本发明属于基因工程
技术领域：
：，具体涉及一种植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因的重组载体、用该载体转化的宿主以及利用该转化体大量表达亚硝酸盐还原酶、和亚硝酸盐还原酶的高效亲和层析纯化方法。
背景技术：
：：亚硝酸盐是一种潜在的致癌物质，在蔬菜发酵过程中极易积累，给产品带来潜在的个品安全问题，且过量摄入亚硝酸盐可诱发高铁血红蛋白症，因此严格控制食品中亚硝酸盐的含量非常重要。许多研究表明亚硝酸盐是亚硝胺的前体物，亚硝胺是一种强致癌物，可以诱发消化系统中的多种癌变，如胃癌、肠癌和肝癌。鉴于食品可能存在超标亚硝酸盐污染和肉制品中含有亚硝酸盐的潜在食品安全问题，寻求有效控制或降解亚硝酸盐的方法势在必行，除了加入食用安全的乳酸菌外，还可利用亚硝酸盐还原酶(nir)进行亚硝酸盐的生物降解。但是，目前对如何得到大量的食用安全的亚硝酸盐还原酶还没有很好的方法。主要是因为酶蛋白质的分离纯化困难导致生产成本过高而无法实现产业化，与常规蛋白分离技术相比，固定金属离子亲和层析技术(imobilizedmetalionaffinitychromatography，简称imac)用于酶蛋白之分离，选择性高，能实现高通量、高吸附的分离纯化。分离的原理主要利用蛋白质表面的组氨酸、色氨酸、半胱氨酸等和固定金属离子发生亲和作用实现酶蛋白质的分离。因此，设计聚组氨酸、色氨酸、半胱氨酸、精氨酸等为亲和标签与目的酶蛋白质融合后再用imac进行纯化，可达到预期的分离效果。国内外从乳酸菌中提取亚硝酸盐还原酶和大量表达报道很少，现有技术中利用简单的机械破碎和离心的方法收集粗酶，由于粗酶液中含有大量的杂蛋白，使得后续的分离和纯化工作复杂，无法大量得到目标产物亚硝酸盐还原酶。申请号为201210037774.2的中国发明专利公开了“一种植物乳杆菌的亚硝酸盐还原酶基因及其编码的蛋白质和应用”，其中验证亚硝酸盐还原酶是否表达成功主要的依据为重组微生物的全蛋白sds-page电泳结果，没有进一步深入该重组蛋白的分离纯化、酶活和应用，由于微生物工程菌e.colibl21、e.colide3和jm105在转化前都能表达亚硝酸盐还原酶，通过以上发明的方法，无法很好鉴别亚硝酸盐还原酶的表达是否成功。技术实现要素：为解决现有亚硝酸盐还原酶的大量表达、提取和纯化等方面的不足，本发明提供了—种亚硝酸盐还原酶编码基因重组方法，并提供了一种亚硝酸盐重组蛋白的大量表达和纯化的方法，主要是利用含组氨酸标签(his标签)的原核表达载体pet-28a(+)，进行亚硝酸盐还原酶基因的重组，再将重组载体转化到宿主，并利用转化体进行大量表达亚硝酸盐还原酶，利用亲和层析法进行纯化亚硝酸盐蛋白。为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：一种植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因，其核苷酸序列如seqidno.1所示。含有植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因的重组质粒中含组氨酸标签。一种植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如seqidno.2所示。上述还原酶基因编码的蛋白质的制备方法，包括如下步骤：(1)以ncbi中植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶编码基因为模板，进行上下游引物设计，设计的酶切位点为ncoi、xhoi；(2)lactobacillusplantarum在37℃培养16h后的菌液，提取其dna，并以此为模板，通过pcr技术扩增植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的基因片段(如seqidno.1所示)；(3)利用ncoi、xhoi工具酶将扩增片段和质粒pet-28a(+)于4℃下分别切成具有两个粘性末端的片段；采用回收试剂盒回收以上两个片段，并用t4dna连接酶连接，再转入重组大肠杆菌中，利用抗生素卡纳霉素进行筛选即可获得阳性工程菌；(4)将上述工程菌经诱导表达，采用亲和层析法纯化，即得到重组亚硝酸盐还原酶。所属重组大肠杆菌为e.colidh5α或e.colibl21。步骤(1)中所述上游引物为5-ctcgagaaaagaccatggccaa-3(ncoi)，下游引物为5-cttaagaatcctgtttggac-3(xhoi)。所述诱导表达为加入诱导剂iptg进行诱导，iptg的浓度为1mmol/l。所述亲和层析法为nisepharose亲和层析法。所制备的亚硝酸盐还原酶活性测定时，需在500μl反应体系中加入15μl0.1mol/l电子供体甲基紫精，nir活性测定采用na2s2o4-mv法。本发明制备得到的蛋白质，可以有效的降解食品中的亚硝酸盐，并可以用于对其结构及性质的研究。本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：(1)本发明通过亲和层析作用来验证工程菌可以诱导表达亚硝酸盐还原酶(nir)重组蛋白。