一株能够缓解特应性皮炎的长双歧杆菌及其应用的制作方法

本发明涉及一株能够缓解特应性皮炎的长双歧杆菌及其应用，属于微生物技术领域以及医药技术领域。

背景技术：

特应性皮炎(atopicdermatitis，ad)是一种慢性、复发性、炎症性的皮肤病，病发时往往伴有剧烈瘙痒，同时伴有其他过敏性疾病的皮肤病。同时，ad是一种常见的非传染性皮肤疾病，在全球大多数国家影响高达20％的儿童以及2-8％的成年人(wollenberga等，2018)，其临床表现形式多样化，依据其发生、发展以及分布特点，可分为婴儿期、儿童期、青少年与成人期三个阶段，其中，大多数ad患者在婴儿期发生，病情严重者甚至可持续至成年期，由于其反复性严重影响患者的生活质量，是世界性的公共卫生问题之一。

ad的表现和哮喘和过敏性鼻炎类似，主要与分泌白细胞介素-4(il-4)、白细胞介素-13(il-13)等的t淋巴细胞的局部浸润有关，而il-4、il-13与调节辅助性t细胞2(th2)的表型的发展相关，会导致免疫球蛋白(ig)超量产生以及嗜酸性粒细胞增多；同时，总ige和过敏原特异性ige水平增高也是ad的一个特征，至少50％以上的ad患者都具备这一特征，而且这种ige主要是针对外界环境致敏原。

因此，ad的发生和发展过程中存在多个异常免疫反应环节，如：朗格汉斯细胞和皮肤树突细胞对变应原的提呈、th2为主的异常免疫反应、调节性t细胞功能障碍、ige过度产生和嗜酸性粒细胞升高等。

ad的发病则与遗传和环境等因素关系密切，但真正导致ad的发病机制尚不清楚。大约60％的ad的患者，可能会出特应性过敏家族史，如果父母一方具有特应性过敏的体质，那么存在60％的可能性子女将具有特应性过敏症；除却遗传因素，ad的病因中需要考虑的免疫因素是：对食物过敏、接触过敏原和刺激物而诱发的过敏、气源性致敏原诱发的过敏以及免疫调节异常。

现阶段，尚不存在针对ad的具有明确疗效的治疗药物，因此，目前主要是通过外用药物如糖皮质激素类药物，钙调神经磷酸酶抑制剂，外用抗微生物制剂，抗组胺药和抗炎症介质药物，免疫抑制剂等缓解ad的症状。

但是，上述药物存在较大的不良反应，并且，多数患者对激素类药物存在顾虑，这些不仅给ad治疗带来了极大的困难，同时，也给患者的生活带来了极大的困扰，此外，这些药物对于个别患者来说存在较差的耐受性。

因此，仍然需要一种药物或治疗方式，既不会给患者带来副作用，同时，也能够用于对抗过敏的发作和皮肤炎症的发展，缓解患者皮肤瘙痒、湿疹等症状，并且，还能够应用于各类别的患者，对患者具有良好的耐受性。

技术实现要素：

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一株可缓解特应性皮炎且无副作用的长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)。

[技术方案]

为解决上述问题，本发明提供了一株长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)ccfm1029，所述长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)ccfm1029已于2018年10月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmccno.60461，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

所述长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)ccfm1029是从来源于浙江杭州地区的健康人体粪便样本中分离得到的，该菌株经测序分析，其16srrna序列如seqidno.1所示，将测序得到的序列在ncbi中进行核酸序列比对，结果显示菌株为长双歧杆菌，命名为长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)ccfm1029。

所述长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)ccfm1029在mrs培养基上的菌落凸面至垫状，边缘完整，柔软，湿润，白色有光泽。

本发明提供了上述一株长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)ccfm1029在制备预防和/或治疗特应性皮炎的产品中的应用。

本发明的一种实施方式中，所述产品中，长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)ccfm1029的活菌数为不低于1×10⁶cfu/ml或1×10⁶cfu/g。

