本发明属于饲料
技术领域：
，具体涉及一种降低氨态氮的苜蓿青贮发酵剂及苜蓿青贮的制备方法。
背景技术：
：紫花苜蓿(medicagosativa)是奶牛养殖中应用广泛的优质蛋白类牧草，被誉为牧草之王。我国气候属雨热同季，在夏季降水较多的区域苜蓿收获常与雨季重合，损失较大。青贮作为提升牧草饲用价值的有效手段之一，是解决苜蓿雨季收贮困难的优选方法。苜蓿青贮(alfalfasilage)，柔软多汁、适口性好且消化率高，便于长期保存。青贮中氨态氮比值越大，则表明蛋白质分解越多，青贮质量不佳。同时，在青贮过程中，通过降低青贮原料的ph值，抑制各种微生物活动，从而达到长期保存青饲料的目的。但苜蓿的水溶性碳水化合物含量低且缓冲能值高，在青贮过程中难于形成低ph值状态。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供了一种降低氨态氮的苜蓿青贮发酵剂及苜蓿青贮的制备方法，能够有效地降低苜蓿青贮中氨态氮的含量，并能降低苜蓿青贮的ph值，提高苜蓿青贮的饲用品质并延长保质期。为了解决上述问题，本发明提供了以下技术方案：本发明提供了一种降低氨态氮的苜蓿青贮发酵剂，包括植物乳杆菌accc11016发酵液和凝结芽孢杆菌accc10229发酵液；所述植物乳杆菌accc11016发酵液和凝结芽孢杆菌accc10229发酵液的质量比为0.9～1.1∶0.9～1.1。优选的，所述植物乳杆菌accc11016发酵液的制备方法包括：将植物乳杆菌accc11016菌液接种到液态发酵培养基中，在30～40℃，80～120rpm的条件下发酵20～28h，得到植物乳杆菌accc11016发酵液；所述液态发酵培养基以水为溶剂，包括以下浓度的组分：蛋白胨12g/l，牛肉粉12g/l，酵母粉6g/l，葡萄糖24g/l，磷酸氢二钾2g/l，柠檬酸氢二铵2g/l，乙酸钠5g/l，硫酸镁0.58g/l，硫酸锰0.25g/l和吐温5ml/l，所述液态发酵培养基的ph值为5.9。优选的，所述凝结芽孢杆菌accc10229发酵液的制备方法包括：将凝结芽孢杆菌accc10229菌液接种到液态发酵培养基中，在30～40℃，80～120rpm的条件下发酵20～28h，得到凝结芽孢杆菌accc10229发酵液；所述液态发酵培养基以水为溶剂，包括以下浓度的组分：蛋白胨12g/l，牛肉粉12g/l，酵母粉6g/l，葡萄糖24g/l，磷酸氢二钾2g/l，柠檬酸氢二铵2g/l，乙酸钠5g/l，硫酸镁0.58g/l，硫酸锰0.25g/l和吐温5ml/l，所述液态发酵培养基的ph值为5.9。优选的，所述植物乳杆菌accc11016菌液的活菌数为1.0×108～×1.0×1010cfu/g；所述凝结芽孢杆菌accc10229菌液的活菌数为1.0×108～×1.0×1010cfu/g。优选的，所述接种量独立为液态发酵培养基总重量的5％～15％。本发明提供了一种苜蓿青贮的制备方法，包括如下步骤：1)将苜蓿与上述方案所述的苜蓿青贮发酵剂混合，得到总混物；2)将所述步骤1)的总混物进行密封发酵40～50d，得到苜蓿青贮。优选的，所述步骤1)中苜蓿与苜蓿青贮发酵剂的质量体积比为1kg∶1.4～1.6ml。优选的，步骤1)中所述混合前还包括将苜蓿青贮发酵剂进行稀释；所述稀释的倍数为3～5倍。优选的，步骤1)中所述混合前还包括将苜蓿切割成2～5cm的苜蓿段。优选的，所述步骤2)中密封发酵的温度为20～30℃。本发明提供了一种苜蓿青贮发酵剂及苜蓿青贮的制备方法。所述苜蓿青贮发酵剂包括植物乳杆菌accc11016发酵液和凝结芽孢杆菌accc10229发酵液；所述植物乳杆菌accc11016发酵液和凝结芽孢杆菌accc10229发酵液的质量比为0.9～1.1∶0.9～1.1。本发明中，通过将植物乳杆菌accc11016发酵液和凝结芽孢杆菌accc10229发酵液混合做为青贮发酵的主导菌群，植物乳杆菌accc11016和凝结芽孢杆菌accc10229的快速增殖会引起青贮饲料乳酸含量提高，由于乳酸的酸性高于乙酸，ph值下降得更快，最终得到低ph值的青贮。同时，添加同型发酵乳酸菌会使氨态氮与总氮比值(nh3-n/tn)降低。实施例结果表明：植物乳杆菌accc11016与凝结芽孢杆菌accc10229搭配可以显著降低苜蓿青贮中氨态氮含量及ph值，相较于对照组1～6氨态氮降低9.04％～54.88％，ph值降低0.05～0.39。