(2)本发明可以通过iptg诱导表达得到大量的亚硝酸盐还原酶，可以应用到工业中大量生产亚硝酸盐还原酶。(3)本发明利用亲和层析作用纯化得到纯度较高的nir重组蛋白，解决了从植物乳杆菌中分离出纯度较高亚硝酸盐还原酶的难题。(4)本发明得到的工程菌表达的重组蛋白可以有效的降解亚硝酸盐，可以生产成酶制剂，能有效降解食品中的亚硝酸盐；还可作为抗原用于植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶抗体的制备，并可以用于对其结构及性质方面的研究。附图说明图1为实施例1中利用lactobacillusplantarum基因组dna为模板进行pcr扩增产物鉴定图，其中m为dna分子量；1～5为pcr扩增产物。图2为实施例2中构建的重组质粒进行双酶切鉴定图，其中m为dna分子量；1为pet28a-nir被ncoi、xhoi产物；2为质粒pet28a-nir。图3为实施例3中诱导含有重组质粒pet28a-nir的e.colibl21后的电泳检测结果。m表示蛋白质marker；1为pet28a沉淀；2为pet28a上清；3为未诱导pet28a/bl21(de3)沉淀；4为未诱导pet28a/bl21(de3)上清；5为诱导pet28a-nir/bl21(de3)上清；6为诱导pet28a-nir/bl21(de3)沉淀。图4为实施例4中纯化后的nir的蛋白质的sds-page电泳图，其中m为蛋白质marker；1-4为ni2+柱的80mmol/l、100mmol/l、150mmol/l、300mmol/l咪唑溶液洗脱液。图5为实施例5中酶学性质测定，ph对酶活性的影响趋势图，其中a为重组nir的最适ph，b为酶的ph稳定性。图6为实施例5中酶学性质测定，温度对酶活性的影响趋势图，其中a为重组nir的最适温度，b为酶的热稳定性。具体实施方案下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但是本发明要求保护范围并不局限于此。实施例1植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的基因组dna的制备，包括如下步骤：1、pcr引物设计以genbank中物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的dna设计出pcr引物：上游引物(seqidno.3)为5-ctcgagaaaagaccatggccaa-3(ncoi)，下游引物(seqidno.4)为5-cttaagaatcctgtttggac-3(xhoi)，并人工合成这对上下游引物；2、植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的基因组dna的提取(细菌基因组dna小量纯化试剂盒takaraminibestbacterialgenomicdnaextractionkitver.2.0，为takarabiotechnology公司的产品，购自广州瑞真生物技术有限公司)，其中溶液均为试剂盒中的溶液，具体步骤为：(1)植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)培养物3～4ml于12000rpm离心1min弃上清液，菌体沉淀置于1.5ml的ep中，加0.6ml浓度为10％的溶菌酶溶液，颠倒混匀5～10次后放37℃保温至少30min；植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)已于2014年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，其生物保藏号为cgmccno.1.12935。(2)12000rpm室温离心10min，小心弃上清液。(3)加入150μlspbuffer(含rnaseal)充分悬浮细菌沉淀。(4)加入20μl的lysozyme溶液，均匀混合后室温静置5min。(5)加入30μl的edtabuffer，均匀混合后室温静置5min。(6)加入200μl的solutiona，剧烈震荡后65℃保温10min。(7)加入400μl的solutionb，剧烈震荡15s。(8)加入650μl的solutionc，上下颠倒均匀混合。(9)12000rpm离心lmin。(10)先弃去上层有机相，然后将水相溶液(无色下层)移入预先置于1.5ml离心管上的filtercup中，12000rpm离心lmin。(11)弃filtercup，在滤液中加入450μl的dbbuffer，混合均匀。(12)将试剂盒中的spincolumn置于collectiontube上。(13)将上述(11)的混合液转移至spincolum中，12000rpm离心1min，弃滤液。(14)将500μl的rinsea加入至spincolumn中，12000rpm离心lmin，弃滤液。(15)将700μl的rinseb加入至spincolum中，12000rpm离心1min，弃滤液。