一种具有细胞粘附功能的可发光胶原多肽-镧系金属复合纳米材料的制备方法与流程

本发明涉及一种具有细胞粘附功能的可发光胶原多肽-镧系金属复合纳米材料的制备方法，属于生物纳米材料制备技术领域。

背景技术：

纳米技术是指在0.1-100纳米的尺度里，研究电子、原子和分子运动规律的特性以及对物质和材料进行处理的技术被称为纳米技术。

纳米材料与生物体在尺寸上有着密切的关系。例如，构成生命要素之一的核糖核酸蛋白质复合体的线度在15-20nm之间，生物体内各种病毒的尺寸也在纳米尺度范围。纳米生物医用材料就是纳米材料与生物医用材料的交叉，将纳米微粒与其他材料相复合制成各种各样的复合材料。随着研究的进一步深入和技术的发展,纳米材料开始与许多学科相互渗透，显示出巨大的潜在应用价值，并且已经在一些领域获得了初步的应用。在过去几年中，生物纳米材料的理论与实验研究已成为人们关注的焦点，特别是核酸与蛋白质的生化、生物物理、生物力学、热力学与电磁学特征及其智能复合材料已成为生命科学与材料科学的交叉前沿。

胶原蛋白是人体中含量最丰富的蛋白质，是细胞外基质的主要组成部分。胶原蛋白具有完美的(gly-x-y)n重复氨基酸序列和经典的三重螺旋结构，它在皮肤、骨骼、肌腱等结缔组织中扮演着一个生物支架的关键角色，为哺乳动物提供机械强度和结构完整性。胶原蛋白由于其良好的生物学性能和特殊的结构特征，在再生医学和组织工程领域得到广泛的关注和应用。因此，胶原蛋白仿生多肽的设计，在构建新型生物功能材料方面有很多潜在的应用。

目前已经构建多种策略来制备胶原多肽纳米材料，包括：半胱氨酸修饰的多肽、静电相互作用、π-π堆积作用、阳离子-π相互作用、金属配位作用、两亲性多肽、成核现象以及疏水作用等；制备的胶原多肽纳米材料呈现微丝状、网状、微型管、空心球、纳米盘、纳米片等各种微观结构。但是，目前的研究大多局限于仿生胶原蛋白的微观结构，可仿生胶原蛋白功能的自组装多肽还非常缺乏。本发明构建的胶原多肽，具有能结合细胞的功能序列，在镧系金属离子的介导下自组装形成纳米纤维材料，表现出良好的细胞粘附功能，在组织工程等领域具有巨大潜力。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提出了一种具有细胞粘附功能的可发光胶原多肽-镧系金属复合纳米材料的制备方法。特殊设计的胶原多肽在镧系金属离子的介导下，在广泛的ph条件下，自组装形成和天然胶原蛋白具有类似微观结构和生物功能的纳米纤维材料。

本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：

本发明的本实施例的一种具有细胞粘附功能的可发光胶原多肽-镧系金属复合纳米材料的制备方法，包括如下步骤：

(1)胶原多肽的设计

设计氨基酸序列的胶原多肽，包括:设计富含(gly-pro-hyp)n或(gly-pro-pro)n序列，使得多肽形成三重螺旋结构；设计包含天然胶原蛋白中调控细胞粘附功能的序列；设计多肽两端以及多肽中间的1-3个位置的氨基酸为天冬氨酸或谷氨酸，使得该位置的天冬氨酸或谷氨酸与镧系金属精确配位；

(2)胶原多肽的合成

将步骤(1)设计好的胶原多肽采用fmoc固相合成法，利用手动合成仪逐步合成，合成步骤为：a、树脂处理溶胀；b、活化氨基酸；c、缩合反应；d、α-氨基脱保护；e、延伸肽树脂；f、切割肽树脂；g、肽的分离纯化；

(3)胶原多肽-镧系金属复合纳米材料的制备

配制浓度为1-100mg/ml的胶原多肽溶液、浓度为1-100mg/ml的不同镧系金属的硝酸盐溶液，将其混合后，在25℃的恒温箱里放置反应1-48hrs，将得到的反应产物在8000rpm下进行固液分离，得到固体沉淀；

(4)复合纳米材料的发光性质

将上述步骤(3)得到的固体沉淀放入25℃的恒温培养箱烘干24-96hrs，得到干燥的胶原多肽-镧系金属复合纳米材料；利用荧光光谱仪检测该固体样品的激发波长和发射波长；

(5)复合纳米材料的细胞粘附功能

将上述步骤(3)得到的固体沉淀分散于无水乙醇中，得到固含量为1-10mg/ml的悬浮溶液，将悬浮溶液滴至96微孔板中，使其完全干燥，用pbs洗涤三次，加入100μl无血清dmem或mem培养基的细胞悬液，在37℃孵育3-6小时，用pbs或是生理盐水轻轻洗涤96微孔板2-3次，将96微孔板中加入超纯水冷冻-融化循环三次，进行裂解细胞；然后加入工作浓度为5μg/mlhoechst33258染料避光培养1h，最后用酶标仪测定荧光强度。

