一种能够特异性抑制ZBED1基因的siRNA的构建方法及其应用与流程

本发明属于分子生物学及肿瘤学领域，具体的涉及到一种能够特异性抑制zbed1基因的sirna的构建方法及其应用。
背景技术：
：锌指bed型包涵子1(zincfinger,bed-typecontaining1，zbed1)又名dna复制相关元素结合因子，属于锌指蛋白zbed家族，由694个氨基酸残基组成，分子量约78kda，其编码蛋白被认为是一种调控dna复制、染色质结构重塑、蛋白质合成、细胞周期等的关键转录因子。令人感兴趣的是，zbed1在肿瘤中的研究至今未见报道。前期工作发现采用免疫组化检测zbed1在人肺癌组织高表达，并且与肿瘤t分期显著相关。由此提示，zbed1是人肺癌特异高表达基因，可能在肺癌生长中发挥重要作用。技术实现要素：本发明的目的在于针对zbed1基因的研究现状，阐明其在肺癌中的表达情况，提出能够特异性抑制zbed1基因的sirna的构建方法及其应用。本发明的目的通过以下技术方案实现。1.检测zbed1蛋白在临床肺癌中的表达情况，包括以下步骤：(1)临床肺癌组织标本的收集及标本信息：收集2009年1月至2016年6月于云南省肿瘤医院胸外科行肺原发肿瘤根治性切除术的122例ⅰ—ⅲa期肺腺癌患者的癌组织和癌旁肺组织标本。其中，男性63例，女性59例；患者平均年龄54.4岁，年龄范围27至78岁；(2)苏木素—伊红(he)染色进行病理诊断；(3)免疫组化检测zbed1蛋白在临床肺癌癌组织和癌旁组织中的表达情况；(4)统计分析zbed1蛋白在临床肺癌癌组织和癌旁组织中的表达差异；2.一种能够特异性抑制zbed1基因的sirna的构建方法，包括以下步骤：(1)利用ncbi(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)数据库，获得人zbed1基因的转录本及编码(cds)区信息(转录本1：nm_001171136，cds区：1283-2367，具体序列见序列表)；(2)根据sirna序列设计原则，针对人zbed1基因的编码区，设计2个能特异性敲减人zebd1基因的靶序列；5’——3’rnai-1-fggaaguacaucucuaccaarnai-1-rccuucauguagagaugguudtdtrnai-2-fgcaaacugguggaguacuurnai-2-rcguuugaccaccucaugaadtdt(3)化学合成该靶序列；3.验证2中sirna抑制效率的方法，其特征在于直接利用westernblot检测zbed1蛋白的表达，内参蛋白为gapdh；4.检测zbed1基因对肺癌细胞生物学功能的影响及具体方法，包括：(1)细胞增殖活性检测(mts法)：将103个生长状态良好细胞接种于96孔板，每孔加入150ul完全培养基，置于5％co237℃培养箱中培养1天后，每孔加mts溶液(5mg/ml)30ul，继续孵育2小时；选择490nm波长测定各孔的吸光度，连续检测5天；(2)流式细胞周期检测：将处于对数生长期的2×106个细胞于70％的乙醇中固定、漂洗，离心收集细胞，0.2m柠檬酸/柠檬酸钠高渗处理30分钟，1×pbs洗2次，0.1％triton(pbs配制)洗1次，再用500μg/mlpi和0.1％rnaasea，室温避光孵育30分钟，流式细胞仪检测分析。本发明的有益效果：1.本发明公开了zbed1蛋白在临床肺癌组织中高表达。2.用本发明研制的sirna能特异性抑制肺癌细胞系中内源性zbed1的表达。3.mts法检测细胞增殖表明，与转染对照rna相比，转染本发明研制的两个sirna能抑制肺癌细胞的增殖能力，说明zbed1基因能促进肺癌细胞的增殖。4.流式细胞术检测肺癌细胞周期表明，与转染对照rna相比，转染本发明研制的两个sirna能抑制肺癌细胞的细胞周期进程，使其阻滞于g1期，说明zbed1基因能促进肺癌细胞周期从g1期向s期转化。5.功能学结果提示，本发明研制的sirna可能对肺癌的靶向治疗具有十分重要的应用价值。附图说明图1为zbed1蛋白在临床肺癌组织中高表达；图2为两种sirna能特异性抑制肺癌细胞系中内源性zbed1的表达；图3为两种sirna对肺癌细胞增殖能力的抑制情况；图4为两种sirna对肺癌细胞细胞周期的阻滞情况；图5为2个能特异性敲减人zbed1基因的靶序列。如下具体实施方式将结合上述附图进一步说明本发明。具体实施方式1.检测zbed1蛋白在临床肺癌中的表达情况，包括以下步骤：(1)临床肺癌组织标本的收集及标本信息：收集2009年1月至2016年6月于云南省肿瘤医院胸外科行肺原发肿瘤根治性切除术的122例ⅰ—ⅲa期肺腺癌患者的癌组织和癌旁肺组织标本。其中，男性63例，女性59例；患者平均年龄54.4岁，年龄范围27至78岁；(2)苏木素—伊红(he)染色进行病理诊断；(3)免疫组化检测zbed1蛋白在临床肺癌癌组织和癌旁组织中的表达情况；(4)统计分析zbed1蛋白在临床肺癌癌组织和癌旁组织中的表达差异；如图1所示，为zbed1蛋白在临床肺癌癌组织和癌旁组织中的表达情况，从图1可以看出，zbed1在70.50％肺癌组织中表达，在46.70％癌旁组织中表达，说明zbed1蛋白在肺癌组织中的表达较癌旁高。2.