgattcattgcatttccatttgtcgtcatataaaatttcattattatttttttcttttgaaagggataaccacacctgcaaaggattatactattcctggatcccattcagctagaatcttcactacgataggtgctgtggcaaatctcgtgttcgcttacaacactggaatgctgccagaaattcaagtgagtcagtgtagcacatatggccagtgactagtttatttgctatgaaattgcttatcttatgtttactacaatattgcaggcaaccataaggcctcctgtggtgaagaacatggagaaggctctatggtttcagttcactgtcggttcgttacctctttatgccgtgacctttatgggctattgggcttatggatcctcaacatcaagttatctactgaatagcgtcaaggggccagtttgggtaaaagctatggcaaatctatcagcgtttcttcagaccgtcatagcattacatgtaggtccactccacctcagtaattttccaattgtgtgtgttttttcaattcacagttgtgtgtgcgtgtgcgtgtgcatgtgttttttgaatttacttttatagtcaaatgtcagatattcgcgagcccaatgtacgagttcttggacacgaaatacggcagcggacacggtggcccttttgcgatccacaatgtgatgttcagagtgggtgtaagaggaggctacctgactgtcaacaccttggtagctgcgatgctcccattccttggcgacttcatgagcctgaccggagctctcagcaccttccccttgacattcgttcttgcaaatcacatgtacctgatggtgaagaggcacaagttgtccaccttgcagatatcctggcactggctcaatgttgctggcttcagcttattgtccatcgcagctgcagttgctgcgctcaggctaatcatggtcgattccaggacttaccatttgtttgctgatctgtgactgtgattgagacccaaattttcagtgcaaacatgcaccttgaatgatcagctgtaatttcttctttttcttaggggtgaactaccgcgagatgtttgcctcaaaacgtactgtagtgatgttttttagaacagtagtgatatattgtatcattgtacaactctgcaggttgaatgaattttgtggccatcgtgcatacctcttactacttt。

在本发明中，所述osprot3基因的编码序列如seqidno.2所示，具体序列如下：

atgaacatcgacatggccaattccgacgacaaggctctcatctccgaggatacagcgcaccagattagcgctgatccttggtatcaagttggattcgttctgacaactggggtgaatagtgcatatgttctgggatactctggatcagtcatggtccctttaggttggattggtgggacatgtggcttgatcctagctgctgcaatatctctgtatgccaatgctctccttgctcgccttcacgaaatcggaggcaaacgacatattagatacagagatcttgctgggcacatatatggtagaaaaatgtattcgcttacatgggctctgcaatatgttaatctattcatgatcaacactggctttataatattagctggccaagccttgaaggcaacatatgtattgttcagggatgatggagttctaaagctaccctactgtatagcattatctgggtttgtctgtgctctttttgccttcggaattccttatctctctgctctcaggatttggttgggattctcaacatttttcagtctcatctatattactatagcatttgtgctatcgcttagagatgggataaccacacctgcaaaggattatactattcctggatcccattcagctagaatcttcactacgataggtgctgtggcaaatctcgtgttcgcttacaacactggaatgctgccagaaattcaagcaaccataaggcctcctgtggtgaagaacatggagaaggctctatggtttcagttcactgtcggttcgttacctctttatgccgtgacctttatgggctattgggcttatggatcctcaacatcaagttatctactgaatagcgtcaaggggccagtttgggtaaaagctatggcaaatctatcagcgtttcttcagaccgtcatagcattacatatattcgcgagcccaatgtacgagttcttggacacgaaatacggcagcggacacggtggcccttttgcgatccacaatgtgatgttcagagtgggtgtaagaggaggctacctgactgtcaacaccttggtagctgcgatgctcccattccttggcgacttcatgagcctgaccggagctctcagcaccttccccttgacattcgttcttgcaaatcacatgtacctgatggtgaagaggcacaagttgtccaccttgcagatatcctggcactggctcaatgttgctggcttcagcttattgtccatcgcagctgcagttgctgcgctcaggctaatcatggtcgattccaggacttaccatttgtttgctgatctgtga。