本发明的一种实施方式中，所述产品包含食品、药品或保健品。

本发明的一种实施方式中，所述药品含有长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)ccfm1029、药物载体和/或药用辅料。

本发明的一种实施方式中，所述食品包含使用含有长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)ccfm1029的发酵剂生产得到的乳制品、豆制品或果蔬制品；或所述食品包含含有长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)ccfm1029的固体饮料

本发明提供了一种用于预防和/或治疗特应性皮炎的产品，所述产品含有上述长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)ccfm1029。

本发明的一种实施方式中，所述产品中，长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)ccfm1029的活菌数为不低于1×10⁶cfu/ml或1×10⁶cfu/g。

本发明的一种实施方式中，所述产品包含食品、药品或保健品。

本发明的一种实施方式中，所述药品含有长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)ccfm1029、药物载体和/或药用辅料。

本发明的一种实施方式中，所述食品包含使用含有长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)ccfm1029的发酵剂生产得到的乳制品、豆制品或果蔬制品；或所述食品包含含有长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)ccfm1029的固体饮料。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵剂的制备方法为将长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)ccfm1029按照占培养基总质量2～4％的接种量接种到培养基中，于37℃下培养18h，得到培养液；将培养液离心，得到菌体；将菌体用ph为7.2～7.4的磷酸盐缓冲液清洗3次后用冻干保护剂重悬，得到重悬液；将重悬液采用真空冷冻法进行冻干，得到发酵剂。

在本发明的一种实施方式中，所述冻干保护剂和菌体的质量比为2:1。

在本发明的一种实施方式中，所述培养基包含占培养基总质量87.7％的水、10％的脱脂乳、0.5％的葡萄糖、1.5％的胰蛋白胨以及0.3％的酵母浸膏溶解。

在本发明的一种实施方式中，所述培养基的ph为6.8。

在本发明的一种实施方式中，所述保护剂包含100g/l的脱脂奶粉、150g/l的海藻糖以及10g/l的l-谷氨酸钠。

有益效果：

1、本发明筛选出了一株长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)ccfm1029，此长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)ccfm1029具有缓解特应性皮炎的作用，具体体现在：

(1)显著改善特应性皮炎小鼠的耳朵肿胀程度；

(2)显著改善特应性皮炎小鼠皮肤病理症状以及炎症细胞浸润的作用；

(3)通过调节小鼠体内免疫系统进而显著降低特应性皮炎小鼠血清中总ige水平；

(4)有利于降低小鼠体内肥大细胞脱颗粒现象进而显著改善特应性皮炎小鼠皮炎炎症；

(5)显著降低小鼠局部组织中与th2细胞相关的细胞因子(il-4、il-13)水平进而恢复特应性皮炎小鼠局部组织中th1/th2之间的免疫平衡；

(6)显著降低小鼠局部组织中组胺的释放，减轻特应性皮炎小鼠皮肤瘙痒症状，从而缓解特应性皮炎小鼠皮炎炎症，

因此，长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)ccfm1029在制备预防和/或治疗特应性皮炎的产品(如食品、药品或保健品等)中，具有巨大的应用前景；

2、长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)是益生菌的一种，目前已被纳入卫生部下发的《可用于食品的菌种名单》，具有调节肠道健康的功效，因此，本发明筛选得到的长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)ccfm1029对人体而言，相对健康，无副作用。

生物材料保藏

一株长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)ccfm1029，分类学命名为bifidobacteriumlongum，已于2018年10月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmccno.60461，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

