一种可显著增强细胞ABCC1基因表达的基因ZSWa的制作方法

本发明涉及一种可显著增强细胞abcc1基因表达的基因zswa，属于基因工程技术领域。

背景技术：

abcc1基因是abc(atpbindingcassette,abc)跨膜转运蛋白家族成员之一(sodanikandpatela，2012)。蛋白广泛存在于多种肿瘤组织中，相对分子质量为190kd，位于人第16号染色体p13.1，该蛋白主要分布于细胞膜和内膜系统，运用atp结合/水解产生的能量，行使转运功能(kimhsandleejh，2015)。abcc1能将细胞内药物排出细胞外，降低细胞内药物浓度，使细胞内的药物浓度低于杀死细胞的临界值，并使细胞内药物重新分布。其具体机制为：①abcc1直接参与将药物主动转入亚细胞器或间接影响药物分布，降低药物核质分布比率以降低核内药物浓度，降低药物对dna靶点的绝对浓度；②通过形成cl-通道或改变通道活性而改变细胞质或细胞器内的ph值，细胞器内ph值相对降低将导致在酸性环境中质子化的药物大量外排；③通过囊泡转运和胞吐作用将药物排出细胞外；④使药物活性成分脱离其作用部位(sodanikandpatela，2012)。早期生长反应-1(earlygrowthresponse,egr1)是一种重要的核转录因子(karthikkeyangandnagarajnr，2018)，广泛存在斑马鱼、小鼠及人的细胞核中。在调控细胞的生长、分化、发育、增殖等方面发挥着重要的作用。egr1基因定位于5q31长2.1kb，编码3.3kb成熟的mrna。egr1基因启动子区针对不同转录因子的反应元件，camp反应元件，ap1结合部位、sp1共有序列、egr1自身结合部位(朱涛涛，2013)、转录激活因子5结合部位等结构的dna结构域是含有3个cyc2-his2锌指结构的转录因子(韩雷，2007)，在锌离子存在的条件下，锌指结构与dna序列中富含gc区结合，发挥转录调控作用。因此，egr1可作为转录因子调控诸多靶基因的表达。因此如何改造一个可显著增强细胞abcc1基因表达的基因zswa成为急需解决的一大难题，所以一种可显著增强细胞abcc1基因表达的基因zswa利用对a549/ddp细胞进行总rna提取后反转录为cdna，在ncbi网站上找到egr1基因的cds区所对应的mrna序列，根据引物设计原则设计引物，分别在上下游加上hindⅲ和ecorⅰ酶切位点，通过pcr扩增egr1基因cds区，然后对egr1基因的cds区的1500,1503,1506位点进行突变，酶切pcdna3.1(+)载体，连接目的片段与pcdna3.1(+)；重组载体转化、检测与鉴定后将其命名为pcdna3.1-zswa；突变信息如下：1500的a突变为g；1503的c突变为a；1506的g突变为a。然后，分别通过qrt-pcr和westernblot法检测zswa和abcc1基因mrna和蛋白的表达水平；qrt-pcr结果显示，过表达zswa后，abcc1基因表达也随之升高，差异显著。westernblot结果与qrt-pcr结果趋势一致，结果表明，zswa基因可正向调控abcc1基因的表达，发明一种可显著增强肺癌abcc1基因表达的基因zswa是必要的。

技术实现要素：

为了克服如何构建一个可显著增强细胞abcc1基因表达的基因zswa的难题，本发明提供了一种可显著增强细胞abcc1基因表达的基因zswa，该种一种可显著增强细胞abcc1基因表达的基因zswa利用对a549/ddp细胞进行总rna提取后反转录为cdna，在ncbi网站上找到egr1基因的cds区所对应的mrna序列，根据引物设计原则设计引物，分别在上下游加上hindⅲ和ecorⅰ酶切位点，通过pcr扩增egr1基因cds区，然后对egr1基因的cds区的1500,1503,1506位点进行突变，酶切pcdna3.1(+)载体，连接目的片段与pcdna3.1(+)；重组载体转化、检测与鉴定后将其命名为pcdna3.1-zswa；突变信息如下：1500的a突变为g；1503的c突变为a；1506的g突变为a。其核苷酸序列如seqidno:1所示；然后，分别通过qrt-pcr和westernblot法检测zswa和abcc1基因mrna和蛋白的表达水平；qrt-pcr结果显示，过表达zswa后，abcc1基因表达也随之升高，差异显著。westernblot结果与qrt-pcr结果趋势一致，结果表明，zswa基因可正向调控abcc1基因的表达。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