具体实施方式本发明提供了一种降低氨态氮的苜蓿青贮发酵剂，包括植物乳杆菌accc11016发酵液和凝结芽孢杆菌accc10229发酵液；所述植物乳杆菌accc11016发酵液和凝结芽孢杆菌accc10229发酵液的质量比为0.9～1.1∶0.9～1.1。在本发明中，所述植物乳杆菌accc11016发酵液和凝结芽孢杆菌accc10229发酵液的质量比优选为1∶1。在本发明中，所述植物乳杆菌accc11016发酵液的活菌数优选为1.0×108～×1.0×1010cfu/g，更优选为1.0×109cfu/g。在本发明中，所述植物乳杆菌accc11016发酵液的制备方法优选包括：将植物乳杆菌accc11016菌液接种到液态发酵培养基中，在30～40℃，80～120rpm的条件下发酵20～28h，得到植物乳杆菌accc11016发酵液；所述液态发酵培养基以水为溶剂，包括以下浓度的组分：蛋白胨12g/l，牛肉粉12g/l，酵母粉6g/l，葡萄糖24g/l，磷酸氢二钾2g/l，柠檬酸氢二铵2g/l，乙酸钠5g/l，硫酸镁0.58g/l，硫酸锰0.25g/l和吐温5ml/l，所述液态发酵培养基的ph值为5.9。本发明对所述液态发酵培养基中各组分的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。在本发明中，所述植物乳杆菌accc11016菌液的接种的量优选为液态发酵培养基总重量的5％～15％，优选为10％。在本发明中，所述植物乳杆菌accc11016菌液的活菌数优选为1.0×108～×1.0×1010cfu/g，更优选为1.0×109cfu/g。在本发明中，所述植物乳杆菌accc11016菌液的制备方法优选包括将植物乳杆菌accc11016依次进行活化和扩大培养得到。在本发明中，所述活化的方式优选为将植物乳杆菌accc11016在mrs固体斜面培养基上划线，将划线后的培养基在35℃下培养至长出菌落。在本发明中，所述活化的次数优选为2次。在本发明中，所述扩大培养的方式优选为将活化后的单菌落接种于mrs液体培养基中，在35℃，120rpm过夜，得到植物乳杆菌accc11016菌液。在本发明中，所述发酵的温度优选为30～40℃，更优选为35℃；所述发酵的转速优选为80～120rpm，更优选为100rpm；所述发酵的时间优选为20～28h，更优选为24h。在本发明中，所述植物乳杆菌accc11016购买自中国农业微生物菌种保藏管理中心。在本发明中，所述凝结芽孢杆菌accc10229发酵液的制备方法优选包括：将凝结芽孢杆菌accc10229菌液接种到液态发酵培养基中，在30～40℃，80～120rpm的条件下发酵20～28h，得到凝结芽孢杆菌accc10229发酵液；所述液态发酵培养基以水为溶剂，包括以下浓度的组分：蛋白胨12g/l，牛肉粉12g/l，酵母粉6g/l，葡萄糖24g/l，磷酸氢二钾2g/l，柠檬酸氢二铵2g/l，乙酸钠5g/l，硫酸镁0.58g/l，硫酸锰0.25g/l和吐温5ml/l，所述液态发酵培养基的ph值为5.9。本发明对所述液态发酵培养基中各组分的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。在本发明中，所述凝结芽孢杆菌accc10229菌液的接种的量优选为液态发酵培养基总重量的5％～15％，更优选为10％。在本发明中，所述凝结芽孢杆菌accc10229菌液的活菌数优选为1.0×108～×1.0×1010cfu/g，更优选为1.0×109cfu/g。在本发明中，所述凝结芽孢杆菌accc10229菌液的制备方法优选包括将凝结芽孢杆菌accc10229依次进行活化和扩大培养得到。在本发明中，所述活化的方式优选为将植物乳杆菌accc11016在mrs固体斜面培养基上划线，将划线后的培养基在35℃下培养至长出菌落。在本发明中，所述活化的次数优选为2次。在本发明中，所述扩大培养的方式优选为将活化后的单菌落接种于mrs液体培养基中，在35℃，120rpm过夜，得到凝结芽孢杆菌accc10229菌液。