附图说明

图1：不同组别降低特应性皮炎小鼠耳朵厚度的效果对比；

图2：不同组别缓解特应性皮炎小鼠皮肤病理学症状的效果对比；

图3：不同组别降低特应性皮炎小鼠皮肤嗜酸粒细胞浸润的效果对比；

图4：不同组别降低特应性皮炎小鼠血清总ige水平的效果对比；

图5：不同组别降低特应性皮炎小鼠皮肤组织中il-4水平的效果对比；

图6：不同组别降低特应性皮炎小鼠皮肤组织中il-13水平的效果对比；

图7：不同组别降低特应性皮炎小鼠皮肤组织中组胺水平的效果对比；

其中，“*”表示与model组具有显著性差异(p<0.05)，“**”表示与model组具有极其显著的差异(p<0.01)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。

下述实施例中涉及的脱脂乳购自光明乳业股份有限公司，葡萄糖与酵母浸膏购自国药集团化学试剂有限公司，胰蛋白胨购自英国oxoid公司，酶联免疫吸附测定试剂盒均购自南京森贝伽生物技术有限公司。

下述实施例中涉及的培养基如下：

mrs固体培养基(g/l)：蛋白胨10g/l、牛肉膏10g/l、葡萄糖20g/l、乙酸钠2g/l、酵母粉5g/l、柠檬酸氢二铵2g/l、k2po4·3h2o2.6g/l、mgso4·7h2o0.1g/l、mnso40.05g/l、吐温801ml/l、琼脂20g/l、半胱氨酸氨酸盐0.5g/l。

mrs液体培养基(g/l)：蛋白胨10g/l、牛肉膏10g/l、葡萄糖20g/l、乙酸钠2g/l、酵母粉5g/l、柠檬酸氢二铵2g/l、k2po4·3h2o2.6g/l、mgso4·7h2o0.1g/l、mnso40.05g/l、吐温801ml/l、半胱氨酸氨酸盐0.5g/l。

实施例1：长双歧杆菌的筛选及菌种鉴定

1、筛选

以来源于浙江杭州地区的健康人体粪便为样本，将样本经预处理后，在20％左右甘油中保存于-80℃冰箱，取出解冻后，混匀样本吸取0.5ml样本加到4.5ml，以含有0.05％半胱氨酸的0.9％生理盐水进行梯度稀释，选择合适的梯度稀释液涂布在加了0.05％半胱氨酸的mrs固体培养基上，于37℃培养48h，挑取典型菌落至mrs固体培养基上划线纯化，挑取单菌落转接至mrs液体培养基(含0.05％半胱氨酸)增菌，30％甘油保藏，得到菌株ccfm1029、菌株a1和菌株a2。

2、鉴定

提取ccfm1029、a1、a2的基因组，将ccfm1029、a1、a2的16srdna进行扩增和测序(由英潍捷基(上海)贸易有限公司进行，ccfm1029、a1、a2的16srdna扩增的核苷酸序列分别如seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3所示，菌种鉴定的上游引物27f序列如seqidno.4所示：5'-agagtttgatcctggctcag-3'、下游引物1492r序列如seqidno.5所示：5'-ggttaccttgttacgactt-3')，将该序列在ncbi中进行核酸序列比对，结果显示菌株为长双歧杆菌，命名为长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)ccfm1029、长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)a1和长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)a2。

实施例2：长双歧杆菌的培养

将长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)ccfm1029接入mrs固体培养基(含0.05％半胱氨酸)中于37℃培养48h后，观察其菌落，发现其菌落凸面至垫状，边缘完整，柔软，湿润，白色有光泽。

将长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)ccfm1029接入mrs液体培养基(含0.05％半胱氨酸)中于37℃厌氧培养24h后，转入新鲜的mrs液体培养基(含0.05％半胱氨酸)中，同样条件培养24h，6000g离心菌体15min，0.9％生理盐水洗涤菌体后6000g再次离心10min，得到菌体，用30％蔗糖溶液重悬，冻存在-80℃待用。