本发明一种可显著增强细胞abcc1基因表达的基因zswa，具体方案如下：

1.a549/ddp细胞复苏和培养

1.1细胞复苏：(1)液氮中取出冻存细胞，在37℃水浴锅内摇晃，至其全部融化；(2)缓慢滴入含5ml1640培养基的离心管中，1000g离心5min，弃上清；(3)用5ml1640完全培养基悬浮细胞沉淀，移至细胞瓶，37℃、5％co2培养箱内培养细胞。

1.2细胞传代(待细胞汇合度至90％时进行传代培养)：(1)弃原瓶内培养基，用5mlpbs轻轻洗涤细胞2遍；(2)加入1ml0.25％胰酶消化细胞，镜下观察，待60％的贴壁细胞皱缩成亮点形态，加入完全培养基终止消化并反复吹打使其从壁上脱落；(3)向细胞悬液中加入10ml完全培养基吹匀后，分别取出5ml加入两个新瓶中，37℃、5％co2培养箱内培养细胞。从图2可以看到：细胞为贴壁生长，a549/ddp呈多边形，细胞生长状态良好。

2.基因zswa对abcc1基因表达的调控

2.1egr1过表达载体的构建：根据ncbigenebank中已知的egr1基因的序列(geneid：1958)，查找egr1基因的cds区，采用primer5.0分析egr1基因的cds区和pcdna3.1(+)载体可使用的酶切位点，并设计特异性扩增引物，引物序列：egr1-f：cccaagcttatggccgcggccaag；egr1-r：ccggaattcttagcaaatttcaattg，以人cdna为模板进行pcr扩增，在其上游引物5’端加上hindⅲ酶切位点，3’端加ecorⅰ酶切位点。经琼脂糖凝胶电泳检测后，对pcr产物进行纯化回收，并定向插入到pcdna3.1(+)载体中，经双酶切及测序鉴定确定其准确性后，将其命名为pcdna3.1-egr1。

2.2载体zswa的构建：根据ncbigenebank中已知的egr1基因的序列(geneid：1958)，查找egr1基因的cds区，采用primer5.0分析egr1基因的cds区和pcdna3.1(+)载体可使用的酶切位点，并设计特异性扩增引物，引物序列见表1，以pcdna3.1-egr1为模板进行pcr扩增，在其上游引物5’端加上hindⅲ酶切位点，3’端加ecorⅰ酶切位点。然后对egr1基因的cds区的1500,1503,1506位点进行突变，经琼脂糖凝胶电泳检测后，对pcr产物进行纯化回收，并定向插入到pcdna3.1(+)载体中，经双酶切及测序鉴定确定其准确性后，将其命名为pcdna3.1-zswa。突变信息如下：1500的a突变为g；1503的c突变为a；1506的g突变为a。

2.3pei转染：(1)将汇合度达到90％的细胞接种到24孔板中，换为不含双抗的培养基继续培养；(2)待24孔板中细胞生长至60％左右时进行转染；将培养基换为无血清的1640培养基；(3)根据实验组数准备2倍的1.5mlep管，每管加入25μlopti-dmem，向其中一半加入2μlpei，另一半加入pcdna3.1-zswa，室温孵育5min；(4)将含有pei的opti-dmem孵育液与含有质粒的opti-dmem孵育液混合到一个1.5mlep管内，室温孵育20min；(5)将混合液均匀滴加至每个细胞培养孔中，轻轻混匀，细胞培养箱中培养4h后，将培养基换为1640完全培养基，继续培养48h。

2.4qrt-pcr检测zswa和abcc1基因mrna的表达水平

2.4.1细胞总rna提取：(1)收集实验组细胞，加入1mltrizolreagent，混匀，室温静置30min；(2)加入0.2ml氯仿，剧烈震荡30s，室温放置3min，12000r/min，4℃离心10min；(3)吸去上层水相转移至干净的离心管中，加入1/2倍体积无水乙醇，混匀；并将溶液转移至吸附柱中，室温静置2min，12000r/min，4℃离心3min，弃收集管中液体；(4)加入500μlrpesolution，静止2min，10000r/min，4℃离心30s，倒掉收集管中液体，重复一次；(5)将吸附柱放回收集管中，10000r/min，4℃离心2min；(6)将吸附柱放入depc处理的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入30μldepc-treatedddh2o，室温静止5min，12000r/min，4℃离心2min；(7)采用nanodrop2000cspectrophotometer测定总rna浓度。