在本发明中，所述发酵的温度优选为30～40℃，更优选为35℃；所述发酵的转速优选为80～120rpm，更优选为100rpm；所述发酵的时间优选为20～28h，更优选为24h。在本发明中，所述凝结芽孢杆菌accc10229购买自中国农业微生物菌种保藏管理中心。在本发明中，所述植物乳杆菌accc11016发酵液和凝结芽孢杆菌accc10229发酵液添加到苜蓿中，植物乳杆菌accc11016和凝结芽孢杆菌accc10229做为青贮发酵的主导菌群，植物乳杆菌accc11016和凝结芽孢杆菌accc10229的快速增殖会引起青贮饲料乳酸含量提高，由于乳酸的酸性高于乙酸，ph值下降得更快，最终得到低ph值的青贮。同时，添加同型发酵乳酸菌会使氨态氮与总氮比值(nh3-n/tn)降低。本发明提供了一种苜蓿青贮的制备方法，包括如下步骤：1)将苜蓿与上述方案所述的苜蓿青贮发酵剂混合，得到总混物；2)将所述步骤1)的总混物进行密封发酵40～50d，得到苜蓿青贮。本发明将苜蓿与苜蓿青贮发酵剂混合，得到总混物。在本发明中，所述混合前优选将苜蓿切割成2～5cm的段，更优选为4cm。在本发明中，所述苜蓿与苜蓿青贮发酵剂的质量体积比优选为1kg∶1.4～1.6ml，更优选为1kg∶1.5ml。本发明对苜蓿的来源没有特殊限定，采用本领域常规苜蓿即可。本发明实施例中用丹农种子公司提供的北极熊品种，在天津农业资源与环境研究所的“海滨盐碱地绿化土壤改良科研试验基地”种植得到。在本发明中，所述混合前优选将苜蓿青贮发酵剂进行稀释；所述稀释的倍数优选为3～5倍，更优选为4倍。所述稀释用稀释液优选为水。在本发明中，所述混合的方式优选为将苜蓿青贮发酵剂喷洒在苜蓿上。得到总混物后，本发明优选将所述总混物进行密封发酵40～50d，得到苜蓿青贮。在本发明中，所述密封的方式优选为采用聚乙烯塑料进行密封。在密封前优选排出空气。在本发明中，所述密封发酵的温度优选为20～30℃，更优选为25℃。所述密封发酵的时间优选为45d。为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例1用已灭菌的接种环从冻存管中取出植物乳杆菌accc11016和凝结芽孢杆菌accc10229，分别于mrs固体斜面上划线，将划线后的mrs固体培养基置于35℃培养箱中培养出菌落，活化2次后挑取单菌落接于mrs液体培养基中于35℃，120rpm/min过夜，得到植物乳杆菌accc11016菌液和凝结芽孢杆菌accc10229菌液备用。将得到的植物乳杆菌accc11016菌液和凝结芽孢杆菌accc10229菌液分别调整至菌浓度为1.0×109cfu/g后，分别接种(接种量为液体培养基重量的10％)到液体培养基中(蛋白胨12g/l，牛肉粉12g/l，酵母粉6g/l，葡萄糖24g/l，磷酸氢二钾2g/l，柠檬酸氢二铵2g/l，乙酸钠5g/l，硫酸镁0.58g/l，硫酸锰0.25g/l，吐温5ml，蒸馏水定容到1l；按上述配方配制好液态培养基后，调节ph值至5.9)，在35℃，100rpm的条件下培养24h，得到植物乳杆菌accc11016发酵液和凝结芽孢杆菌accc10229发酵液。试验用苜蓿为丹农种子公司提供的北极熊品种，种植区域为天津市农业资源与环境研究所的“滨海盐碱地绿化土壤改良科研试验基地”，亩播种量1.2kg。苜蓿于第一茬初花期刈割苜蓿，晾晒24h后(干物质含量29.13±0.75％)，用铡草机将其切割成2～5cm的苜蓿段，用于制作苜蓿青贮。实施例2取实施例1得到的植物乳杆菌accc11016发酵液和凝结芽孢杆菌accc10229发酵液，按照0.9∶1.1的质量比混合，得到苜蓿青贮发酵剂。取实施例1的苜蓿段，将上述苜蓿青贮发酵剂喷洒在苜蓿段上(苜蓿与苜蓿青贮发酵剂的质量体积比优选为1kg∶1.6ml，为保证苜蓿青贮添加的均一性，先将发酵剂稀释3倍后再喷洒到苜蓿段上)，装入聚乙烯塑料袋(25cm×35cm)，每袋300g，设置3个重复，用封口机同时进行抽气和封口，在20℃下发酵50d后开袋分析苜蓿青贮成分。实施例3取实施例1得到的植物乳杆菌accc11016发酵液和凝结芽孢杆菌accc10229发酵液，按照1.1∶0.9的质量比混合，得到苜蓿青贮发酵剂。