一种辣椒脉斑驳病毒检疫鉴定方法与流程

本发明涉及免疫鉴定技术领域，尤其涉及一种辣椒脉斑驳病毒检疫鉴定方法。

背景技术：

辣椒脉斑驳病毒(chilliveinalmottlevirus，chivmv)属马铃薯y病毒科(potyviridae)马铃薯y病毒属(potyvirus)成员，由蚜虫非持久方式传播，可以通过病株汁液和机械摩擦等方式传播。该病毒主要在非洲国家报道侵染辣椒引起严重病害，随后阿富汗、印度、韩国、我国台湾等多个亚洲国家和地区也陆续报道了该病毒的发生。2005年，在我国北京检测到该病毒，其后在湖南、陕西、海南、广西和广东等多个省份也发现辣椒脉斑驳病毒。田间病株症状主要表现为叶脉扭曲，脉间褪绿成绿脉带和叶片普遍出现斑驳，严重时叶片变小、畸形、提早脱落，病果褪绿花斑、畸形等，严重影响到辣椒的产量和品质。

自报道黄瓜花叶病毒（cucumbermosaicvirus，cmv）侵染辣椒以来，至今已报道至少有45种的病毒能侵染辣椒。马铃薯y病毒属病毒（potyvirus）则是侵染辣椒作物的主要病毒，近年来已逐渐成为辣椒头号病害之一，严重危害辣椒产业发展。该属有近200个确定种或暂定种，已知能侵染辣椒的病毒主要有辣椒脉斑驳病毒(chilliveinalmottlevirus，chivmv)、辣椒环斑病毒(chilliringspotvirus，chirsv)、马铃薯y病毒(potatovirusy,pvy)、烟草蚀纹病毒(tobaccoetchvirus，tev)、辣椒斑驳病毒(peppermottlevirus，pepmov)和干辣椒脉斑驳病毒(pepperveinalmottlevirus，pvmv)等6种。而现有的植物病毒检测方法主要有pcr/rt-pcr、elisa、电镜观察、基因芯片等技术。但是，单一使用这些检测方法，往往灵敏性、特异性、重复性、重现性不够好，容易出现假阳性的情况，且辣椒脉斑驳病毒没有使用elisa检测的方法，因而有必要加以继续改进。

技术实现要素：

本发明的目的在于，针对现有技术的上述不足，提出一种具有良好的特异性、灵敏性、重复性、重现性、不易出现假阳性的辣椒脉斑驳病毒检疫鉴定方法。

本发明解决其技术问题，采用的技术方案是，提出一种辣椒脉斑驳病毒检疫鉴定方法，其包括如下步骤：

（a）、按照sn/t2122给出的方法进行抽样、取样得到样品；

（b）、对样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定和rt-pcr检测；

（c）、样品检测时，结果判定按照如下原则进行：通过双抗体夹心酶联免疫吸附测定进行初筛，若检测结果为阴性，且rt-pcr检测结果为阴性，则判定样品不携带辣椒脉斑驳病毒；通过双抗体夹心酶联免疫吸附测定进行初筛，若检测结果为阳性，且rt-pcr检测结果为阳性，则判定样品携带辣椒脉斑驳病毒。

作为优选，所述双抗体夹心酶联免疫吸附测定包括如下步骤：

待测样品：称取0.5g-1.0g样品组织待测样品按1：10加入抽提缓冲液，用研钵研

磨成浆，4℃下10000g离心10min，取上清液即为检测样品；

阳性对照样品：辣椒脉斑驳病毒的纯病毒或者组织抽提液，由市场提供，用抽提缓冲液制备；

阴性对照样品：由市场提供，用抽提缓冲液制备；

空白对照：用抽提缓冲液作空白对照；

b）、用包被缓冲液将抗体按说明稀释，加入酶联板的孔中，100μl/孔，加盖，37℃孵育2h或4℃冰箱孵育过夜，倒去酶联板孔中溶液，按每孔200μl的量用pbst洗涤4～6次，每次1min；