2.4.2反转录cdna：根据反转录试剂盒说明书，采用两步法将已获得的totalrna反转录为cdna。(1)按下列体系反转录：totalrnaorpoly(a)rna，0.2—2μg；oligo(dt)orrandomprimer(50μm)，1μl；dntpmixture(10mmeach)，1μl；rnasefreeh2o，upto14μl。(2)在pcr仪上进行以下反应：65℃，5min，然后置于冰上急冷。(3)反转录第二步反应是在上述pcr管中按下列加入反转录反应液(20μl体系)：上述变性、退火后反应液，14μl；5*first-strandbuffer，4μl；m-mulvreversetranscriptase(200u/μl)，1μl；rnaseinhibitor，1μl。(4)在pcr仪上按以下条件进行反转录反应：45℃，60min；70℃，10min；-20℃保存。

2.4.3qrt-pcr检测：(1)反应体系：cdna，1μl；senseprimer，0.4μl；anti-senseprimer，0.4μl；2×mix，10μl；rox，0.4μl；ddh2o，7.8μl。将所得cdna用power2×sybrreal-timepcrpremixture试剂盒进行realtimepcr，反应体系为20μl。(2)反应条件为：95℃2min，40×(95℃15s，60℃40s)，95℃15s，60℃1min；循环结束后进行溶解曲线检测。数据以2^-δδct法进行计算。

2.4.4westernblot检测zswa和abcc1蛋白表达水平

2.4.4.1细胞全蛋白提取：(1)收集实验组细胞沉淀至1.5ml离心管，加300μl蛋白裂解液，置于4℃摇床上30min；(2)12000g离心20min，取上清至新的1.5ml离心管，-80℃保存。

2.4.4.2westernblot：(1)将提取的蛋白样品与上样缓冲液按照4：1的比例混合，沸水中煮5～10min，待其降至室温，分装-20℃保存或继续实验。(2)安装胶板，并按照下列体系配制分离胶：水，8.2ml；30％丙烯酰胺，6.6ml；10％sds，0.2ml；tris-cl(ph8.8)，5ml；10％aps，200μl；temed，20μl。(3)将分离胶注入两层玻璃板中，加入适当位置后，滑动枪头加入异丙醇，至液面溢出。(4)待胶凝后，倒出异丙醇，并用滤纸吸净残余异丙醇。(5)按下列比例配制浓缩胶：水，5.7ml；30％丙烯酰胺，1.7ml；10％sds，0.1ml；tris-cl(ph6.8)，2.5ml；10％aps，200μl；temed，20μl。将浓缩胶注入两层玻璃板中，至液面溢出，插入梳子。(6)待胶凝后，拔出梳子，与电泳槽组装，加入电泳液。(7)点样：实验组蛋白样品为30μl蛋白样品，marker上样量为10μl；设置电源电压为100v，待溴酚蓝到达底端时停止电泳。(8)取出胶板，按照marker指示留目的条带附近的胶。(9)将留下的胶浸泡在转移液中，并准备稍大于胶的滤纸(四层)和pvdf膜(甲醇浸泡30sec)。(10)按下列顺序摆放：海绵→滤纸→胶→pvdf膜→滤纸→海绵(放置时避免产生气泡)。(11)将组装好的夹板置于转印槽中，倒入转移液，接通电源，电流设置为300ma左右，功率要小于40w，时间为90min。(12)待转印结束，取出pvdf膜，放置于立春红染色液中，摇床上染色5min。(13)冲洗pvdf膜，根据maker指示和目的条带的蛋白大小，剪膜，置于5％脱脂奶粉配制的封闭液中，室温孵育1h。(14)倒掉封闭液，一抗孵育(1：300)，置于4℃摇床摇孵育过夜。(15)回收一抗，pbst洗膜10min，三次。(16)弃去pbst，二抗孵育(1：10000)，置于4℃摇床孵育1h。(17)回收二抗，pbst洗膜10min，三次。(18)odyssey双红外激光成像系统检测蛋白条带变化。