在本发明中，所述osprot3基因编码的蛋白的氨基酸序列如seqidno.3所示：

mnidmansddkalisedtahqisadpwyqvgfvlttgvnsayvlgysgsvmvplgwiggtcglilaaaislyanallarlheiggkrhiryrdlaghiygrkmysltwalqyvnlfmintgfiilagqalkatyvlfrddgvlklpycialsgfvcalfafgipylsalriwlgfstffsliyitiafvlslrdgittpakdytipgshsarifttigavanlvfayntgmlpeiqatirppvvknmekalwfqftvgslplyavtfmgywaygsstssyllnsvkgpvwvkamanlsaflqtvialhifaspmyefldtkygsghggpfaihnvmfrvgvrggyltvntlvaamlpflgdfmsltgalstfpltfvlanhmylmvkrhklstlqiswhwlnvagfsllsiaaavaalrlimvdsrtyhlfadl。

本发明还提供了osprot3基因编码的蛋白在转运脯氨酸中的应用。

本发明还提供了osprot3基因编码的蛋白在提高植物抗胁迫能力中的应用。

本发明还提供了osprot3基因在酿酒中的应用。在本发明中，所述应用优选包括：将所述osprot3基因在酿酒酵母中表达，实现提高酿酒酵母对酿酒原料中脯氨酸的利用率。

本发明还提供了osprot3基因在提高植物抗胁迫能力中的应用。在本发明中，所述应用优选包括：将所述osprot3基因转入到植物中，实现提高植物抗胁迫能力。

在本发明中，所述植物优选包括水稻。

下面结合具体实施例对本发明所述的osprot3基因及其编码的蛋白在转运脯氨酸中的应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

分析osprot3的跨膜结构域

从水稻数据库msuricegenomeannotationprojectdatabaseandresource(http://rice.plantbiology.msu.edu/)下载获得osprot3(loc_os07g01090.1)的基因序列、编码序列及编码蛋白序列。根据蛋白序列，利用tmhmmserverv.2.0.(http://www.cbs.dtu.dk/services/tmhmm)在线软件，根据默认参数分析osprot3的跨膜结构域，结果表明osprot3含有11个跨膜结构域，也暗示编码的是膜定位蛋白。结果见图1。

从水稻cdna中扩增得到osprot3基因的全长cds并克隆至表达载体

从水培两周的水稻日本晴幼苗中提取rna，反转录为cdna。以此cdna为模板，利用引物p426-osprot3-f(seqidno.4)(gattctagaactagtggatccatgaacatcgacatggccaat)和p426-osprot3-r(seqidno.5)(gataagcttgatatcgaattctcacagatcagcaaacaaatg)从水稻cdna中，将osprot3基因的编码序列克隆至p426gpd载体，形成p426gpd-osprot3载体；经菌液pcr、酶切和测序鉴定后，用于后续的酵母实验。p426gpd载体为市售产品。

将含有osprot3基因的酵母表达载体转化至酿酒酵母22△10α中

利用peg介导的酵母转化方法(elble1992)，将p426gpd-osprot3载体及对照空载体转化至酿酒酵母22△10α中，均匀涂布于[sd+3mm(nh4)2so4]平板，30℃倒置培养3天，挑克隆摇菌，pcr鉴定，选取正确的用于后续的功能研究。酿酒酵母22△10α由美国virginiatech的guillaumepilot教授惠赠，此酵母的特性和制备方法详见guillaumepilot教授发表文献(besnardetal.,2016,journalofexperimentalbotany,vol.67,pp.6385–6397,doi:10.1093/jxb/erw412)中的说明。

osprot3转运脯氨酸的特性确定

将鉴定正确的酵母划板于[sd+3mm(nh4)2so4]上，30℃倒置培养3天，挑克隆摇菌3-5ml[sd+3mm(nh4)2so4]，30℃，220rmp，摇床过夜。4℃，4000rmp，离心3min，收集菌体，于超净工作台倒去上清液，用ddh2o洗两到三遍后调od600至0.8。取4μl菌液点于的sd+3mmpro(单一氨基酸)和[sd+3mm(nh4)2so4]的平板上。30℃倒置培养3天。观察酵母生长情况。结果表明，转化p426gpd空载体和p426gpd-osprot3的酵母在[sd+3mm(nh4)2so4]的平板上生长状况基本一致，而在sd+3mmpro(单一氨基酸)的平板上，转化p426gpd空载体的酵母不能生长繁殖，转化p426gpd-osprot3的酵母能够生长繁殖，说明osprot3基因编码了脯氨酸转运蛋白，使得氨基酸转运功能缺陷的酵母菌株22△10α能够转运脯氨酸至体内，使其能够在sd+3mmpro(单一氨基酸)的平板上生长。结果见图2。测定osprot3对外界¹⁵n标记的脯氨酸的吸收能力