实施例3：不同长双歧杆菌对特应性皮炎小鼠耳朵厚度的影响

取体重在18-20g的健康雌性c57bl/6小鼠50只，随机分为5组，每组10只，5组分别为：空白组(control)、给药2，4-二硝基氟苯(2，4-dinitrofluorobenzene，dnfb)的模型组(model)、给药长双歧杆菌ccfm1029的ccfm1029组、给药长双歧杆菌a1的a1组、给药长双歧杆菌a2的a2组，其中，ccfm1029组、a1组、a2组均为治疗组。

实验共四周：第一周为小鼠适应期；第二周开始灌胃直至实验结束，治疗组分别灌胃长双歧杆菌ccfm1029、a1、a2菌液，以0.2ml菌液(单次灌胃活菌总量为1×10⁹cfu)/只/次的剂量进行灌胃，空白组与模型组不进行菌液干预，仅灌胃等量生理盐水作为对照；第三周到第四周为造模期，造模第1天，利用50μl浓度为0.5％的dnfb溶液涂搽模型组与治疗组小鼠右耳处进行皮损致敏与激发，第5天、第8天、第11天、第14天利用20μl浓度为0.2％的dnfb溶液涂搽模型组与治疗组小鼠右耳处，空白组小鼠右耳仅涂等量搽丙酮/橄榄油基质溶液作为对照；所有分组均为自由饮水和摄食。

造模开始前(即第0天)利用数显螺旋测微尺测定5组小鼠的耳朵厚度，造模结束后(即第15天)取血并处死小鼠，然后立刻测定小鼠耳朵厚度，检测结果如图1。

由图1可知，长双歧杆菌ccfm1029和长双歧杆菌a1均可显著降低特应性皮炎小鼠耳朵的厚度，缓解小鼠耳朵的肿胀程度；而长双歧杆菌a2则无明显缓解作用。

以上实验结果说明，长双歧杆菌ccfm1029具有缓解特应性皮炎小鼠耳朵的厚度及肿胀程度的作用。

实施例4：不同长双歧杆菌对特应性皮炎小鼠皮肤病理症状的影响

取体重在18-20g的健康雌性c57bl/6小鼠50只，随机分为5组，每组10只，5组分别为：空白组(control)、给药2，4-二硝基氟苯(2，4-dinitrofluorobenzene，dnfb)的模型组(model)、给药长双歧杆菌ccfm1029的ccfm1029组、给药长双歧杆菌a1的a1组、给药长双歧杆菌a2的a2组，其中，ccfm1029组、a1组、a2组均为治疗组。

实验共四周：第一周为小鼠适应期；第二周开始灌胃直至实验结束，治疗组分别灌胃长双歧杆菌ccfm1029、a1、a2菌液，以0.2ml菌液(单次灌胃活菌总量为1×10⁹cfu)/只/次的剂量进行灌胃，空白组与模型组不进行菌液干预，仅灌胃等量生理盐水作为对照；第三周到第四周为造模期，造模第1天，对5组小鼠背部皮肤进行脱毛处理，面积大约为2.5cm×2.5cm，并用50μl浓度为0.5％的dnfb溶液涂搽模型组与治疗组小鼠背部脱毛区进行皮损致敏与激发，第5天、第8天、第11天、第14天利用20μl浓度为0.2％的dnfb溶液涂搽模型组与治疗组小鼠背部脱毛区，空白组小鼠背部脱毛区仅涂等量搽丙酮/橄榄油基质溶液作为对照；所有分组均为自由饮水和摄食。

造模结束后(即第15天)取血并处死小鼠，取小鼠背部脱毛区皮肤进行组织病理学分析，通过对小鼠背部皮肤组织病理学切片进行苏木精-伊红染色，然后通过职业技术人员进行组织病理评分(结果如图2)。