2.5基因zswa对abcc1基因表达的调控结果

qrt-pcr结果显示，过表达zswa后，abcc1基因表达也随之升高，差异显著。westernblot结果与qrt-pcr结果趋势一致，结果表明，zswa基因可正向调控abcc1基因的表达，过表达zswa后zswa和abcc1基因表达的变化详见图4和图5。

本发明的有益效果为，一种可显著增强细胞abcc1基因表达的基因zswa利用对a549/ddp细胞进行总rna提取后反转录为cdna，在ncbi网站上找到egr1基因的cds区所对应的mrna序列，根据引物设计原则设计引物，分别在上下游加上hindⅲ和ecorⅰ酶切位点，通过pcr扩增egr1基因cds区，然后对egr1基因的cds区的1500,1503,1506位点进行突变，酶切pcdna3.1(+)载体，连接目的片段与pcdna3.1(+)；重组载体转化、检测与鉴定后将其命名为pcdna3.1-zswa；突变信息如下：1500的a突变为g；1503的c突变为a；1506的g突变为a。，其核苷酸序列如seqidno:1所示；然后，分别通过qrt-pcr和westernblot法检测zswa和abcc1基因mrna和蛋白的表达水平；qrt-pcr结果显示，过表达zswa后，abcc1基因表达也随之升高，差异显著。westernblot结果与qrt-pcr结果趋势一致，结果表明，zswa基因可正向调控abcc1基因的表达。

附图说明

下面结合附图对本发明进一步说明。

图1为本发明一种可显著增强细胞abcc1基因表达的基因zswa的zswa基因的碱基序列图。

图2为本发明一种可显著增强细胞abcc1基因表达的基因zswa的普通光学显微镜下观察a549/ddp细胞状态图。

图3为本发明一种可显著增强细胞abcc1基因表达的基因zswa的pcdna3.1-zswa过表达质粒图。

图4为本发明一种可显著增强细胞abcc1基因表达的基因zswa的zswa和abcc1基因mrna表达变化图。

图5为本发明一种可显著增强细胞abcc1基因表达的基因zswa的zswa和abcc1基因蛋白表达变化图。

具体实施方式

实施例一：

如图所示，本发明一种可显著增强细胞abcc1基因表达的基因zswa实验方法及结果如下：

1.a549/ddp细胞复苏和培养

1.1细胞复苏

(1)液氮中取出冻存细胞，在37℃水浴锅内摇晃，至其全部融化；

(2)缓慢滴入含5ml1640培养基的离心管中，1000g离心5min，弃上清；

(3)用5ml1640完全培养基悬浮细胞沉淀，移至细胞瓶，37℃、5％co2培养箱内培养细胞。

1.2细胞传代(待细胞汇合度至90％时进行传代培养)

(1)弃原瓶内培养基，用5mlpbs轻轻洗涤细胞2遍；

(2)加入1ml0.25％胰酶消化细胞，镜下观察，待60％的贴壁细胞皱缩成亮点形态，加入完全培养基终止消化并反复吹打使其从壁上脱落；

(3)向细胞悬液中加入10ml完全培养基吹匀后，分别取出5ml加入两个新瓶中，37℃、5％co2培养箱内培养细胞。

从图2可以看到：细胞为贴壁生长，a549/ddp呈多边形，细胞生长状态良好。

2.基因zswa对abcc1基因表达的调控

2.1egr1过表达载体的构建

根据ncbigenebank中已知的egr1基因的序列(geneid：1958)，查找egr1基因的cds区，采用primer5.0分析egr1基因的cds区和pcdna3.1(+)载体可使用的酶切位点，并设计特异性扩增引物，引物序列见表1，以人cdna为模板进行pcr扩增，在其上游引物5’端加上hindⅲ酶切位点，3’端加ecorⅰ酶切位点。经琼脂糖凝胶电泳检测后，对pcr产物进行纯化回收，并定向插入到pcdna3.1(+)载体中，经双酶切及测序鉴定确定其准确性后，将其命名为pcdna3.1-egr1。

表1cds扩增引物

2.2过表达突变载体zswa的构建

(1)根据ncbigenebank中已知的egr1基因的序列(geneid：1958)，查找egr1基因的cds区，采用primer5.0分析egr1基因的cds区和pcdna3.1(+)载体可使用的酶切位点，并设计特异性扩增引物，引物序列见表1，以人pcdna3.1-egr1为模板进行pcr扩增，在其上游引物5’端加上hindⅲ酶切位点，3’端加ecorⅰ酶切位点。然后对egr1基因的cds区的1500,1503,1506位点进行突变，酶切pcdna3.1(+)载体，连接目的片段与pcdna3.1(+)；重组载体转化、检测与鉴定后将其命名为pcdna3.1-zswa；突变信息如下：1500的a突变为g；1503的c突变为a；1506的g突变为a。

