一种生物碱类化合物及其从棒节石斛中提取分离的方法与应用与流程

本发明涉及植物有效成分提取技术领域，具体涉及一种生物碱类化合物及其从棒节石斛中提取分离的方法与应用。

背景技术：

现代药理研究表明，石斛具有调节免疫力、抗肿瘤、降血糖、抑菌、抗血小板凝集、抗氧化、降血压等作用。棒节石斛(dendrobiumfindlayanumpar.etrchb.f.)是一种喜阴凉的多年生草本植物，具有较高药用价值，但对于其有效成分的研究较少。生物碱类化合物是一类含氮的碱性有机化合物，大多数有复杂的环状结构，氮素多包含在环内，有显著的生物活性，是中草药中重要的有效成分之一。本发明从棒节石斛中分离得到一种具有一定抗肿瘤活性的生物碱类化合物，该化合物结构至今未见有相关报道。然而中草药棒节石斛中活性成分一般含量低，不易得到。

技术实现要素：

本发明意在提供一种生物碱类化合物及其从棒节石斛中提取分离的方法与应用，以开发出棒节石斛中的其中一种活性成分。本分离方法只使用了一次硅胶柱色谱，减少样品损失，使用半制备hplc进行精分，可控性和重现性好，微量活性成分不易流失，化合物纯度高，操作简单。

本方案中的一种生物碱类化合物，所述生物碱类化合物的化学结构式为：

本发明还提供了从棒节石斛中提取分离所述生物碱类化合物的方法，包括以下步骤：

1)取棒节石斛干燥茎粉碎后，用体积浓度80％～95％的甲醇回流提取1～4次，每次提取1～3小时，合并提取液，将提取液减压浓缩得到甲醇浸膏；

2)将步骤1)中所得甲醇浸膏分散于水溶液充分搅拌后，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇分别各萃取1～4次，减压浓缩得到各部位浸膏；

3)将步骤2)中乙酸乙酯部位浸膏和正丁醇部位浸膏通过硅胶柱色谱分离，用石油醚-乙酸乙酯以体积比100：0～0：100进行梯度洗脱，然后进行tlc检测分析，分为12～50个组分；

4)将步骤3)中组分10～12合并后经hplc分离，用浓度为70％～100％的甲甲醇梯度洗脱，洗脱出12个亚组分；

5)将步骤4)中组分第7组分用hplc进行二次纯化，用浓度为66％的甲醇等度洗脱，得到目标化合物。

进一步，所述步骤3)用石油醚-乙酸乙酯以体积比100:0；5:1；2:1；1:1；0:100进行梯度洗脱。

进一步，所述步骤5)中所用hplc柱色谱为10μm，10mm×250mm，c18柱色谱，采用浓度为66％的甲醇等度洗脱。

进一步，所述步骤5)中的洗脱剂甲醇可采用浓度为55％的乙腈代替。

本发明提取生物碱类化合物的优点在于，首先通过硅胶柱色谱，用tlc方法结合紫外进行粗分，然后再利用hplc色谱进行二次分离纯化得到单体，整个过程只使用了一次硅胶柱色谱，减少样品损失，分离方法使用hplc可控性和重现性好，微量成分不易流失，化合物纯度高，操作也较简单。

进一步，所述的生物碱类化合物在制备抗癌药物和抗白血病药物中的应用。

附图说明

图1为本发明棒节石斛碱a的结构图；

图2为本发明棒节石斛碱a的hr-esi-ms图；

图3为本发明棒节石斛碱a的¹h-nmr图；

图4为本发明棒节石斛碱a的¹³c-nmr图；

图5为本发明棒节石斛碱a的¹h-¹hcosy图；

图6为本发明棒节石斛碱a的hsqc图；

图7为本发明棒节石斛碱a的hmbc图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细的说明：

本发明所述的生物碱类化合物，所述生物碱类化合物的化学结构式为：

以下称该生物碱类化合物为棒节石斛碱a。

实施例1:

从棒节石斛中提取分离上述生物碱类化合物的方法，包括以下步骤：

1)取棒节石斛干燥茎3.0kg，经粉碎后，用体积浓度95％甲醇加热回流提取4次，每次3h,合并4次的提取液，将提取液进行减压浓缩得到甲醇浸膏0.5kg；

2)将步骤1)中甲醇浸膏分散于水溶液中充分搅拌后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取4次，减压浓缩得到各部位浸膏；