(16)重复操作步骤(15)。(17)将spincolumn安置于collectiontube上，12000rpm离心1min。(18)将spincolumn安置于新的1.5ml的离心管上，在spincolumn膜的中央加入60μl的灭菌蒸馏水，室温静置1mina。(19)12000rpm离心lmin洗脱dna。3、目的基因的扩增以步骤2中提取的植物乳杆菌基因组dna为模板，采用pcr方法扩增目的基因片段，pcr反应条件：94℃变性5min。循环参数为：94℃30s，65℃45s(即退火时每圈减少2℃)，72℃1min，5个循环。循环参数为：94℃30s，55℃45s，72℃1min，72℃10s，25个循环，pcr反应结束，得到pcr扩展的植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的基因组dna，如seqidno.1所示；同时设立阴性对照，以无菌水作为模板进行上述操作。用1％琼脂糖电泳检测目的基因pcr产物；电泳检测结果如图1，在1300kb附近有一条明显的dna条带，该dna条带为上述所得的植物乳杆菌nir基因组dna。实施例2含有实施例1所得的pcr扩展的植物乳杆菌nir的基因组dna的重组表达载体的构建，步骤如下：将实施例1所得的pcr扩展的植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的扩增片段dna与质粒pet-28a(+)分别进行ncoi、xhoi酶切，反应条件于37℃过夜14～16h，接着分别回收片段dna和质粒dna。将上述两个片段进行连接，于4℃冰箱冷藏过夜反应14～16h，即得到连接产物，其中连接反应体系为：回收酶切pet28a(+)19μl，回收目的基因片段2.5μl，t4dna连接1μl，t4dna连接酶缓冲液2.5μl；再将上述的连接产物转化至e.colidh5α细胞，即获得重组质粒pet28a(+)-nir；获得的重组质粒pet28a(+)-nir经ncoi和xhoi双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳分析，可见约5.4kb的载体片段和1.3kb的目的基因片段(图2)。对重组表达载体pet28a(+)-nir进行dna测序，结果显示插入基因序列与设计序列完全一致，成功构建了重组表达载体pet28a(+)-nir。实施例3将实施例2构建好的表达载体pet28a(+)-nir质粒，转入e.colibl21感受态细胞中，获得重组大肠杆菌进行诱导表达，其具体步骤如下：将构建好的表达菌株接种到lb/kan液体培养基中，37℃振荡过夜培养14h，然后分别按1％的菌液量接种于含有100mllb/kan液体培养基的三角瓶中，37℃振荡培养4h(菌液od600达到0.4～0.6)时，加入iptg使最终浓度为1mmol/l；同时以空载体和未诱导作对照。将菌液8000r/min离心10min，弃去上清液，沉淀菌体用pbs缓冲液(ph7.4)洗涤两次，将洗涤后的菌体重悬于10ml预冷的pbs缓冲液(ph7.4)中，超声裂解10min，每次3s，间隔5s，功率200w。然后10000r/min，4℃，离心20min，分别上清液、沉淀为蛋白样品经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)检测，记录并分析结果。由图3可知，泳道空载、未诱导宿主菌株和诱导菌株的破碎上清液均未见目的蛋白，而诱导菌株的破碎沉淀泳道约45kd位置处出现特异条带，与预期表达的相对分子质量(44.959kd)相符，其氨基酸序列如seqidno.2所示，说明目的蛋白nir在宿主菌e.colibl21(de3)中成功表达，但只在沉淀中检测到目的蛋白，由此可知，目的蛋白nir在大肠杆菌中以包涵体形式不可溶表达。实施例4将实施例3中破碎离心后的沉淀进行包涵体复性、蛋白纯化及酶活测定，具体步骤如下：将实施例3中的沉淀物用20ml包涵体洗涤液(2mol/l尿素，1‰曲拉通x-100，1‰十二烷基肌氨酸钠，1mmol/ldtt，20mmol/ltris-hcl(ph8.0)，1mmol/ledta，50mmol/lnacl)在4℃条件下洗涤3次，置8000r/min离心20min；洗涤后的沉淀用10ml蛋白质变性液(6mol/l尿素，1mmol/ldtt，1％十二烷基肌氨酸钠)重悬包涵体，8000r/min离心30min，弃掉沉淀；将上述变形后的蛋白液用复性液(20mmol/ltris-hcl，50mmol/lnacl，1mmol/ldtt，0.1％曲拉通x-100，20％甘油)4℃搅拌透析24h后，逐渐换到终浓度10％甘油，4℃搅拌透析24h。透析袋中的目的蛋白包涵体经变性溶解后为粗酶液。粗蛋白用nisepharose亲和层析法进行亲和层析纯化，洗脱的蛋白液4℃保存，蛋白样品经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)检测，记录并分析结果。nir酶活性的测定：nir活性测定采用na2s2o4-mv法。