由图2可知，空白组(control)小鼠背部皮肤表皮细胞结构正常，表皮各层未见炎症反应；模型组(model)小鼠背部皮损病理学呈明显炎症増生性改变，淋巴细胞和浆细胞浸润，同时背部皮肤糜烂，存在纤维组织增生；长双歧杆菌ccfm1029组治疗组小鼠背部皮肤表皮细胞结构近乎正常，表皮各层无较为严重的炎症反应；而长双歧杆菌a1、长双歧杆菌a2两组长双歧杆菌治疗组纤维组织增生明显，存在较为少量的炎症，缓解了小鼠皮肤特应性皮炎的病理学症状，剩余其他各组表皮细胞结构显然不完整，推测皮肤有破溃、结痂，存在严重的炎症反应。

以上实验表明，长双歧杆菌ccfm1029可显著改善特应性皮炎小鼠皮肤炎症。

实施例5：不同长双歧杆菌对特应性皮炎小鼠嗜酸粒细胞浸润的影响

取体重在18-20g的健康雌性c57bl/6小鼠50只，随机分为5组，每组10只，5组分别为：空白组(control)、给药2，4-二硝基氟苯(2，4-dinitrofluorobenzene，dnfb)的模型组(model)、给药长双歧杆菌ccfm1029的ccfm1029组、给药长双歧杆菌a1的a1组、给药长双歧杆菌a2的a2组，其中，ccfm1029组、a1组、a2组均为治疗组。

实验共四周：第一周为小鼠适应期；第二周开始灌胃直至实验结束，治疗组分别灌胃长双歧杆菌ccfm1029、a1、a2菌液，以0.2ml菌液(单次灌胃活菌总量为1×10⁹cfu)/只/次的剂量进行灌胃，空白组与模型组不进行菌液干预，仅灌胃等量生理盐水作为对照；第三周到第四周为造模期，造模第1天，对5组小鼠背部皮肤进行脱毛处理，面积大约为2.5cm×2.5cm，并用50μl浓度为0.5％的dnfb溶液涂搽模型组与治疗组小鼠背部脱毛区进行皮损致敏与激发，第5天、第8天、第11天、第14天利用20μl浓度为0.2％的dnfb溶液涂搽模型组与治疗组小鼠背部脱毛区，空白组小鼠背部脱毛区仅涂等量搽丙酮/橄榄油基质溶液作为对照；所有分组均为自由饮水和摄食。

造模结束后(即第15天)取血并处死小鼠，取小鼠背部脱毛区皮肤进行组织病理学分析，通过对小鼠背部皮肤组织病理学切片进行苏木精-伊红染色，然后通过职业技术人员进行嗜酸粒细胞计数分析(结果如图3)。

由图3可知，长双歧杆菌ccfm1029显著降低了皮肤组织中嗜酸粒细胞的数目，降低了嗜酸粒细胞产生的炎症浸润，从而抑制了皮肤组织炎症；而长双歧杆菌a1、长双歧杆菌a2两组则不能抑制组织中嗜酸粒细胞的数量，对组织炎症浸润无显著影响，不能缓解小鼠的皮肤炎症。

以上实验表明，长双歧杆菌ccfm1029可显著抑制特应性皮炎小鼠皮肤嗜酸粒细胞产生的炎症浸润。

实施例6：不同长双歧杆菌对特应性皮炎小鼠血清总ige水平的影响

取体重在18-20g的健康雌性c57bl/6小鼠50只，随机分为5组，每组10只，5组分别为：空白组(control)、给药2，4-二硝基氟苯(2，4-dinitrofluorobenzene，dnfb)的模型组(model)、给药长双歧杆菌ccfm1029的ccfm1029组、给药长双歧杆菌a1的a1组、给药长双歧杆菌a2的a2组，其中，ccfm1029组、a1组、a2组均为治疗组。

