一种高产乙醇的双细胞连续发酵方法与流程

本发明属于细胞发酵工程领域，具体涉及一种高产乙醇的双细胞连续发酵方法。

背景技术：

生物质乙醇是一种低排放、绿色、环保型清洁能源，用乙醇替代或部分替代汽油作为未来的汽车燃料，可以极大地缓解能源危机。同时从全球碳循环角度出发，乙醇燃烧后释放的二氧化碳重新被绿色植物固定，可减缓温室效应，因而受到各国政府及科学家越来越广泛的关注。

生物质乙醇的生产需利用可再生生物质资源，目前国际上主要使用木质纤维素水解加微生物发酵的方法，该方法所用纤维素酶大多靠进口，成本较高，发酵菌株酵母菌不能耐高浓度乙醇且对木质纤维素水解产物中抑制物的耐受性差。另外也有使用同步糖化发酵的方法，但还未找到适用于大规模生产的菌株，人工构建的酵母基因工程菌纤维素酶解效率低、稳定性差，其它筛选的野生菌株乙醇发酵水平达不到工业化需要。因此，提高乙醇发酵水平和生物质转化率非常重要。

对微生物发酵生产乙醇而言，合适的发酵工艺对保证产乙醇水平、菌株生物质转化效率的稳定性至关重要。所以有必要通过发酵工艺的优化尤其是培养基的简化提高乙醇产量、太阳能和生物质综合利用率，降低生产成本。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种高产乙醇的双细胞连续发酵方法，该方法利用解淀粉芽孢杆菌促进小球藻生长、产纤维素酶和淀粉酶且两者均耐盐的特性，进一步通过人工驯化提高两种细胞的共培养相容性。所需的培养基成分极简，成本低，易于控制，菌株发酵性能稳定，生物质转化效率、利用率以及乙醇产量得到显著提高。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种高产乙醇的双细胞连续发酵方法，包括以下步骤：

步骤1)采用种子培养基培养解淀粉芽孢杆菌和小球藻发酵种子，其中解淀粉芽孢杆菌培养温度为28℃，摇床转速160r/min，培养时间24h；小球藻培养温度为25℃，光照静置培养，培养时间5～7d；

步骤2)按1:1的体积比混合步骤1)得到的解淀粉芽孢杆菌和小球藻种子培养液作为发酵种子液；

步骤3)将发酵种子液按10％的接种量接种至发酵培养基上，进行双细胞共培养发酵生产并收集乙醇，发酵过程温度为28℃，采用气升式发酵罐，50％氨水控制ph7.0，通气量5l/s，发酵至第七天结束，发酵制得的乙醇经提取后可剩余发酵液。

优选地，所述解淀粉芽孢杆菌的种子培养基成分为：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l；所述小球藻的种子培养基成分为：葡萄糖10g/l，硝酸钾1.011g/l，磷酸二氢钠0.907g/l，磷酸氢二钠0.946g/l，硫酸镁0.246g/l，氯化钙0.015g/l，硫酸亚铁0.007g/l，硫酸锌0.0003g/l，硫酸锰0.0002g/l，氯化铵0.5g/l；所述发酵培养基的成分为：酵母提取物10g/l，海水。

优选地，步骤3)所述发酵过程中通气采用压缩空气。

优选地，步骤3)所述收集的乙醇为气体，采用在所述气升式发酵罐的塔顶出口处压缩并冷凝的方式收集。

优选地，步骤3)剩余发酵液回收用于生物菌肥和水产饲料。

本发明的有益效果如下：

本发明的种子培养方法，发酵种子生长迅速且最终菌浓较大，小球藻为活体状态，接种发酵培养基后菌体生长延滞期明显缩短，显著提高了乙醇的发酵效率。本发明的乙醇发酵方法，发酵培养基成分极简，无需添加葡萄糖、维生素、氨基酸、稀有金属离子等微量元素，工艺控制简单，显著降低了发酵成本并提高了乙醇产量和生物质利用率。此外，共培养体系可以为彼此提供营养物质且解淀粉芽孢杆菌具有促进小球藻生长的特性。