研制能特异性抑制zbed1基因的sirna，包括以下步骤：(1)利用ncbi(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)数据库，获得人zbed1基因的转录本(转录本1：nm_001171136.1)及编码(cds)区信息(具体序列见序列表)；转录本1(variant1,mrna)：cgcgggcggcgcggaagcggcggcggcgcggccggggcagccatgtcgccattgtctgcggcgcgggcggccctgcgggtctacgcggtaggcgccgcggtgatcctggcgcagctgctgcggcgctgccgcgggggcttcctggagccagcaggtccccacgcatgagcagccgtccagcaggcaggctccggtggagaagcaatggagaataaaagcctggagagctcccagacagacctgaagctggtggcccacccccgcgccaagagcaaggtgtggaagtatttcggcttcgacaccaacgccgagggatgcatcctgcagtggaagaaaatctactgccgcatctgcatggcccagatcgcctactccggaaacacctccaacctgtcctaccacctggagaagaaccaccccgaggaattctgcgagttcgtcaagagcaacacggagcagatgcgtgaagccttcgccaccgccttctccaagctgaagcccgagtcgtcccagcagcccgggcaggacgcgctggccgtcaaggccggccacggctacgacagcaagaagcagcaggagctgacggccgccgtgctgggcctcatctgcgaggggctgtacccagcctccatcgtggacgagcccaccttcaaggtgctgctgaagacggccgacccccggtatgagctgcccagccggaagtacatctctaccaaggccatccctgagaagtacggggccgtccgggaggtgatcctgaaggagctggccgaggccacctggtgtggcatctccaccgacatgtggaggagtgagaatcagaaccgcgcctacgtcacgctggccgcccacttcctgggcctgggcgcccccaactgcctgtccatgggctcccgctgcctgaagaccttcgaggtgcccgaagagaacacggcggagaccatcacgcgagtgctctatgaggtcttcatcgagtggggcatcagcgccaaggtcttcggggccaccaccaactatggcaaggacatcgtgaaggcgtgctccctgctggacgtcgcagtgcacatgccctgcctgggccacaccttcaatgccggcatccagcaggccttccagctcccgaagctgggggcgctgctgtcgcgctgccgcaaactggtggagtacttccagcagtctgccgtggccatgtacatgctctatgagaagcagaagcagcagaacgtggcccactgcatgctggtgagcaaccgcgtctcctggtgggggagcacgctggccatgctgcagcgcctcaaggagcagcagttcgtcatcgccggggtcttggtggaggacagcaacaaccaccacctcatgctggaggccagcgagtgggccaccatcgaggggctggtggagctcctgcagcccttcaagcaggtggccgagatgctgtcggcctccaggtaccccaccatcagcatggtgaagccgctgctgcacatgctcctgaacaccacgctcaacatcaaggagaccgactccaaggagctcagcatggccaaggaggtcatcgccaaggagctttccaagacctaccaggagacgcccgagatcgacatgtttctcaacgtggccaccttcctggacccccgctacaagaggctgcccttcctctccgccttcgagcggcagcaggtggagaatcgcgtggtggaagaggccaagggcctgctggacaaggtcaaagacggcggctaccggccggctgaggacaagatcttcccggtgcccgaggagcctcccgtcaagaagctcatgcggacatccacgccgccgcccgccagcgtcatcaacaacatgctggccgagatcttctgccagacaggcggcgtggaggaccaggaagagtggcatgcccaggtggtggaggagctgagcaacttcaagtcccagaaggtgcttggcctcaacgaagaccccctcaagtggtggtcagaccgcctggccctcttccccctgctgcccaaggtgctgcagaagtactggtgcgtgacggccacgcgcgtcgcccctgagcgtctcttcggatccgccgccaacgtggtcagcgccaagaggaaccggctggctcccgcgcacgtggacgagcaggtgtttctgtatgagaacgcccggagtggggcagaggcggaacccgaggaccaggacgagggggagtggggcctggaccaggagcaggtgttctccttgggggatggcgtcagcggcggtttctttggcattagggacagcagcttcctgtagcgaggaagcgtgttgtcttacaagtcatccccgcagcagcccattggatgctttgctgtaaatacttacccggtcagcttggttttgaacctcagagaccatccactgtctttgacacctagaaggtggaaaaaggaaagagatttgagaagtgagagagggtcgggggcggtggctcctgtctataatcgcagcactttgggaggccgaggtgggcagatcagctgaggtcaggagatcgagaccagcctggccaacatggcgaaaccccgtctctactaaaaatacaaaaattagccaggactgatggcatgtgcctgtaatcccagcttctggaggctgaggccagagaatcgcttgaacctgggaggtggaggttgcagtaagctgagatcgctgcactccagcctgggcgacaagagcgagactctctcaaaaagaaaaaagaagacacaagagaggtggctttgagtgggtttcctttcctcccctattcccggggcccggacgacttctgcttgggaactgccaacgcttctgcttgggaattgcgtgcagcagagcctagaggagctgttccttccttcacagatacttaagacctccaccatgtctgattcgagttctccctgggagggtttagaagaaacgcaggaacattctgggtggcgtcgaaggagcctttcccgatcatcatgtgtgacttctgcgaggtccagatcactgaattcatgtttacattctcgtgcaagcagggacctcttgcttctgagaaatggggaagagaccttttagccaaaatgcccttcttaaaaagagagacctttttttttaatgttcggttaaaaatgtgacagatgagtacaaaaatgcagacacttaacaaaaagcaaacagaaaaaaaagtgtggaatgtgttgtattttcgacaggttgctgccagagagcctgcttcctgctgcctgccgaaatttcactttgcggagttggtccttaaaactgggcggtggccgggcgtggtggctcacgctgaggtcaggagttcgagaccagcctggccaaccaacatggtgaaacctcgtgtctactaaaaatacaagaaactagccagatgcggtggcacccgcctgtaatcccagctactcgggaggctgaggcggaagattcgcttgagcccaggaggtggaggttgcagtgagccaagactacgccactgcactccagcctggaggccagagtgagactccgtctcaaaacaaaacaaaagtgggtggctcacgggtccggaggttatgtcttcggtgtctcagccctaaaagtccagttcccccgtgcggccagcttttccacataaggtgtttttgatttgattaccggaaaggactcttgattcttctcttttaaactgaataccataggggaaatgaattttaaaatattgcccccggaggggttttccgtggctggattcctgcgagttgctttcagtcattcagggaaacagaaagacgttttccaacatgtagaactgctttttaactggaggaaaaatacttcaggaggcttagcatattgcttggattctacgtgcagcgggttctctgcctccgtgaagacaagctgggctggggagaacggtgtctaggagggatgaccccactcagctccaggcagtgttctgccgagaccccaagaactcggggtgtcagagggcaaaggaactacctgcctttcacggctgctgacttctcagggctgcaagcagcacagaatgttatccttacgtcctgagccggtttaagtctgtggaaaaggaagcacgggagaaatccacgtaacctttgctttctttttaagggaagcggttccgccgtgaacttggaaccctcagctccgggtgttctcggcagaagggcagctggaagggacacagtggggcaggctttggggttgctccctgttctgccccgaggccggggacgcagggcagcccacgcctccgtgggctccattctgtagcattgccagcgttctcttcacgtctctaacaatccttcgcttttcctcactcacgtggaaatgtgaactgtcccggctctgtcttcatttttatttttaagccatcgttcccctcctgaacggttgccccttatttaatgctgtaaagttggactgttgttcaataaaccagagcaatgcattagctcctcattcatttgtcaaaaaaaaaaaaaaaaaacds区(x/y染色体：2488635-2490719)：atggagaataaaagcctggagagctcccagacagacctgaagctggtggcccacccccgcgccaagagcaaggtgtggaagtatttcggcttcgacaccaacgccgagggatgcatcctgcagtggaagaaaatctactgccgcatctgcatggcccagatcgcctactccggaaacacctccaacctgtcctaccacctggagaagaaccaccccgaggaattctgcgagttcgtcaagagcaacacggagcagatgcgtgaagccttcgccaccgccttctccaagctgaagcccgagtcgtcccagcagcccgggcaggacgcgctggccgtcaaggccggccacggctacgacagcaagaagcagcaggagctgacggccgccgtgctgggcctcatctgcgaggggctgtacccagcctccatcgtggacgagcccaccttcaaggtgctgctgaagacggccgacccccggtatgagctgcccagccggaagtacatctctaccaaggccatccctgagaagtacggggccgtccgggaggtgatcctgaaggagctggccgaggccacctggtgtggcatctccaccgacatgtggaggagtgagaatcagaaccgcgcctacgtcacgctggccgcccacttcctgggcctgggcgcccccaactgcctgtccatgggctcccgctgcctgaagaccttcgaggtgcccgaagagaacacggcggagaccatcacgcgagtgctctatgaggtcttcatcgagtggggcatcagcgccaaggtcttcggggccaccaccaactatggcaaggacatcgtgaaggcgtgctccctgctggacgtcgcagtgcacatgccctgcctgggccacaccttcaatgccggcatccagcaggccttccagctcccgaagctgggggcgctgctgtcgcgctgccgcaaactggtggagtacttccagcagtctgccgtggccatgtacatgctctatgagaagcagaagcagcagaacgtggcccactgcatgctggtgagcaaccgcgtctcctggtgggggagcacgctggccatgctgcagcgcctcaaggagcagcagttcgtcatcgccggggtcttggtggaggacagcaacaaccaccacctcatgctggaggccagcgagtgggccaccatcgaggggctggtggagctcctgcagcccttcaagcaggtggccgagatgctgtcggcctccaggtaccccaccatcagcatggtgaagccgctgctgcacatgctcctgaacaccacgctcaacatcaaggagaccgactccaaggagctcagcatggccaaggaggtcatcgccaaggagctttccaagacctaccaggagacgcccgagatcgacatgtttctcaacgtggccaccttcctggacccccgctacaagaggctgcccttcctctccgccttcgagcggcagcaggtggagaatcgcgtggtggaagaggccaagggcctgctggacaaggtcaaagacggcggctaccggccggctgaggacaagatcttcccggtgcccgaggagcctcccgtcaagaagctcatgcggacatccacgccgccgcccgccagcgtcatcaacaacatgctggccgagatcttctgccagacaggcggcgtggaggaccaggaagagtggcatgcccaggtggtggaggagctgagcaacttcaagtcccagaaggtgcttggcctcaacgaagaccccctcaagtggtggtcagaccgcctggccctcttccccctgctgcccaaggtgctgcagaagtactggtgcgtgacggccacgcgcgtcgcccctgagcgtctcttcggatccgccgccaacgtggtcagcgccaagaggaaccggctggctcccgcgcacgtggacgagcaggtgtttctgtatgagaacgcccggagtggggcagaggcggaacccgaggaccaggacgagggggagtggggcctggaccaggagcaggtgttctccttgggggatggcgtcagcggcggtttctttggcattagggacagcagcttcctgtagatggagaataaaagcctggagagctcccagacagacctgaagctggtggcccacccccgcgccaagagcaaggtgtggaagtatttcggcttcgacaccaacgccgagggatgcatcctgcagtggaagaaaatctactgccgcatctgcatggcccagatcgcctactccggaaacacctccaacctgtcctaccacctggagaagaaccaccccgaggaattctgcgagttcgtcaagagcaacacggagcagatgcgtgaagccttcgccaccgccttctccaagctgaagcccgagtcgtcccagcagcccgggcaggacgcgctggccgtcaaggccggccacggctacgacagcaagaagcagcaggagctgacggccgccgtgctgggcctcatctgcgaggggctgtacccagcctccatcgtggacgagcccaccttcaaggtgctgctgaagacggccgacccccggtatgagctgcccagccggaagtacatctctaccaaggccatccctgagaagtacggggccgtccgggaggtgatcctgaaggagctggccgaggccacctggtgtggcatctccaccgacatgtggaggagtgagaatcagaaccgcgcctacgtcacgctggccgcccacttcctgggcctgggcgcccccaactgcctgtccatgggctcccgctgcctgaagaccttcgaggtgcccgaagagaacacggcggagaccatcacgcgagtgctctatgaggtcttcatcgagtggggcatcagcgccaaggtcttcggggccaccaccaactatggcaaggacatcgtgaaggcgtgctccctgctggacgtcgcagtgcacatgccctgcctgggccacaccttcaatgccggcatccagcaggccttccagctcccgaagctgggggcgctgctgtcgcgctgccgcaaactggtggagtacttccagcagtctgccgtggccatgtacatgctctatgagaagcagaagcagcagaacgtggcccactgcatgctggtgagcaaccgcgtctcctggtgggggagcacgctggccatgctgcagcgcctcaaggagcagcagttcgtcatcgccggggtcttggtggaggacagcaacaaccaccacctcatgctggaggccagcgagtgggccaccatcgaggggctggtggagctcctgcagcccttcaagcaggtggccgagatgctgtcggcctccaggtaccccaccatcagcatggtgaagccgctgctgcacatgctcctgaacaccacgctcaacatcaaggagaccgactccaaggagctcagcatggccaaggaggtcatcgccaaggagctttccaagacctaccaggagacgcccgagatcgacatgtttctcaacgtggccaccttcctggacccccgctacaagaggctgcccttcctctccgccttcgagcggcagcaggtggagaatcgcgtggtggaagaggccaagggcctgctggacaaggtcaaagacggcggctaccggccggctgaggacaagatcttcccggtgcccgaggagcctcccgtcaagaagctcatgcggacatccacgccgccgcccgccagcgtcatcaacaacatgctggccgagatcttctgccagacaggcggcgtggaggaccaggaagagtggcatgcccaggtggtggaggagctgagcaacttcaagtcccagaaggtgcttggcctcaacgaagaccccctcaagtggtggtcagaccgcctggccctcttccccctgctgcccaaggtgctgcagaagtactggtgcgtgacggccacgcgcgtcgcccctgagcgtctcttcggatccgccgccaacgtggtcagcgccaagaggaaccggctggctcccgcgcacgtggacgagcaggtgtttctgtatgagaacgcccggagtggggcagaggcggaacccgaggaccaggacgagggggagtggggcctggaccaggagcaggtgttctccttgggggatggcgtcagcggcggtttctttggcattagggacagcagcttcctgtag(2)根据sirna序列设计原则，针对人zbed1基因的编码区，设计2个能特异性敲减人zbed1基因的靶序列；5’——3’rnai-1-fggaaguacaucucuaccaarnai-1-rccuucauguagagaugguudtdtrnai-2-fgcaaacugguggaguacuurnai-2-rcguuugaccaccucaugaadtdt(3)化学合成该靶序列；3.验证2中sirna抑制效率的方法，其特征在于直接利用westernblot检测zbed1蛋白的表达，内参蛋白为gapdh；如图2所示，为westernblot验证sirna对a549肺癌细胞中zebd1的抑制情况，从图2可以看出，与阴性对照组sirna比较，本发明设计的2个sirna能使a549肺癌细胞中zbed1蛋白表达降低，说明本发明设计的2个靶序列能明显抑制人zbed1基因的表达，可用于后续研究。4.检测zbed1基因对肺癌细胞生物学功能的影响及具体方法，包括：(1)细胞增殖活性检测(mts法)：将103个生长状态良好细胞接种于96孔板，每孔加入150ul培养基，置于5％co237℃培养箱中培养1天后，每孔加mts溶液(5mg/ml)30ul，继续孵育2小时；选择490nm波长测定各孔的吸光度，连续检测4天；如图3所示，为用sirna干扰人zbed1基因后肺癌细胞增殖能力的变化。从图3可以看出，与阴性对照组细胞比较，干扰zbed1基因后，a549肺癌细胞增殖能力明显减慢，说明本发明设计的两个sirna，抑制zbed1基因后，均能抑制肺癌细胞的增殖能力。(2)流式细胞周期检测：将处于对数生长期的2×106个细胞于70％的乙醇中固定、漂洗，离心收集细胞，0.2m柠檬酸/柠檬酸钠高渗处理30分钟，1×pbs洗2次，0.1％triton(pbs配制)洗1次，再用500μg/mlpi和0.1％rnaasea，室温避光孵育30分钟，流式细胞仪检测分析。如图4所示，为干扰人zbed1基因后肺癌细胞周期的变化。从图4可以看出，与阴性对照组细胞比较，干扰zbed1基因后，a549肺癌细胞处于g1期细胞比例增加，说明本发明设计的两个sirna，抑制zebd1基因后，均能使肺癌细胞的细胞周期阻滞于g1期。由此可见，能够特异性抑制zbed1基因的sirna在抑制肺癌细胞增殖和制备治疗肿瘤药物方面具有良好的应用。以上所述实施例，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页12