挑鉴定正确的含p426gpd-osprot3转化子及空载体对照的酵母，至4ml[sd+3mm(nh4)2so4]的液体培养基中，30℃，220rmp，摇床过夜。4℃，4000rmp，离心5min，收集菌液，用无菌水稀释至od600＝1.0，按1:20比例(取7.5mlod600＝1稀释后的菌液)接菌至150ml[sd+3mm(nh4)2so4]中，30℃，220rmp摇至od600＝1.0，取出50ml菌液用于测定初始¹⁵n含量，剩余菌液加入98％丰度¹⁵n标记的脯氨酸至终浓度为1.5mm，30℃，220rmp摇菌标记15min、30min时各取出菌液50ml,立即置于冷冻离心机中4℃，4000rmp，离心3min,用无菌超纯水清洗4次。将收集到的菌体，至80℃烘干，用元素分析同位素质谱联用仪测定菌体的¹⁵n含量。结果表明，转化p426gpd空载体的酵母在标记的各个时间点与初始状态相比体内¹⁵n含量并无显著变化；转化osprot3基因的酵母随时间增加体内累积的¹⁵n含量逐步增加。以上说明osprot3可以将外界¹⁵n标记的脯氨酸吸收至酵母体内。结果见图3。

测定转化p426gpd-osprot3的酵母的生长曲线和osprot3的底物转运特性

挑鉴定正确的含p426gpd-osprot3转化子的酵母22△10α，至4ml[sd+3mm(nh4)2so4]的液体培养基中，30℃，220rmp，摇床过夜。4℃，4000rmp，离心5min，收集菌液，用无菌水稀释至od600＝0.8。分别取4μl点在含不同浓度(1mm,2mm,4mm,8mm,12mm,16mm,20mm,30mm,40mm,50mm,60mm,80mm)的脯氨酸平板，每平板点四个斑。30℃倒置培养3-5天。用移液器吸取1ml无菌水，将酵母从平板上冲洗下来，放至10ml离心管中，用无菌水定容至6ml。稀释至合适浓度在od600下测定酵母的吸光度，绘制生长曲线。结果表明，在较低浓度范围内随脯氨酸浓度增多，菌扩增速度越快，底物至较高浓度后，菌扩增速度达到饱和，符合典型的底物转运曲线模型。利用sigmaplot12.0拟合米氏方程曲线，计算可得osprot3转运脯氨酸的km＝4.2343±0.8814mm，vmax＝6.3310±0.294mm。结果见图4。

qrt-pcr分析osprot3基因的表达量

将日本晴种子浸泡于水中1-2天后，铺在湿润的纸上，避光置于恒温培养箱中培养萌发，待种子的芽长到1cm左右，将其种于96孔板，在温室光照下用正常的水稻yashida营养液培养14天左右，3天换一次营养液。na⁺处理为正常水稻营养液含50mmnacl；cd²⁺处理，正常水稻营养液含50μmcdcl2；ck，正常培养液；处理2天。每个处理取3份地上部(约15株)，提取rna，反转cdna，引物为(seqidno.6)qrt-osprot3-f(atgggctattgggcttatgg)&(seqidno.7)

qrt-osprot3-r(ggtctgaagaaacgctgataga)和(seqidno.8)qrt-osactin1-f(tgaagtgcgacgtggatattag)&(seqidno.9)qrt-osactin1-r(ccaatccagacactgtacttcc)，采用sybr-green法，检测osprot3基因表达量。结果表明在cd²⁺处理条件下，osprot3的基因表达量比对照条件下的基因表达量高，说明在cd²⁺处理的逆境条件下，osprot3基因的表达受到诱导，可能参与了植物对cd逆境的应对过程。见图5。

上述结果表明，osprot3基因编码的蛋白具有跨膜结构域，介导了脯氨酸的跨膜转运过程，osprot3基因在酵母中表达，能够将外界脯氨酸吸收至酵母体内。在酿酒工艺中，osprot3基因转化于酿酒酵母中，为提高原料中脯氨酸的利用提供了一种新的途径。本发明中osprot3编码的蛋白被证实了有脯氨酸转运功能。在基因工程领域中，利用osprot3基因调控植物体内脯氨酸的积累和分配，提高植物的抗胁迫能力。此外，利用转基因技术，将osprot3基因表达至需要的作物的特定部位中，定向调控脯氨酸向所需的部位累积，以提高植物逆境耐受性，这为作物的品种改良提供了一种新的途径和有效的基因资源。因此，osprot3基因在酿酒工艺和转基因工程中有良好的应用前景。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>湖南农业大学

