两种催化桃UDP-鼠李糖生物合成的基因及编码蛋白和应用的制作方法

本发明属于植物分子生物技术和基因工程领域，涉及两种催化桃udp-鼠李糖生物合成的基因及其编码蛋白和应用。

背景技术：

核苷糖，是细胞壁生物合成和蛋白质和脂质糖基化等过程所必需的活化糖供体。udp-鼠李糖是众多核苷糖中的一种，在结构上是由一分子的尿苷二磷酸和一分子的鼠李糖所组成，是构建鼠李糖基衍生物的重要中间体。

由于植物体内udp-鼠李糖含量低、纯化难度大且效率低，限制了udp-鼠李糖的获取，而利用现代化学合成手段合成成本较高且过程繁琐，迄今为止，市场上还没有商品化的udp-鼠李糖。而采用生物合成udp-鼠李糖的方法，为udp-鼠李糖的合成提供了新途径。因此鉴别出高效催化udp-鼠李糖生物合成的基因，对于植物udp-鼠李糖的生物合成调控和实现udp-鼠李糖的商品化生产具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供两种催化udp-鼠李糖生物合成的基因及其编码蛋白，所述两种基因为pprhm1和pprhm2，所述pprhm1基因的cds序列如seq:no.1所示，编码序列全长为2028个核苷酸，其编码蛋白的氨基酸序列如seq:no.3所示，可编码一个含675个氨基酸的蛋白；所述pprhm2基因的cds序列如seq:no.2所示，编码序列全长为2016个核苷酸，其编码蛋白的氨基酸序列如seq:no.4所示，可编码一个含671个氨基酸的蛋白。

本发明的另一个目的是提供所述两个基因pprhm1和pprhm2及其编码蛋白在植物udp-鼠李糖的生物合成中的应用，是在植物udp-鼠李糖生物合成调控和商业化合成中的应用。通过将上述基因pprhm1和pprhm2分别连接到pet-28a载体的多克隆位点中构建获得重组质粒，命名为pet-28a-pprhm1和pet-28a-pprhm2。在大肠杆菌中表达pet-28a-pprhm1和pet-28a-pprhm2，得到重组蛋白，可将udp-葡萄糖转化为udp-鼠李糖。

本发明提供了两种催化udp-鼠李糖生物合成的基因pprhm1和pprhm2及其编码蛋白在植物udp-鼠李糖生物合成调控和商业化合成中的应用。本发明首次克隆并验证了桃中udp-鼠李糖合成相关pprhm1和pprhm2基因的功能。本发明还提供了分别含有pprhm1和pprhm2基因的重组质粒pet-28a-pprhm1和pet-28a-pprhm2，为通过生物工程方法大量合成udp-鼠李糖，进一步开展鼠李糖基衍生物生物合成调控研究奠定基础。

附图说明

图1：桃pprhm1重组蛋白的sds-page凝胶电泳分析图；1为蛋白marker，2为纯化所得pprhm1重组蛋白。

图2：桃pprhm2重组蛋白的sds-page凝胶电泳分析图；1为蛋白marker，2为纯化所得pprhm2重组蛋白。

图3：两种重组蛋白催化酶活产物结果图；其中，a：底物udp-葡萄糖标准品；b：未加蛋白空白对照；c：pprhm1重组蛋白催化反应；d：pprhm2重组蛋白催化反应。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步的阐述，但实施例不限制本发明的保护范围。

实施例1：桃pprhm1和pprhm2基因克隆

以‘湖景蜜露’桃品种为材料，取根、茎、叶、花、果实，迅速用液氮冻透，然后放至-80℃冰箱中保存。利用ctab法提取桃各组织的rna，按照primescript^tmrtreagentkitwithgdnaeraser(takara)试剂说明书操作合成cdna。

以反转录产物cdna各组织混样为模板，用seq:no.5和seq:no.6所示引物进行pcr扩增pprhm1，用seq:no.7和seq:no.8所示引物进行pcr扩增pprhm2，pcr反应体系为50μl，组分分别为：2×phantamaxbuffer25μl，dntpmix(10mmeach)1μl，dnapolymerse(1u/μl)1μl，上下游引物(10μm)各2μl，cdna1μl，h2o18μl。pcr程序为：95℃预变性3min，95℃变性15s，58℃退火15s和72℃延伸1min40s，72℃继续延伸5min，得到扩增产物。