3)将步骤2)中乙酸乙酯部位浸膏和正丁醇部位浸膏通过硅胶柱色谱分离，用石油醚-乙酸乙酯以体积比100:0；5:1；2:1；1:1；0:100梯度洗脱，结合tlc检测方法，分为50个组分：fr.1～fr.50；

4)将步骤3)中第10～12个组分合并经hplc分离，用浓度为70％～100％的甲醇-水溶液梯度洗脱，色谱柱用c18，20mm×250mm，流速20.0ml/min梯度洗脱，收集3～30min之间色谱峰，检测波长230nm，共分为12个亚组分：fr.1～fr.12；

5)步骤4)中第7个组分fr.7通过hplc分离纯化，用浓度为66％的甲醇等度洗脱，色谱柱用c18，10mm×250mm，流速6.0ml/min等度洗脱，收集16～18min之间色谱峰，检测波长230nm，得到棒节石斛碱a。

实施例2：与实施例1的区别在于

步骤1)中回流提取用浓度为85％的甲醇溶液回流提取3次；步骤2)中萃取2次；步骤4)中用浓度为70％～100％的乙腈-水溶液代替，检测波长用240nm，260nm；步骤5)中用浓度为66％的乙腈-水溶液代替，检测波长用240nm，260nm。其余步骤同实施例1，也可以取得本发明所述的有益效果。

实施例3：与实施例1的区别在于

步骤1)中回流提取用浓度为90％的甲醇回流提取4次；步骤2)中萃取4次；步骤4)中用浓度为70％～100％的乙腈-水溶液代替，检测波长用240nm，260nm；步骤5)中用浓度为66％的乙腈-水溶液代替，检测波长用240nm，260nm。其余步骤同实施例1，也可以取得本发明所述的有益效果。

本发明进行tlc检识的条件：展开剂为石油醚-乙酸乙酯系统及二氯甲烷-甲醇系统，显色剂a：紫外灯(254nm)下观察荧光；显色剂b：碘缸显色。

结构鉴定：如图2～图7所示，利用的光谱技术，棒节石斛碱a主要包括核磁共振谱¹h-nmr、¹³c-nmr、hsqc、hmbc和质谱分析hr-esi-ms鉴定化合物的结构。

该化合物为红色油状物。hr-esi-ms[m+h]⁺m/z276.1764(计算值276.1600)，结合nmr谱确定化合物的分子式为c16h21no3,通过光谱技术，确定该化合物为棒节石斛碱a。其核磁数据见表1。

表1棒节石斛碱a的核磁数据(400/100mhz，cdcl3)：

实施例4

1.测定棒节石斛a对人胶质母细胞瘤细胞(a172)、人神经母细胞瘤细胞(shsy5y)和人宫颈癌细胞(hela)的抑制作用

采用常规mtt法，选取对数生长期的上述细胞，用含10％胎牛血清培养液调节细胞浓度为10×10⁵个/ml，以每孔100μl，接种到96孔平底细胞培养板，置于37℃、5％co2培养箱中培养24h后加入样品的浓度分别为0.9375、1.875、3.75、7.5、15、30μmol/l，设3个复孔。在37℃、5％co2培养箱中继续培养48h后弃去带样品的培养液，再补充100μl培养液。然后每孔加入20μlmtt溶液(5mg/ml)继续培养4h，离心后弃去上清液，用pbs冲洗2～3次后，再加入含mtt的培养液。终止培养，吸去孔内的培养液。最后，每孔加入100μldmso，低速振荡15min使结晶物充分溶解，将细胞培养板置于酶标仪上，测定490nm波长处的吸光值(a)，即od值，计算生长抑制率。记录实验结果，处理数据。顺铂为阳性对照。生长抑制率＝(1-实验组平均a/对照组平均a值)×100％以样品浓度为横坐标，抑制率为纵坐标绘制抑制率曲线图，求出抑制率为50％时样品的浓度。棒节石斛碱a对人胶质母细胞瘤细胞(a172)、人神经母细胞瘤细胞(shsy5y)和人宫颈癌细胞(hela)的ic50分别为10.42μm、8.90μm、10.63μm。

2.测定棒节石斛a对人急性单核细胞白血病细胞mv4-11的抑制作用。

实验步同上述步不同之处在于：药物的浓度分别为：3.33、10、30μmol/l，每种药物平行测定3次。棒节石斛碱a对人急性单核细胞白血病细胞mv4-11的ic50为12.3μm。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。