一种稀有人参皂苷的转化方法与流程

本发明专利涉及人参皂苷的生物转化领域，尤其涉及一种基于反胶团体系的高速逆流色谱反应器，用于稀有人参皂苷的高效生物转化。

背景技术：

五加科植物如人参、西洋参、三七等植物的主要活性物质为人参皂苷类成分，具有抗肿瘤、抗衰老、提高机体免疫力和增加血管新生等多种药理作用。然而初级人参皂苷类成分具有极性大、分子质量大的特点，不易透过肠壁黏膜吸收。初级人参皂苷类成分由于在肠内滞留时间较长，部分糖苷在肠道内特异菌群分泌的酶的作用下发生了转化，转化为人参皂苷ck、人参皂苷rg3等稀有人参皂苷，透过肠壁进入血液循环，被机体吸收利用，进而发挥药效。将初级人参皂苷成分经过体外生物转化得到活性更好的稀有人参皂苷，将有助于进一步明确苷类药物口服起效的机制，同时对指导开发以稀有人参皂苷为药效物质基础的高效制剂具有潜在的价值。

生物转化法具有反应温和、专一性强以及环境污染小等优势，具有广阔的应用前景。常见的生物转化的反应器主要包括均相反应器、固定化酶反应器、酶膜反应器、陶瓷膜反应器等，具有反应量大，酶处理简单等优势，同时存在产物抑制现象严重、膜物理损伤严重、易污染、回收困难、清洗和更换麻烦等劣势。反胶团溶剂系统作为一种新型的萃取技术，其最大的优点是萃取过程中蛋白质由于受到反胶团的保护而不易于变性，目前已被应用到逆流色谱分离蛋白质、酶、等生物大分子领域。

胶束酶学研究的权威martinek预言，反胶束体系有可能成为生物转化的通用介质。酶催化的介质工程的研究经历了从水→有机溶剂→反胶束的过程。在水/有机溶剂两相体系和微水有机溶剂单相体系中，仅有少数酶能够保持催化活性。由于反胶束体系能够较好地模拟酶的天然环境，因而在反胶束体系中，大多数酶能够保持催化活性和稳定性，甚至表现出“超活性”。

高速逆流色谱法是一种依靠被分离物质在两相中分配系数k值的不同，实现样品的有效分离的方法。现有技术中通常向人参皂苷中加入酶完成生物转化反应后，再经高速逆流色谱将反应后的稀有人参皂苷分离，步骤较为繁琐，尚未公开将反胶团体系作为高速逆流色谱仪溶剂体系，直接作为稀有人参皂苷生物酶转化反应器的技术方案。

技术实现要素：

针对上述技术问题，本申请提供了一种以高速逆流色谱作为生物酶反应器将人参皂苷转化为稀有人参皂苷的方法，申请人在申请号为201811435142.5的专利中，提供了一种以高速逆流色谱作为生物酶反应器的技术方案，在上述专利中，通过将糖苷及酶置于有机相与水相中，在逆流色谱运行过程中，糖苷与水解酶在水相中充分的混合，生成的苷元由于分配系数与糖苷不同进入有机相溶液中，从而消除了底物抑制效应，促进糖苷水解为其苷元形式。本申请提供的是一种将人参皂苷转为稀有人参皂苷的技术方案，本领域公知，人参皂苷及稀有人参皂苷均为糖苷，即本申请中的底物、产物均为易溶于水相的成分，与上述专利中面临的技术问题又有显著的不同。

本申请提供的是一种基于反胶团体系的逆流色谱生物反应器，用于稀有人参皂苷的高效生物转化，该技术的优势在于将反胶团所在的有机溶剂体系环境包裹住水解酶，实现酶的固定化，另一相亲水溶剂系统携带底物进行洗脱，可避免人参皂苷类在低极性有机溶剂溶解性差的难题，同时产物随流动相持续流出，实现了稀有人参皂苷的生物转化，减少了反应器的产物抑制效应，转化率最高可以达到100％。