<120>osprot3基因及其编码的蛋白在转运脯氨酸中的应用

<160>9

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>4426

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

aggagcagaaggaggccccccaggagaacggggtgacggcgctgctgctgccccaggcca60

gtctacctgcaagatgaacatcgacatggccaattccgacgacaaggctctcatctccga120

ggatacagcgcaccagattagcgctggtaatttttcatctatatatatatatatatatat180

atatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatat240

atatatatatgttctcttgtttgttttattatcagtacctgactcaacaaagatgaacac300

cacaactcatgcttatgtatgagcctatcatacatatgccagcgtataaagtcgcacttt360

tgtgcgactataacctctctctttgttaaatgtgttaacattagcttaagtgtttgaaga420

aaataacttgcacgagttgtagctgtaacacatgtttatattaatttgtaactaagaata480

ttgtcataacaacaaacaaatttaccatacaatgtcatttgtagtaatattgtaaatagg540

catgtaatttgaaatatctaggtcgagttcttatctctactttctcaactcatctccctc600

gttttccgcgcgcacgcttttcaaattgctaaacggtgtgttttttgcaaaaattttcta660

tataaaagttccttttaaaaaaatcatattaatctatttttcaaatttattttagctaat720

acttaattaatcatacgctaaacgctatttcgttttgcgtgctaggagtgagggttcccg780

aacacacctctagccatttttcagcttaataaaatggtgagtgtagtcttttcctcctct840

attctaccctccttatctatgtaaccataatcgcccactttgttgtcgcttgagccgtcg900

cgttagcgtcatctccgtcgctgcatgacccccatcctcctcttatgtatcctaggtcca960

gctgctacataagatgttacattcctactacatctgttgtttcatgaccatgtttatttt1020

tcgcttgtgatacctatattttatcaaacttgaattgcaattagtcgttagaactaatat1080

ttaccaatgtcccaatagcccatttatgaaccaataggccaattataaatttatatttgt1140

agcatgcgcccgtttaattattagaaataaaattgtcaaatggatatacattacatgttc1200

acaattttgagtagttttagggtctagaatattaatttaaataatacatgatatcgatta1260

taattataaacaaacatacggagttacacataaataaagctttgtagtattaattagata1320

attttataatatagtattaaaataaggggttgtctgctaatggcctaaacttggcccaaa1380

gccttagtaggaaaggtgatgtagtggcgctttcctcttctttttctctatacatctaga1440

agtctcctctctcatccaacggttgtgctttgccatgctttttttctttatgtggaccca1500

acgctattgttttgcaacttatgtggctcattttattacattttgggattcccttttcac1560

ttgtagagatatgtctcatcataacttagggtatgttttgattgatgccaaaatgaacct1620

tacaaaatttttggcaatggcaaaattatggcaaattggcaacattgctaaaatttttta1680

ggattggcttaataatgttaccaaaatttcatacacattgccaatatttggtaacaaact1740

aaatgtagccacataattgtcaattttaccaaataatggtatggtttaaaatatcatcaa1800

tctaaacaggtccctagtgccaaaatagacgctatccacggctagattgaaaacaaaagg1860

cttcttctgtcagctcattcatgttcatcatcctgcagagaccccgttcatgttcataga1920

tgaagtaatttcctttcttaatttcatatattttcagtgatgcctgttcttatttctgtt1980

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aagagaaagagagagcaaacgaccttatggtctttcaagtcaatctgcatatcagtacca2100

tggcttcacatttcaatcttcaaagtagcatgtatgattactgattaactcctgaaagtc2160

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tgaatagtgcatatgttctgggatactctggatcagtcatggtccctttaggttggattg2280

gtgggacatgtggcttgatcctagctgctgcaatatctctgtatgccaatgctctccttg2340

ctcgccttcacgaaatcggaggcaaacgacatattagatacagagatcttgctgggcaca2400

tatatggtaaatatttctatgaggtctacttgatatttgataatgcggtgtttcattctc2460

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ccttaatttattcccccttgcatcatatctctgaaatttcatacttgttttattggattt2580

ttaatgcatttctgtggttttgtttattaatagaaaaggtgtgattgaatttcctttatt2640

ctggtgactacaggtagaaaaatgtattcgcttacatgggctctgcaatatgttaatcta2700

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