2.3pei转染

(1)将汇合度达到90％的细胞接种到6孔板中，换为不含双抗的培养基继续培养；

(2)待6孔板中细胞生长至60％左右时进行转染；将培养基换为无血清的1640培养基；

(3)根据实验组数准备2倍的1.5mlep管，每管加入100μlopti-dmem，向其中一半加入2μlpei，另一半加入pcdna3.1-zswa，室温孵育5min。

(4)将含有pei的opti-dmem孵育液与含有质粒的opti-dmem孵育液混合到一个1.5mlep管内，室温孵育20min。

(5)将混合液均匀滴加至每个细胞培养孔中，轻轻混匀，细胞培养箱中培养4h后，将培养基换为1640完全培养基，继续培养48h。

2.4qrt-pcr检测zswa和abcc1基因mrna的表达水平

2.4.1细胞总rna提取

(1)收集实验组细胞，加入1mltrizolreagent，混匀，室温静置30min，

(2)加入0.2ml氯仿，剧烈震荡30s，室温放置3min，12000r/min，4℃离心10min；

(3)吸去上层水相转移至干净的离心管中，加入1/2倍体积无水乙醇，混匀；并将溶液转移至吸附柱中，室温静置2min，12000r/min，4℃离心3min，弃收集管中液体；

(4)加入500μlrpesolution，静止2min，10000r/min，4℃离心30s，倒掉收集管中液体，重复一次；

(5)将吸附柱放回收集管中，10000r/min，4℃离心2min；

(6)将吸附柱放入depc处理的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入30μldepc-treatedddh2o，室温静止5min，12000r/min，4℃离心2min；

(7)采用nanodrop2000cspectrophotometer测定总rna浓度。

2.4.2反转录cdna

根据反转录试剂盒说明书，采用两步法将已获得的totalrna反转录为cdna。

(1)按照表2体系反转录

表2反转录体系

(2)在pcr仪上进行以下反应：65℃，5min，然后置于冰上急冷

(3)在上述pcr管中按表3加入反转录反应液(20μl体系)。

表3反转录第二步

(4)在pcr仪上按以下条件进行反转录反应：45℃，60min；70℃，10min；-20℃保存。

2.4.3qrt-pcr检测

(1)表4反应体系将所得cdna用power2×sybrreal-timepcrpremixture试剂盒进行realtimepcr，反应体系为20μl。

表4qrt-pcr反应体系

(2)反应条件为：95℃2min，40×(95℃15s，60℃40s)，95℃15s，60℃1min；循环结束后进行溶解曲线检测。数据以2^-δδct法进行计算。