实验共四周：第一周为小鼠适应期；第二周开始灌胃直至实验结束，治疗组分别灌胃长双歧杆菌ccfm1029、a1、a2菌液，以0.2ml菌液(单次灌胃活菌总量为1×10⁹cfu)/只/次的剂量进行灌胃，空白组与模型组不进行菌液干预，仅灌胃等量生理盐水作为对照；第三周到第四周为造模期，造模第1天，对5组小鼠背部皮肤进行脱毛处理，面积大约为2.5cm×2.5cm，并用50μl浓度为0.5％的dnfb溶液涂搽模型组与治疗组小鼠背部脱毛区进行皮损致敏与激发，第5天、第8天、第11天、第14天利用20μl浓度为0.2％的dnfb溶液涂搽模型组与治疗组小鼠背部脱毛区，空白组小鼠背部脱毛区仅涂等量搽丙酮/橄榄油基质溶液作为对照；所有分组均为自由饮水和摄食。

造模结束后(即第15天)取血并处死小鼠，取小鼠血清，通过酶联免疫吸附测定试剂盒测定血清总ige水平(结果如图4)。

由图4可知，与模型组(model)相比，长双歧杆菌ccfm1029显著降低了小鼠血清总ige水平，有利于抑制th2型免疫反应，从而有助于缓解特应性皮炎的病理炎症；而长双歧杆菌a1、长双歧杆菌a2两组则不能抑制血清ige合成，故长双歧杆菌a1、a2干预对特应性皮炎的病理炎症无显著影响。

以上实验表明，长双歧杆菌ccfm1029可显著降低了小鼠血清总ige水平，有利于缓解特应性皮炎的病理炎症。

实施例7：不同长双歧杆菌对特应性皮炎小鼠皮肤组织中il-4、il-13水平的影响

取体重在18-20g的健康雌性c57bl/6小鼠50只，随机分为5组，每组10只，5组分别为：空白组(control)、给药2，4-二硝基氟苯(2，4-dinitrofluorobenzene，dnfb)的模型组(model)、给药长双歧杆菌ccfm1029的ccfm1029组、给药长双歧杆菌a1的a1组、给药长双歧杆菌a2的a2组，其中，ccfm1029组、a1组、a2组均为治疗组。

实验共四周：第一周为小鼠适应期；第二周开始灌胃直至实验结束，治疗组分别灌胃长双歧杆菌ccfm1029、a1、a2菌液，以0.2ml菌液(单次灌胃活菌总量为1×10⁹cfu)/只/次的剂量进行灌胃，空白组与模型组不进行菌液干预，仅灌胃等量生理盐水作为对照；第三周到第四周为造模期，造模第1天，对5组小鼠背部皮肤进行脱毛处理，面积大约为2.5cm×2.5cm，并用50μl浓度为0.5％的dnfb溶液涂搽模型组与治疗组小鼠背部脱毛区进行皮损致敏与激发，第5天、第8天、第11天、第14天利用20μl浓度为0.2％的dnfb溶液涂搽模型组与治疗组小鼠背部脱毛区，空白组小鼠背部脱毛区仅涂等量搽丙酮/橄榄油基质溶液作为对照；所有分组均为自由饮水和摄食。

造模结束后(即第15天)取血并处死小鼠，然后取小鼠背部脱毛区皮肤组织，通过酶联免疫吸附测定试剂盒测定th2型免疫反应细胞因子il-4、il-13的水平(结果如图5-6)。

由图5-6可知，与模型组(model)相比，长双歧杆菌ccfm1029显著降低了小鼠皮肤组织il-4，il-13水平，显著地抑制了th2型免疫反应，从而有助于缓解由th2型异常免疫反应引起的病理炎症状态；而长双歧杆菌a1、长双歧杆菌a2两组则不能降低皮肤组织il-4，il-13水平，故长双歧杆菌a1、a2干预对特应性皮炎的病理炎症无显著影响。

以上实验表明，长双歧杆菌ccfm1029可显著降低th2型免疫反应相关细胞因子il-4，il-13的水平，有助于缓解由th2型异常免疫反应引起的病理炎症状态。

实施例8：不同长双歧杆菌对特应性皮炎小鼠皮肤组织中组胺水平的影响

取体重在18-20g的健康雌性c57bl/6小鼠50只，随机分为5组，每组10只，5组分别为：空白组(control)、给药2，4-二硝基氟苯(2，4-dinitrofluorobenzene，dnfb)的模型组(model)、给药长双歧杆菌ccfm1029的ccfm1029组、给药长双歧杆菌a1的a1组、给药长双歧杆菌a2的a2组，其中，ccfm1029组、a1组、a2组均为治疗组。