将两种pcr扩增产物分别连接到t-easy载体，转化dh5α大肠杆菌感受态细胞，进行菌落pcr验证，获得阳性菌落进行测序。获得与基因组数据库相匹配的基因序列seq:no.1和seq:no.2。

实施例2：pprhm1和pprhm2的原核表达

设计带有表达载体pet-28a载体的多克隆酶切位点的特异引物，pprhm1引物序列如seq:no.9和seq:no.10所示，pprhm2引物序列如seq:no.11和seq:no.12所示。

以测序正确返还质粒为模板，用seq:no.9和seq:no.10所示引物进行pcr扩增pprhm1，用seq:no.11和seq:no.12所示引物进行pcr扩增pprhm2，pcr反应体系为50μl，组分分别为：2×phantamaxbuffer25μl，dntpmix(10mmeach)1μl，dnapolymerse(1u/μl)1μl，上下游引物(10μm)各2μl，cdna1μl，h2o18μl。pcr程序为：95℃预变性3min，95℃变性15s，58℃退火15s和72℃延伸1min40s，72℃继续延伸5min，得到扩增产物。

将两种pcr扩增产物分别连接到用sali和hindiii双酶切过的pet-28a载体，获得pet-28a-pprhm1和pet-28a-pprhm2重组质粒。

将pet-28a-pprhm1和pet-28-pprhm2重组质粒分别转化到大肠杆菌bl21(de3)plyss(购于上海普洛麦格生物产品有限公司)表达宿主菌中，经菌落pcr验证，挑取阳性菌落接种到200mllb液体培养基，37℃摇菌，直至od600约为0.6-0.8，获得转基因工程菌。

在上述转基因的工程菌中加入iptg至终浓度为0.5mm，16℃诱导24h，收集菌体，200ml收集1管，加入15ml1×pbs缓冲液，充分悬浮菌体，-80℃放置24h以上，将菌体置于30℃水浴锅解冻后，超声破碎10min，10000rpm离心30min，收集上清液。用clontechhistalon试剂盒进一步纯化目的蛋白。利用sds-page方法检测蛋白表达和纯化效果，结果如图1和图2所示。

图1和图2中可看出，pet-28a-pprhm1和pet-28a-pprhm2重组质粒转化到表达宿主大肠杆菌bl21(de3)plyss，经iptg诱导后，有重组蛋白的表达，上清蛋白经clontechhistalon试剂盒纯化后得到较纯的重组蛋白，且重组蛋白条带大小与预测的一致，加上重组标签后在75kda左右有明显的重组蛋白条带。纯化的蛋白可用于进一步的酶学分析。

实施例3：pprhm1和pprhm2重组蛋白的酶学活性检测分析

对于udp-鼠李糖底物的酶活检测，反应体系为200μl，含有100mm的na2hpo4/nah2po4(ph＝9)缓冲液包含1mmudp-葡萄糖作为反应底物，2mm的nad辅酶和2mm的nadph辅酶，20μl纯化后的重组蛋白。

所有酶反应体系在37℃反应1h后停止反应，获得酶反应产物。酶反应产物经产物标准品结合hplc进行检测鉴定，所述hplc检测条件如下：waters2695-2996dad检测器，odsc18柱(4.6×250mm)色谱柱。1.5％三乙胺水溶液(甲酸调ph＝7.5)为流动相，等度洗脱25min，检测波长为260nm，柱温为25℃，流速为1ml/min，进样体积为10μl。

结果如图3所示，可以看出pprhm1和pprhm2重组蛋白以udp-葡萄糖为反应底物，可催化udp-葡萄糖生成udp-鼠李糖，催化流程如下所示：

序列表

<110>浙江大学

<120>两种催化桃udp-鼠李糖生物合成的基因及编码蛋白和应用

<160>12

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2028

<212>dna

<213>桃(prunuspersica)

<400>1

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<213>桃(prunuspersica)

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100105110

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130135140

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151015

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325330335

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<213>人工序列(unknow)

<400>12

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