所述步骤(1)中的包含天然胶原蛋白中调控细胞粘附功能的序列，为6肽序列gxyger,其中，g为甘氨酸，x和y为任意氨基酸，e为谷氨酸，r为精氨酸。

步骤(3)中所述镧系金属元素为镧、铈、镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱、镥中的至少一种。

步骤(5)中无血清dmem或mem培养基的细胞悬液的浓度为10*10⁵cells/ml；超纯水冷冻的冷冻温度为-85℃～-75℃，酶标仪测定荧光强度过程的激发波长355-365nm，发射波长460-470nm左右。

本发明制备的胶原多肽-镧系金属复合纳米材料，因胶原多肽中包含天然胶原蛋白中调控细胞粘附功能的序列gxyger，因此赋予该复合纳米材料良好的细胞粘附性能；因多肽两端以及多肽中间的1-3个位置的氨基酸为天冬氨酸或谷氨酸，使得该位置的天冬氨酸或谷氨酸与镧系金属精确配位，从而诱导该多肽自组装形成与天然胶原蛋白类似的纤维结构。因此，该胶原多肽-镧系金属复合纳米材料可以很好的仿生天然胶原蛋白的微观结构和生物功能。同时，因镧系元素具备良好的发光性质，因此赋予该复合纳米材料良好的光学性能。本发明制备的胶原多肽-镧系金属复合纳米材料，只需将胶原多肽和镧系元素的水溶液按一定比例在室温条件下简单混合即可制备，制备工艺无有毒有害物质，非常绿色环保，并且稳定性好，重复制备成功率高。

本发明的有益效果是

1.制备的胶原多肽-镧系金属复合纳米材料具有良好的细胞粘附性能；

2.胶原多肽-镧系金属复合纳米材料很好的仿生天然胶原蛋白的微观纤维结构；

3.胶原多肽-镧系金属复合纳米材料具有良好的发光性质；

4.制备工艺绿色环保，条件温和，稳定性好。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。

图1为胶原多肽1-镧系金属复合纳米材料的扫描和透射电子显微镜图；

图2为胶原多肽1-镧系金属复合纳米材料的荧光发射光谱图；

图3为胶原多肽1-镧系金属复合纳米材料的hela细胞粘附图；

图4为胶原多肽2-镧系金属复合纳米材料的扫描和透射电子显微镜图；

图5为胶原多肽2-镧系金属复合纳米材料的hela细胞粘附图。

具体实施方式

以下将结合附图对本发明进行详细说明，为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。如图1-图5所示，一种具有细胞粘附功能的可发光胶原多肽-镧系金属复合纳米材料的制备方法，包括如下步骤：

(1)胶原多肽的设计

设计氨基酸序列的胶原多肽，包括:设计富含(gly-pro-hyp)n或(gly-pro-pro)n序列，使得多肽形成三重螺旋结构；设计包含天然胶原蛋白中调控细胞粘附功能的序列；设计多肽两端以及多肽中间的1-3个位置的氨基酸为天冬氨酸或谷氨酸，使得该位置的天冬氨酸或谷氨酸与镧系金属精确配位；

(2)胶原多肽的合成

将步骤(1)设计好的胶原多肽采用fmoc固相合成法，利用手动合成仪逐步合成，合成步骤为：a、树脂处理溶胀；b、活化氨基酸；c、缩合反应；d、α-氨基脱保护；e、延伸肽树脂；f、切割肽树脂；g、肽的分离纯化；

(3)胶原多肽-镧系金属复合纳米材料的制备

配制浓度为1-100mg/ml的胶原多肽溶液、浓度为1-100mg/ml的不同镧系金属的硝酸盐溶液，将其混合后，在25℃的恒温箱里放置反应1-48hrs，将得到的反应产物在8000rpm下进行固液分离，得到固体沉淀；

(4)复合纳米材料的发光性质

将上述步骤(3)得到的固体沉淀放入25℃的恒温培养箱烘干24-96hrs，得到干燥的胶原多肽-镧系金属复合纳米材料；利用荧光光谱仪检测该固体样品的激发波长和发射波长；

(5)复合纳米材料的细胞粘附功能

将上述步骤(3)得到的固体沉淀分散于无水乙醇中，得到固含量为1-10mg/ml的悬浮溶液，将悬浮溶液滴至96微孔板中，使其完全干燥，用pbs洗涤三次，加入100μl无血清dmem或mem培养基的细胞悬液，在37℃孵育3-6小时，用pbs或是生理盐水轻轻洗涤96微孔板2-3次，将96微孔板中加入超纯水冷冻-融化循环三次，进行裂解细胞；然后加入工作浓度为5μg/mlhoechst33258染料避光培养1h，最后用酶标仪测定荧光强度。