为了实现上述技术效果，本申请提供以下技术方案：

本申请第一方面，提供一种稀有人参皂苷制备方法，将反胶团溶剂体系包裹的水解酶与人参皂苷加入逆流色谱仪中，一定条件下反应一段时候后收集流出液，分离得到稀有人参皂苷。

本领域的一般研究思路认为酶在有机溶剂中的溶解效果不好，本申请发明人联想到采用反胶团体系将酶稳定于固定相有机溶液中，通过流动相与固定相的相对运动作用，充分混合酶与底物，酶解反应效率高于一般生物转化器。

优选的，上述制备方法包括如下步骤：

(1)配制反胶团溶剂系统，将水解酶包裹于反胶团溶剂系统中，配制含水的流动相，加入底物样品。

(2)将含有酶的反胶团溶剂泵入逆流色谱仪，调整好仪器参数，空白流动相泵入，并达到流体动力学平衡。

(3)将加入底物的流动相以一定流速泵入逆流色谱仪，并进行酶解反应，出口端收集产物稀有人参皂苷样品溶液。

(4)将上述样品溶液浓缩、干燥、水溶解除去增溶剂，样品烘箱干燥，即得稀有人参皂苷样品。

本申请中以高速逆流色谱作为酶反应器，高速逆流色谱反应器内无构件，无机械搅拌，对酶和细胞无损伤，有利于保持酶的活性和浓度；另外，高速逆流色谱具有两相、四个进出口，可方便组成逆流、顺流操作，固定液体相可选择轻相或重相，因此操作上可多种组合，灵活性大，可实现一机多用途，更换流动相又可将产物分离浓缩，可实现一机多步操作。且经本申请研究发现，通过调节高速逆流色谱的流速，可以获得不同的稀有人参皂苷，操作方便，效果优越。

优选的，上述步骤(1)中反胶团溶剂体系为丁二酸二异辛酯磺酸钠(aot)/曲拉通(triton)x-100/异辛烷体系。

本领域公知，人参皂苷具有两性部位，本身也是一种表面活性剂，在震荡作用下会产生许多泡沫，本申请研究采用上述反胶团体系，人参皂苷在高速逆流色谱仪中表现稳定，可方便的分离。

优选的，上述步骤(1)包括以下步骤：称取一定质量的丁二酸二异辛酯磺酸钠(aot)，曲拉通(triton)x-100，用异辛烷溶解，定容至一定体积，配制成总表面活性剂浓度为一定浓度的aot/tritonx-100/异辛烷溶液。用磷酸-磷酸二氢钾缓冲液配水解酶溶液，在aot/tritonx-100/异辛烷反胶束体系中加入一定体积的水解酶溶液以配制酶-反胶团体系。

进一步优选的，上述aot/tritonx-100/异辛烷溶液的总表面活性剂浓度为0.08～0.12mol/l。

进一步优选的，上述水解酶溶液的浓度40～60μmol/l。

该反应溶度内的水解酶与上述反胶团体系能够处于良好的稳定状态，适应较大幅度的转速变化。

优选的，将上述酶-反胶团体系用磷酸-磷酸二氢钾缓冲液进行饱和分配，分取上下相，上相为含有酶液的固定相，下相加入人参皂苷底物，保留部分空白下相溶液作为初始空白流动相。

进一步优选的，上述磷酸-磷酸二氢钾缓冲液ph值为4.8～5.2。

优选的，上述水解酶为蜗牛酶、β-葡萄糖苷酶、重组β-葡萄糖苷酶、新β-葡萄糖苷酶、人参皂苷糖苷酶、rb1水解酶、β-乳糖苷酶中的一种或几种的混合物。

优选的，步骤(2)的操作如下：以一定速度将反胶团酶溶液自首端泵入逆流色谱分离柱，顺时针方向旋转，调节转速，将空白流动相以一定的流速自尾端进入逆流色谱分离柱，当两相溶剂系统达到流体动力学平衡后，泵入含有人参皂苷底物的流动相溶液，开启检测器，设置分离比，收集流出液。

进一步优选的，上述反胶团酶溶液以25～35ml/min流速泵入。

进一步优选的，调节转速至750～850rmp。

优选的，上述步骤(3)中加入底物的流动相以0.8～4.0ml/min流速进行酶解反应。

优选的，所述反胶团溶剂系统与流动相配置好后需要相互饱和，分离后再泵入逆流色谱中。

优选的，上述底物样品为人参皂苷rb1，所述流动相流速为0.8～4.0ml/min；更进一步优选的，为0.9～3.0ml/min.