利用甲基紫精作为人工电子供体使nir催化no2-还原为no或nh3。亚硝酸盐还原酶的消耗可以通过反应液中总的亚硝酸盐量减去剩余的no2-量得到。no2-含量可用盐酸萘乙二胺法测定，即在酸性条件下与对氨基苯磺酸发生重氮反应，生成的重氮化合物又与盐酸萘乙二胺生成了紫红色偶氮化合物，可在538nm下显色测定。测定酶活反应体系500μl：0.1mol/l磷酸盐缓冲液(ph6.5)50μl，0.1mol/lnano225μl，0.1mol/lmv15μl，0.1mol/lna2s2o480μl，酶液300μl。37℃水浴中反应10min，剧烈振荡终止反应(以磷酸缓冲液为空白)。取10μl用盐酸萘乙二胺法测定亚硝酸盐残留量。亚硝酸还原酶活力单位通过在37℃下，每分钟还原1μmol亚硝酸盐所消耗的酶量来表示。比活力用1mg蛋白质中酶的活力单位数来表示。在低温条件下，将离心所得的包涵体先用缓冲液洗涤，除去包涵体表面杂质，再对包涵体进行溶解，收集上清液。经透析复性，去除高浓度尿素，逐渐恢复重组蛋白空间构象，检测复性后的蛋白具备相应生物活性。蛋白复性液通过nisepharose亲和层析法纯化重组nir(如图4)。纯化nir总蛋白含量为10.3mg，比活力为226.48u/mg，总活力为2332.72u，总回收率为63.00％，纯化倍数为7.32，如表1所示，由此可以看出重组蛋白可以有效的降解亚硝酸盐。表1重组nir的纯化table1summaryofnirenzyme实施例5测定实施例4中纯化的亚硝酸盐还原酶的酶学性质，具体步骤如下：重组nir的性质分析：最适反应温度：在ph值为6.5的条件下，在4℃、10℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、50℃、60℃、70℃温度下测定酶活，以37℃的酶活为100％计算相对酶活。酶的热稳定性：将酶液分别置于不同温度(4℃、10℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、50℃、60℃、70℃)下水浴40min，在最适反应ph和最适反应温度下检测残余酶活，并以未保温时的酶活为100％计算相对酶活。最适反应ph值：在最适酶活反应温度下，在ph为2.0、3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0的条件下测定酶活，以ph6.5的酶活为100％计算相对酶活，绘制酶活曲线。酶的ph值稳定性：将酶液分别置于不同ph缓冲液(ph2.0、3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0)中水浴40min，在最适反应ph和最适反应温度下检测残余酶活，并以未保温时的酶活为100％计算相对活性，绘制酶活曲线。由图5中a可知，重组nir相对酶活在ph2.0-12.0范围内先升高后降低，在ph为6.5时达到最大值，之后相对酶活逐渐降低，因此，重组nir的最适ph值为6.5。在37℃条件下，分别采用不同ph缓冲液孵育重组nir，结果表明，该酶在ph6.5-8.0之间的稳定性较好，相对酶活保持在60％以上。其中，在ph为7.0时最稳定(图5中b所示)。由图6中a可知，重组nir最适温度为37℃，当温度在4-70℃时具有91％以上的相对酶活。在ph6.5条件下，分别在不同温度下孵育重组nir，结果表明，该酶在4℃-70℃之间的温度稳定性较好，相对酶活保持在85％以上。其中，在37℃时最稳定(图6中b所示)，具有广泛的温度适应性。序列表<110>大连大学<120>一种植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因及其编码的蛋白质和应用<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1257<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1atggcaaaaattattattgtcggggctgcacatggcggccgcgaaacggtcaatggctta60ttagcagctaatacggataatgagattcattggtacgagcacgggcaattcgcgacggct120ttggattgggctccggcggatgctgaaaaagagcggttggccttgtcccagcaggtgact180ctattcgaccaaacgacggtcacaagaattaccccagcgacccacacgattactgctcgt240aatcaacgggggcaattacagactgatcattacgatcgattggtattgagcgttggatcg300ttaccaatccagttaccgattcccggagccgaattatctggtgttcgatcgattcaaaac360cgtgccagcatcaatgagttaaaattggccgctaagtcagcagcaattaaaaacgtggtc420gtgattggaggcggctatattgggatgaattttgcagccttatttaaacaaaccggcaag480