所述步骤(1)中的包含天然胶原蛋白中调控细胞粘附功能的序列，为6肽序列gxyger,其中，g为甘氨酸，x和y为任意氨基酸，e为谷氨酸，r为精氨酸。

步骤(3)中所述镧系金属元素为镧、铈、镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱、镥中的至少一种。

步骤(5)中无血清dmem或mem培养基的细胞悬液的浓度为10*10⁵cells/ml；超纯水冷冻的冷冻温度为-85℃～-75℃，酶标仪测定荧光强度过程的激发波长355-365nm，发射波长460-470nm左右。

实施例1

(1)胶原多肽的设计

设计的胶原多肽序列为dd(gpo)3gdogpogfogergpogdo(gpo)3dd。

(2)胶原多肽的合成

设计好的胶原多肽采用fmoc固相合成法，利用手动合成仪逐步合成的方式合成，包括：a、树脂处理溶胀；b、活化氨基酸；c、缩合反应；d、α-氨基脱保护；e、延伸肽树脂；f、切割肽树脂；g、肽的分离纯化。

(3)胶原多肽-镧系金属复合纳米材料的制备

配制浓度为50mg/ml的胶原多肽溶液；配置浓度为50mg/ml的不同镧系金属的硝酸盐溶液；然后混合；将上述混合溶液在25℃的恒温箱里放置24hrs；将反应产物在8000rpm下进行固液分离，得到固体沉淀。

该胶原多肽-镧系金属复合纳米材料的扫描和透射电子显微镜图，如图1所示，呈现有序的纳米纤维结构。

(4)复合纳米材料的发光性质

将上述步骤(3)得到的固体沉淀放入25℃的恒温培养箱烘干48hrs，得到干燥的胶原多肽-镧系金属复合纳米材料；利用荧光光谱仪检测该固体样品的激发波长和发射波长；

该胶原多肽-镧系金属复合纳米材料的荧光发射光谱图，如图2所示，具有良好的发光性能。

(5)复合纳米材料的细胞粘附功能

将上述(3)步骤得到的固体复合纳米材料分散于无水乙醇中，得到终浓度为5mg/ml的悬浮溶液；将悬浮溶液滴至96微孔板中，使其完全干燥。用pbs洗涤三次；加入100μl无血清dmem或mem培养基的细胞悬液(10*10⁵cells/ml),在37℃孵育5小时；用pbs或是生理盐水轻轻洗涤96微孔板3次；将96微孔板中加入超纯水冷冻(-80℃)-融化循环三次，进行裂解细胞；然后加入工作浓度为5μg/mlhoechst33258染料避光培养1h；最后用酶标仪测定荧光强度(激发波长360nm，发射波长465nm)。

该胶原多肽-镧系金属复合纳米材料的hela细胞粘附图，如图3所示，具有良好的细胞粘附性能。

实施例2

(1)胶原多肽的设计

设计的胶原多肽序列为ee(gpo)3geogpogfogergpogeo(gpo)3ee。

(2)胶原多肽的合成

设计好的胶原多肽采用fmoc固相合成法，利用手动合成仪逐步合成的方式合成，包括：a、树脂处理溶胀；b、活化氨基酸；c、缩合反应；d、α-氨基脱保护；e、延伸肽树脂；f、切割肽树脂；g、肽的分离纯化。

(3)胶原多肽-镧系金属复合纳米材料的制备

配制浓度为100mg/ml的胶原多肽溶液；配置浓度为100mg/ml的不同镧系金属的硝酸盐溶液；然后混合；将上述混合溶液在25℃的恒温箱里放置36hrs；将反应产物在8000rpm下进行固液分离，得到固体沉淀。

该胶原多肽-镧系金属复合纳米材料的扫描和透射电子显微镜图，如图4所示，呈现有序的纳米纤维结构。

(4)复合纳米材料的发光性质；

将上述步骤(3)得到的固体沉淀放入25℃的恒温培养箱烘干48hrs，得到干燥的胶原多肽-镧系金属复合纳米材料；利用荧光光谱仪检测该固体样品的激发波长和发射波长；

(5)复合纳米材料的细胞粘附功能。

将上述(3)步骤得到的固体复合纳米材料分散于无水乙醇中，得到终浓度为8mg/ml的悬浮溶液；将悬浮溶液滴至96微孔板中，使其完全干燥。用pbs洗涤三次；加入100μl无血清dmem或mem培养基的细胞悬液(10*10⁵cells/ml),在37℃孵育5小时；用pbs或是生理盐水轻轻洗涤96微孔板3次；将96微孔板中加入超纯水冷冻(-80℃)-融化循环三次，进行裂解细胞；然后加入工作浓度为5μg/mlhoechst33258染料避光培养1h；最后用酶标仪测定荧光强度(激发波长360nm，发射波长465nm)。

该胶原多肽-镧系金属复合纳米材料的hela细胞粘附图，如图5所示，具有良好的细胞粘附性能。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。