实验共四周：第一周为小鼠适应期；第二周开始灌胃直至实验结束，治疗组分别灌胃长双歧杆菌ccfm1029、a1、a2菌液，以0.2ml菌液(单次灌胃活菌总量为1×10⁹cfu)/只/次的剂量进行灌胃，空白组与模型组不进行菌液干预，仅灌胃等量生理盐水作为对照；第三周到第四周为造模期，造模第1天，对5组小鼠背部皮肤进行脱毛处理，面积大约为2.5cm×2.5cm，并用50μl浓度为0.5％的dnfb溶液涂搽模型组与治疗组小鼠背部脱毛区进行皮损致敏与激发，第5天、第8天、第11天、第14天利用20μl浓度为0.2％的dnfb溶液涂搽模型组与治疗组小鼠背部脱毛区，空白组小鼠背部脱毛区仅涂等量搽丙酮/橄榄油基质溶液作为对照；所有分组均为自由饮水和摄食。

造模结束后(即第15天)取血并处死小鼠，然后取小鼠背部脱毛区皮肤组织，通过酶联免疫吸附测定试剂盒测定与肥大细胞脱颗粒情况相关的炎症因子：组胺(结果如图7)。

由图7可知，与模型组(model)相比，长双歧杆菌ccfm1029显著降低了小鼠皮肤组织组胺的水平，从而可推断出长双歧杆菌ccfm1029显著地降低了肥大细胞的脱颗粒情况，阻止了皮肤损伤组织中组胺的释放，缓解小鼠的皮肤瘙痒情况；而长双歧杆菌a1、长双歧杆菌a2两组不能降低皮肤组织中组胺的水平，甚至促进了组胺的释放，故长双歧杆菌a1、a2干预无法抑制组织中肥大细胞的脱颗粒情况，从而阻止组胺的释放，故无法缓解小鼠皮肤的瘙痒。

以上实验表明，长双歧杆菌ccfm1029可显著降低皮肤组织中组胺的水平，抑制了皮肤组织中肥大细胞的脱颗粒情况，从而缓解了小鼠皮肤的瘙痒，阻止了特应性皮炎的进一步发展。

实施例9：含有长双歧杆菌ccfm1029固体饮料的制备

将长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)ccfm1029按照占培养基总质量3％的接种量接种到培养基中，于37℃下培养18h，得到培养液；将培养液离心，得到菌体；将培养液离心，得到菌体；将菌体用ph为7.2～7.4的磷酸盐缓冲液清洗3次后用海藻糖浓度为100g/l的海藻糖冻干保护剂重悬(冻干保护剂和菌体的质量比为2:1)，得到重悬液；将重悬液采用真空冷冻法进行冻干，得到长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)ccfm1029菌粉；其中，所述培养基包含占培养基总质量87.7％的水、10％的酶水解脱脂乳、0.5％的葡萄糖、1.5％的胰蛋白胨以及0.3％的酵母浸膏溶解；所述培养基的ph为6.8；

将含有1×10¹⁰cfu的长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)ccfm1029菌粉同麦芽糊精进行混合，菌粉和麦芽糊精总质量为1克，得到富含长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)ccfm1029的固体饮料。

取10克上述含有长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)ccfm1029的固体饮料，用生理盐水复溶，定容到20ml，每只小鼠每天灌胃0.2ml，连续三周，可有效缓解小鼠特应性皮炎的症状，在预防和/或治疗特应性皮炎有极好的效果。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110>江南大学

<120>一株能够缓解特应性皮炎的长双歧杆菌及其应用

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