附图说明

图1为高产乙醇的双细胞连续发酵方法的流程图。

具体实施方式

下面结合附图与实施例对本发明做进一步阐述。

本发明所使用的解淀粉芽孢杆菌菌株(bacillusamyloliquefaciens)和小球藻(chlorellavulgaris)是本实验室购买的通用菌株和细胞。其中解淀粉芽孢杆菌菌株(bacillusamyloliquefaciens)的保藏编号为cgmccno.1.7463。

实施例1

一种高产乙醇的双细胞连续发酵方法，如图1所示，包括以下步骤：

1、解淀粉芽孢杆菌种子培养基成分为：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l。解淀粉芽孢杆菌种子培养过程采用三角瓶，培养温度为28℃，摇床转速160r/min，培养时间24h。

2、小球藻种子培养基成分为：葡萄糖10g/l，硝酸钾1.011g/l，磷酸二氢钠0.907g/l，磷酸氢二钠0.946g/l，硫酸镁0.246g/l，氯化钙0.015g/l，硫酸亚铁0.007g/l，硫酸锌0.0003g/l，硫酸锰0.0002g/l，氯化铵0.5g/l。小球藻种子培养温度为25℃，光照静置培养，培养时间5～7d。

3、按1:1的体积比混合解淀粉芽孢杆菌和小球藻种子培养液作为发酵种子液。

4、发酵培养基成分为：酵母提取物10g/l，海水。将发酵种子液按10％的接种量接种至发酵培养基上，发酵过程温度为28℃，采用sgq-100l气升式发酵罐(常州三高)，50％氨水控制ph7.0，通气采用压缩空气，通气量5l/s，发酵至第七天结束。

挥发的乙醇气体在气升式发酵罐的塔顶出口处压缩并冷凝收集，发酵结束后乙醇产量为11.2g/l，实现了光能向化学能的高效生物转化。乙醇提取后的发酵液中含有大量细胞，其中上清液可用作水产饲料，沉淀可用作生物菌肥。

本发明所用的发酵罐罐体为有机玻璃，透光性能、化学稳定性好，比重小，重量轻，机械强度高，耐腐蚀，耐湿，耐晒，便于采集日光。

对照例1

1、解淀粉芽孢杆菌种子培养基成分为：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l。解淀粉芽孢杆菌种子培养过程采用普通250ml三角瓶，培养温度为30℃，摇床转速160r/min，培养时间24h。

2、小球藻培养基成分为：na2co30.02g/l，nano32.0g/l，kh2po40.02g/l，mgso40.1g/l，尿素0.8g/l。小球藻种子培养温度为23℃，光照静置培养，控制ph6.0，培养时间7d；

3、解淀粉芽孢杆菌发酵培养基成分：葡萄糖120g/l，玉米浆40g/l，生物素8×10^-5g/l，组氨酸5×10^-4g/l，硫酸锰0.02g/l，硫酸铵20g/l，硫酸镁0.5g/l，磷酸二氢钾1.5g/l，硫酸亚铁0.02g/l。解淀粉芽孢杆菌发酵过程温度为30℃，采用sgq-100l气升式发酵罐(常州三高)，发酵罐搅拌转速600r/min，50％氨水控制ph7.0，通气采用压缩空气，通气量3l/s，发酵至葡萄糖耗尽结束，乙醇产量为2g/l。

技术特征：

技术总结
本发明公开了一种高产乙醇的双细胞连续发酵方法，首先采用种子培养基培养解淀粉芽孢杆菌和小球藻发酵种子，最后采用双细胞共培养发酵培养基发酵生产并收集乙醇。该工艺种子培养过程中，解淀粉芽孢杆菌和小球藻生长迅速且最终细胞浓度较高。该工艺发酵过程中发酵培养基成分简单，无需添加碳源、维生素、氨基酸等微量元素，工艺控制简单，菌株发酵性能稳定，乙醇产量达到11.2g/L，实现了光能向化学能的高效生物转化。

技术研发人员：倪浩;吴小虎;陈云;姜桂颖;朱维民
受保护的技术使用者：盐城工学院
技术研发日：2019.02.01
技术公布日：2019.04.09