经本申请研究发现，当流速为1.0ml/min时，人参皂苷rb1转化率达到100％，当流速为2.0ml/min时，人参皂苷rb1转化率达到98％以上，当流速为3.0ml/min时，人参皂苷rb1转化率达到90％以上，当流速为4.0ml/min时，人参皂苷rb1转化率略低于90％。流动相以0.8～4.0ml/min流速进行酶解反应时，都可以实现良好的转化效果。

优选的，上述底物样品为人参皂苷re，所述流动相流速为0.8～2.5ml/min；更进一步优选的，0.9～2.0ml/min。

本申请研究表明，当流速为1.0ml/min时，人参皂苷re转化为20(s)-rg2，20(r)-rg2，rg6，f4的转化率达到100％，当流速为1.5ml/min时，人参皂苷re转化率达到98％以上，当流速为2.0ml/min时，人参皂苷re转化率达到90％以上，当流速为2.5ml/min时，人参皂苷re转化率低于90％。

优选的，上述底物样品为人参皂苷rg1，所述流动相流速为1～3ml/min；更进一步优选的，1～2.2ml/min。

本申请研究表明，当流速为1.2ml/min时，人参皂苷rg1转化为20(s)-rh1，20(r)-rh1，rk3，rh4的转化率达到100％，当流速为1.5ml/min时，人参皂苷rg1转化率达到98％以上，当流速为2.2ml/min时，人参皂苷rg1转化率达到90％以上，当流速为3.0ml/min时，人参皂苷rg1转化率低于90％。

本发明有益效果

1.现有技术中针对稀有人参皂苷的转化问题，多采用固定化酶反应器、均相反应器，存在产物抑制、膜损伤等技术问题，本申请中采用高速逆流色谱作为酶反应容器，逆流色谱是一组螺旋空管，无内部构件，相的混合和澄清是靠轴向流动和径向周期变化的强离心力产生双向多角度的强烈振荡来实现，调节同步的卫星轮转速可定量增加传质动力学的传递速度，可方便的通过调节仪器参数来改善酶解反应的程度，这是其他生物反应器难以实现的。反应器内无构件，无机械搅拌，对酶和细胞无损伤，有利于保持酶的活性和浓度，且能够方便回收水解酶酶。

2.现有技术中采用酶对人参皂苷进行水解反应时，由于多数酶在有机溶剂中的溶解度不理想，酶的活性被抑制，导致水解反应的效率低下。相关研究表明采用反胶束-酶体系可有效的保护水解酶结构，提高酶活性。本申请中将酶与底物分别置于固定相与流动相中，通过反胶束体系增加酶在固定相中的稳定性，大大提高了酶解反应的效率，人参皂苷的转化率可以达到100％。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

图1本发明的工艺流程图；

图2分离模式对固定相保留率的影响图；

其中，图2(a)及图2(b)表示不同分离模式下的保留率情况，当分离模式不相同时，分离得到的产物也不相同；

图3转速对固定相保留率的影响图；

其中，图3(a)及图3(b)表示不同转速的保留率情况，当转速不相同时，分离得到的产物也不相同；

图4不同流速对产物纯度的影响图；

其中，图4(a)及图4(b)表示不同转速的保留率情况，当流速不相同时，分离得到的产物也不相同。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，现有技术针对人参皂苷转化为稀有人参皂苷，多采用酶膜转化器等，回收困难，并且多数酶难溶于有机溶剂，不利于酶解反应的进行。为了解决如上的技术问题，本申请提供了一种基于反胶团体系的高速逆流色谱反应器，用于稀有人参皂苷的高效生物转化。反胶团溶剂体系能够保护酶的活性，提高在有机介质中的溶解度，提高酶解效率。同时，以高速逆流色谱作为反应器可利用产物与底物分离系数的不同将生成的稀有人参皂苷分离出来，且本申请的制备方法可以实现通过调整转速获得不同的稀有人参皂苷，应用于工业生产具有重要意义。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本申请的技术方案。