2.5westernblot检测zswa和abcc1蛋白表达水平

2.5.1细胞全蛋白提取

(1)收集实验组细胞沉淀至1.5ml，加300μl蛋白裂解液，置于4℃摇床上30min；

(2)12000g离心20min，取上清至新的1.5ml离心管，-80℃保存。

2.5.2westernblot

(1)将提取的蛋白样品与上样缓冲液按照4：1的比例混合，沸水中煮5～10min，待其将至室温，分装-20℃保存或继续实验。

(2)安装胶板，并按照表5配制分离胶：

表5分离胶

(3)将分离胶注入两层玻璃板中，加入适当位置后，滑动枪头加入异丙醇，至液面溢出；

(4)待胶凝后，倒出异丙醇，并用滤纸吸净残余异丙醇；

(5)按表6配制浓缩胶：

表6浓缩胶

将浓缩胶注入两层玻璃板中，至液面溢出，插入梳子；

(6)待胶凝后，拔出梳子，与电泳槽组装，加入电泳液；

(7)点样：实验组蛋白样品为30μl蛋白样品，marker上样量为10μl；设置电源电压为100v，待溴酚蓝到达底端时停止电泳。

(8)取出胶板，按照marker指示留目的条带附近的胶；

(9)将留下的胶浸泡在转移液中，并准备稍大于胶的滤纸(四层)和pvdf膜(甲醇浸泡30sec)；

(10)按下列顺序摆放：海绵→滤纸→胶→pvdf膜→滤纸→海绵(放置时避免产生气泡)；

(11)将组装好的夹板置于转印槽中，倒入转移液，接通电源，电流设置为300ma左右，功率要小于40w，时间为90min；

(12)待转印结束，取出pvdf膜，放置于立春红染色液中，摇床上染色5min；

(13)冲洗pvdf膜，根据marker指示和目的条带的蛋白大小，剪膜，置于5％脱脂奶粉配制的封闭液中，室温孵育1h；

(14)倒掉封闭液，一抗孵育(1：300)，置于4℃摇床摇孵育过夜；

(15)回收一抗，pbst洗膜10min，三次；

(16)弃去pbst，二抗孵育(1：10000)，置于4℃摇床孵育1h；

(17)回收二抗，pbst洗膜10min，三次；

(18)odyssey双红外激光成像系统检测蛋白条带变化。

2.6基因zswa对abcc1基因表达的调控结果

qrt-pcr结果显示，过表达zswa后，abcc1基因表达也随之升高，差异显著。westernblot结果与qrt-pcr结果趋势一致，结果表明，zswa基因可正向调控abcc1基因的表达，过表达zswa后zswa和abcc1基因表达的变化详见图4和图5。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内，本发明要求保护范围由所附的权利要求书其等效物界定。

核苷酸和/或氨基酸序列表

<110>齐齐哈尔大学

<120>1.一种可显著增强细胞abcc1基因表达的基因zswa

<160>3

<210>1

<211>2160

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

1gcgcagaacttggggagccgccgccgccatccgccgccgcagccagcttccgccgccgca

61ggaccggcccctgccccagcctccgcagccgcggcgcgtccacgcccgcccgcgcccagg

121gcgagtcggggtcgccgcctgcacgcttctcagtgttccccgcgccccgcatgtaacccg

181gccaggcccccgcaactgtgtcccctgcagctccagccccgggctgcacccccccgcccc

241gacaccagctctccagcctgctcgtccaggatggccgcggccaaggccgagatgcagctg

301atgtccccgctgcagatctctgacccgttcggatcctttcctcactcgcccaccatggac

361aactaccctaagctggaggagatgatgctgctgagcaacggggctccccagttcctcggc

421gccgccggggccccagagggcagcggcagcaacagcagcagcagcagcagcgggggcggt

481ggaggcggcgggggcggcagcaacagcagcagcagcagcagcaccttcaaccctcaggcg

541gacacgggcgagcagccctacgagcacctgaccgcagagtcttttcctgacatctctctg

601aacaacgagaaggtgctggtggagaccagttaccccagccaaaccactcgactgcccccc

661atcacctatactggccgcttttccctggagcctgcacccaacagtggcaacaccttgtgg

721cccgagcccctcttcagcttggtcagtggcctagtgagcatgaccaacccaccggcctcc

781tcgtcctcagcaccatctccagcggcctcctccgcctccgcctcccagagcccacccctg

841agctgcgcagtgccatccaacgacagcagtcccatttactcagcggcacccaccttcccc

901acgccgaacactgacattttccctgagccacaaagccaggccttcccgggctcggcaggg

961acagcgctccagtacccgcctcctgcctaccctgccgccaagggtggcttccaggttccc

1021atgatccccgactacctgtttccacagcagcagggggatctgggcctgggcaccccagac

1081cagaagcccttccagggcctggagagccgcacccagcagccttcgctaacccctctgtct

1141actattaaggcctttgccactcagtcgggctcccaggacctgaaggccctcaataccagc

1201taccagtcccagctcatcaaacccagccgcatgcgcaagtaccccaaccggcccagcaag

1261acgcccccccacgaacgcccttacgcttgcccagtggagtcctgtgatcgccgcttctcc

1321cgctccgacgagctcacccgccacatccgcatccacacaggccagaagcccttccagtgc

1381cgcatctgcatgcgcaacttcagccgcagcgaccacctcaccacccacatccgcacccac

1441acaggcgaaaagcccttcgcctgcgacatctgtggaagaaagtttgccaggagcgatgag

1501cgaaaaaggcataccaagatccacttgcggcagaaggacaagaaagcagacaaaagtgtt

1561gtggcctcttcggccacctcctctctctcttcctacccgtccccggttgctacctcttac

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