取实施例1的苜蓿段，将上述苜蓿青贮发酵剂喷洒在苜蓿段上(苜蓿与苜蓿青贮发酵剂的质量体积比优选为1kg∶1.4ml，为保证苜蓿青贮添加的均一性，先将发酵剂稀释5倍后再喷洒到苜蓿段上)，装入聚乙烯塑料袋(25cm×35cm)，每袋300g，设置3个重复，用封口机同时进行抽气和封口，在30℃下发酵40d后开袋分析苜蓿青贮成分。实施例4取实施例1得到的植物乳杆菌accc11016发酵液和凝结芽孢杆菌accc10229发酵液，按照1∶1的质量比混合，得到苜蓿青贮发酵剂。取实施例1的苜蓿段，将上述苜蓿青贮发酵剂喷洒在苜蓿段上(苜蓿与苜蓿青贮发酵剂的质量体积比优选为1kg∶1.5ml，为保证苜蓿青贮添加的均一性，先将发酵剂稀释4倍后再喷洒到苜蓿段上)，装入聚乙烯塑料袋(25cm×35cm)，每袋300g，设置3个重复，用封口机同时进行抽气和封口，在25℃下发酵45d后开袋分析苜蓿青贮成分。对比例1除不添加发酵剂外，其他操作步骤与实施例4完全相同，制备苜蓿青贮，作为对照组1。将实施例1的植物乳杆菌accc11016发酵液作为苜蓿青贮发酵剂，除发酵剂不同外，其他操作步骤与实施例4完全相同，制备苜蓿青贮，作为对照组2。采用实施例1的活化、扩大培养及发酵方法制备戊糖片球菌cicc22737(购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心)发酵液，将戊糖片球菌cicc22737发酵液和实施例1的植物乳杆菌accc11016发酵液按照1∶1的质量比混合，作为苜蓿青贮发酵剂，其他操作步骤与实施例4完全相同，制备苜蓿青贮，作为对照组3。采用实施例1的活化、扩大培养及发酵方法制备戊糖片球菌cicc22737(购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心)发酵液，将戊糖片球菌cicc22737发酵液和实施例1的植物乳杆菌accc11016发酵液、凝结芽孢杆菌accc10229发酵液按照1∶1∶1的质量比混合，作为苜蓿青贮发酵剂，其他操作步骤与实施例4完全相同，制备苜蓿青贮，作为对照组4。采用实施例1的活化、扩大培养及发酵方法制备植物乳杆菌cicc20765(购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心)发酵液，将植物乳杆菌cicc20765发酵液和实施例1的凝结芽孢杆菌accc10229发酵液按照1∶1的质量比混合，作为苜蓿青贮发酵剂，其他操作步骤与实施例4完全相同，制备苜蓿青贮，作为对照组5。采用实施例1的活化、扩大培养及发酵方法制备植物乳杆菌cicc20765(购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心)发酵液和乳酸片球菌cgmcc1.4(购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心)发酵液，将植物乳杆菌cicc20765发酵液、乳酸片球菌cgmcc1.4发酵液和实施例1的凝结芽孢杆菌accc10229发酵液按照1∶1∶1的质量比混合，作为苜蓿青贮发酵剂，其他操作步骤与实施例4完全相同，制备苜蓿青贮，作为对照组6。实施例5对实施例4及对比例1中对照组1～6制备得到的苜蓿青贮进行分析。样品由cvas饲料分析中国服务中心通过近红外光谱(nearinfrared，nir)进行营养价值评估，测定氨态氮和ph。具体测定结果如表1所示。表1不同发酵剂对苜蓿青贮中氨态氮、ph的影响氨态氮(cp％)ph实施例45.7±1.322884.8967±0.10017对照组112.6333±1.101515.2867±0.15948对照组26.2667±1.436434.9433±0.04041对照组38.9333±1.778585.11±0.18682对照组48.9667±1.234235.09±0.16523对照组58.1333±0.665834.9833±0.05033对照组69.7333±1.401195.14±0.14由表1可以看出，植物乳杆菌accc11016与凝结芽孢杆菌accc10229搭配可以显著降低苜蓿青贮中氨态氮含量及ph值，相较于对照组1～6氨态氮降低9.04％～54.88％，ph值降低0.05～0.39。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12