实施例1：

1.反胶束溶剂系统的配制及样品溶液的配制

称取一定质量的丁二酸二异辛酯磺酸钠(aot)，曲拉通(triton)x-100，用异辛烷溶解，定容至一定体积，配制成总表面活性剂浓度为0.10mol/l的aot/tritonx-100/异辛烷溶液.用ph值为5的磷酸-磷酸二氢钾缓冲液配制50μmol/l的β-葡萄糖苷酶溶液，在0.10mol/l的aot/tritonx-100/异辛烷反胶束体系中加入一定体积的β-葡萄糖苷酶溶液，以配制一定体积的酶-反胶团体系。将上述酶-反胶团体系用ph值为5的磷酸-磷酸二氢钾缓冲液进行饱和分配，分取上下相。上相为含有酶液的固定相，下加入1.2g/l的人参皂苷rb1底物溶液，取部分空白下相溶液作为初始空白流动相。将上述固定相和流动相使用前放置于40℃水浴锅中，保温待用。

2.逆流色谱生物反应器的运行

首先以30ml/min流速将生物反应器的反胶团酶溶液泵入整个逆流色谱分离柱，充满后启动主机，顺时针方向旋转，流动相自逆流色谱仪的首端泵入，转速调至800rmp，将空白流动相以一定的流速自尾端进入逆流色谱分离柱。当两相溶剂系统达到流体动力学平衡后，泵入含有人参皂苷rb1的底物流动相溶液，开启蒸发光检测器，分离比为16：1，并开启记录仪进行数据采集，流出液收集于10ml试管。

人参皂苷rb1样品经过逆流色谱生物反应器生物转化后，定时取出流出液1ml，氮气吹干，甲醇复溶，0.45μm针头滤器过滤，采用hplc法检测目标峰的转化率。待转化率低于一定纯度时，停止运行，用氮气将分离柱中的液体吹出，并计算固定相保留值(rs)的大小。

3.hplc分析条件

采用hplc检测流出液中底物和产物面积归一化含量。hplc分析条件：waterssymmertryc18色谱柱(4.6×250mm，5μm)；流动相为乙腈(a)和水(b)梯度洗脱，梯度条件为：0-3-7-15-30-31-44-44.5-50分钟，22％-33％-25％-25％-40％-40％-95％-95％-22％-22％b，蒸发光检测器，柱温30℃，进样量10l。

4.逆流色谱生物反应器效果

当流速为1.0ml/min时，人参皂苷rb1转化率达到100％，当流速为2.0ml/min时，人参皂苷rb1转化率达到98％以上，当流速为3.0ml/min时，人参皂苷rb1转化率达到90％以上，当流速为4.0ml/min时，人参皂苷rb1转化率低于90％。液相色谱图见图2。

实施例2：

1.反胶束溶剂系统的配制及样品溶液的配制

称取一定质量的丁二酸二异辛酯磺酸钠(aot)，曲拉通(triton)x-100，用异辛烷溶解，定容至一定体积，配制成总表面活性剂浓度为0.10mol/l的aot/tritonx-100/异辛烷溶液。用ph值为5的磷酸-磷酸二氢钾缓冲液配制50μmol/l的β-葡萄糖苷酶溶液，在0.10mol/l的aot/tritonx-100/异辛烷反胶束体系中加入一定体积的β-葡萄糖苷酶溶液，以配制一定体积的酶-反胶团体系。将上述酶-反胶团体系用ph值为5的磷酸-磷酸二氢钾缓冲液进行饱和分配，分取上下相。上相为含有酶液的固定相，下加入1.5g/l的人参皂苷re底物溶液，取部分空白下相溶液作为初始空白流动相。将上述固定相和流动相使用前放置于40℃水浴锅中，保温待用。

2.逆流色谱生物反应器的运行

首先以30ml/min流速将生物反应器的反胶团酶溶液泵入整个逆流色谱分离柱，充满后启动主机，顺时针方向旋转，流动相自逆流色谱仪的首端泵入，转速调至800rmp，将空白流动相以一定的流速自尾端进入逆流色谱分离柱。当两相溶剂系统达到流体动力学平衡后，泵入含有人参皂苷rb1的底物流动相溶液，开启蒸发光检测器，分离比为16：1，并开启记录仪进行数据采集，流出液收集于10ml试管。