caagtaactgttattgatgtgaacgctcggccattcagtcacaatcttgattcagaattt540acgcaaattttagctgcagcgagtgttgagaatgggctgcaattaaagatggaagagcgg600gtgacggccatattaggttcaacacacgtgacagcggtacaaacgaatcgtggtcagtat660gctgccgacttagtccttgtcgcagtcggcaatcggccgaatactgcatggctacgggga720actttgacgctagattctgagggattaattgagacggatgattattttcaaacaagtgtt780ccagatatttacgcgattggcgatgcgactaaagttcggtttacgcccacgggtactaaa840gagcggatcactttaggcagcgcggccagtcatgctggtcggttattagcgcataacttg900ttaacggatcagcgaattgtgtttcccggcgttcaggcaacgtccgcgcttaatgcggcg960ggatattactttgctgctacgggcctaaacacgcaactagctgtccgtatgcaacaacca1020gtgttagcaacttacatcgcggttccccgattggtggcatccgcaccagctcgattgaat1080gcgaccgttcattttaagttgttttatgataaaactcatcggatactaggtgcacaaata1140atggctacagcagaattaacggcggtcatcaataccgtttcgctcgcaatccagatggga1200gcaacgctcgagcaattagcctatggtgactttttctttcaaccgggattaagctag1257<210>2<211>418<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>2metalalysileileilevalglyalaalahisglyglyarggluthr151015valasnglyleuleualaalaasnthraspasngluilehistrptyr202530gluhisglyglnphealathralaleuasptrpalaproalaaspala354045glulysgluargleualaleuserglnglnvalthrleupheaspgln505560thrthrvalthrargilethrproalathrhisthrilethralaarg65707580asnglnargglyglnleuglnthrasphistyraspargleuvalleu859095servalglyserleuproileglnleuproileproglyalagluleu100105110serglyvalargserileglnasnargalaserileasngluleulys115120125leualaalalysseralaalailelysasnvalvalvalileglygly130135140glytyrileglymetasnphealaalaleuphelysglnthrglylys145150155160glnvalthrvalileaspvalasnalaargpropheserhisasnleu165170175aspsergluphethrglnileleualaalaalaservalgluasngly180185190leuglnleulysmetglugluargvalthralaileleuglyserthr195200205hisvalthralavalglnthrasnargglyglntyralaalaaspleu210215220valleuvalalavalglyasnargproasnthralatrpleuarggly225230235240thrleuthrleuaspsergluglyleuilegluthraspasptyrphe245250255glnthrservalproaspiletyralaileglyaspalathrlysval260265270argphethrprothrglythrlysgluargilethrleuglyserala275280285alaserhisalaglyargleuleualahisasnleuleuthraspgln290295300argilevalpheproglyvalglnalathrseralaleuasnalaala305310315320glytyrtyrphealaalathrglyleuasnthrglnleualavalarg325330335metglnglnprovalleualathrtyrilealavalproargleuval340345350alaseralapr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