人参皂苷re样品经过逆流色谱生物反应器生物转化后，定时取出流出液1ml，氮气吹干，甲醇复溶，0.45μm针头滤器过滤，采用hplc法检测目标峰的转化率。待转化率低于一定纯度时，停止运行，用氮气将分离柱中的液体吹出，并计算固定相保留值(rs)的大小。

3.hplc分析条件

采用hplc检测流出液中染料木素和染料木素的面积归一化含量。hplc分析条件：waterssymmertryc18色谱柱(4.6×250mm，5μm)；流动相为乙腈(a)和水(b)梯度洗脱，梯度条件为：0-3-7-15-30-31-44-44.5-50分钟，22％-33％-25％-25％-40％-40％-95％-95％-22％-22％b，蒸发光检测器，柱温30℃，进样量10l。

4.逆流色谱生物反应器效果

当流速为1.0ml/min时，人参皂苷re转化为20(s)-rg2，20(r)-rg2，rg6，f4的转化率达到100％，当流速为1.5ml/min时，人参皂苷re转化率达到98％以上，当流速为2.0ml/min时，人参皂苷re转化率达到90％以上，当流速为2.5ml/min时，人参皂苷re转化率低于90％。液相色谱图见图3。

实施例3：

1.反胶束溶剂系统的配制及样品溶液的配制

称取一定质量的丁二酸二异辛酯磺酸钠(aot)，曲拉通(triton)x-100，用异辛烷溶解，定容至一定体积，配制成总表面活性剂浓度为0.10mol/l的aot/tritonx-100/异辛烷溶液.用ph值为5的磷酸-磷酸二氢钾缓冲液配制50μmol/l的β-葡萄糖苷酶溶液，在0.10mol/l的aot/tritonx-100/异辛烷反胶束体系中加入一定体积的β-葡萄糖苷酶溶液，以配制一定体积的酶-反胶团体系。将上述酶-反胶团体系用ph值为5的磷酸-磷酸二氢钾缓冲液进行饱和分配，分取上下相。上相为含有酶液的固定相，下加入1.0g/l的人参皂苷rg1底物溶液，取部分空白下相溶液作为初始空白流动相。将上述固定相和流动相使用前放置于40℃水浴锅中，保温待用。

2.逆流色谱生物反应器的运行

首先以30ml/min流速将生物反应器的反胶团酶溶液泵入整个逆流色谱分离柱，充满后启动主机，顺时针方向旋转，流动相自逆流色谱仪的首端泵入，转速调至800rmp，将空白流动相以一定的流速自尾端进入逆流色谱分离柱。当两相溶剂系统达到流体动力学平衡后，泵入含有人参皂苷rb1的底物流动相溶液，开启蒸发光检测器，分离比为16：1，并开启记录仪进行数据采集，流出液收集于10ml试管。

人参皂苷rg1样品经过逆流色谱生物反应器生物转化后，定时取出流出液1ml，氮气吹干，甲醇复溶，0.45μm针头滤器过滤，采用hplc法检测目标峰的转化率。待转化率低于一定纯度时，停止运行，用氮气将分离柱中的液体吹出，并计算固定相保留值(rs)的大小。

3.hplc分析条件

采用hplc检测流出液中染料木素和染料木素的面积归一化含量。hplc分析条件：waterssymmertryc18色谱柱(4.6×250mm，5μm)；流动相为乙腈(a)和水(b)梯度洗脱，梯度条件为：0-3-7-15-30-31-44-44.5-50分钟，22％-33％-25％-25％-40％-40％-95％-95％-22％-22％b，蒸发光检测器，柱温30℃，进样量10l。

4.逆流色谱生物反应器效果

当流速为1.2ml/min时，人参皂苷rg1转化为20(s)-rh1，20(r)-rh1，rk3，rh4的转化率达到100％，当流速为1.5ml/min时，人参皂苷rg1转化率达到98％以上，当流速为2.2ml/min时，人参皂苷rg1转化率达到90％以上，当流速为3.0ml/min时，人参皂苷rg1转化率低于90％。液相色谱图见图3。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。