c）、将制备好的检测样品、阴性对照样品、阳性对照样品、空白对照分别加入到酶联板中，并且至少一个重复，100μl/孔，加盖，37℃孵育2h或4℃冰箱孵育过夜，倒去酶联板孔中溶液，按每孔200μl的量用pbst洗涤4～6次，每次1min；

d）、用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度，并加入酶联板中，100μl/孔，加盖，37℃孵育2h，倒去酶联板孔中溶液，pbst洗涤4～6次；

e）、将底物pnpp加入到底物缓冲液中使终浓度为1mg/ml，按100μl/孔，加入到酶联板中，室温避光孵育；

f）、将酶联板置于酶联仪中，在405nm处读od值；

g）、结果判定：在满足阴性对照孔的od405值<0.15、阳性对照孔的od405值/阴性对照孔的od405值>5~10，孔的重复性基本一致的质量要求后，样品od405值/阴性对照od405值明显>2，判为阳性；样品od405值/阴性对照od405值在阈值附近，判为可疑样品，需重新做一次，或用其他方法加以验证；样品od405值/阴性对照od405值明显<2，判为阴性。作为优选，所述包被抗体通过包被缓冲液将辣椒脉斑驳病毒抗体稀释到需要的浓度制得。

作为优选，所述酶标抗体稀释缓冲液的制备方法是将2.0g牛血清白蛋白和20.0g聚乙烯基吡咯烷酮溶于900ml1×pbst中，并用1×pbst定容至1000ml，4℃储存。

作为优选，所述rt-pcr检测包括如下步骤：

a）、根据已报道的chivmv基因组序列设计2对用于特异性扩增的引物chivmv-cp1/chivmv-cp2、chivmv-ci3/chivmv-ci4，两对引物的碱基序列分别如下：

chivmv-cp1：acaccttcttgattatgctcc

chivmv-cp2：ataaggcttctcagaattgcg

chivmv-ci3：ggagccacagaaatcaagaca

chivmv-ci4：tgccacaacttttcatacaac；

其中，chivmv-cp1/chivmv-cp2引物对的目的条带大小为337bp，chivmv-ci3/chivmv-ci4引物对的目的条带大小为662bp；

b）、总rna提取：取样品提取液200μl放入1.5ml离心管中，再加入1mltrizol试

剂，剧烈震荡摇匀3min，在4℃下12000g离心10min，取上清液；往上清液中加入氯仿300μl，剧烈震荡15s，室温静置5min，4℃下12000g离心15min，取上层水相；往上层水相中加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后室温下静置15min，4℃下12000g离心10min；弃上清，沉淀用1ml75%的乙醇洗涤2次，每次4℃下7500g离心3min，弃上清；得到rna沉淀并干燥，用20μl～40μl经depc处理过的ddh2o溶解，-20℃保存备用；

c）、cdna合成：在pcr管中加入3μl总rna，10μmol/l的随机引物1μl，ddh2o

7μl，70℃水浴10min，迅速冰浴5min，再加入下列试剂：5×rt缓冲液5μl、10mmol/l的dntps2μl、200u/μl的m-mlvrt1μl、40u/μl的rnasin1μl，在42℃水浴60min，70℃水浴10min，自然冷却至室温，-20℃保存备用；

d）、pcr扩增：检测时以含有病毒目标片段的质粒或含病毒材料作为阳性对照，以不含

病毒的健康植物组织作阴性对照，同时以水代替模板作为空白对照；pcr反应体系为cdna2.0μl、10μmol/l的chivmv-cp11.25μl、10μmol/l的chivmv-cp21.25μl、10μmol/l的chivmv-ci30.75μl、10μmol/l的chivmv-ci40.75μl，2×taqpcrmix12.5μl、ddh2o6.5μl，每个反应设置2个重复，pcr反应条件：94℃预变性3min,然后94℃变性30s、53℃退火45s、72℃延伸1min，35个循环，最后一个循环结束后72℃继续延伸10min；

e）、琼脂糖凝胶电泳：制备1.5%的琼脂糖凝胶，对pcr产物进行电泳，电压3-5v/cm，

缓冲液0.5×tbe。电泳结束后，在0.5g/ml溴化乙锭溶液染色10min后，再在凝胶成像系统中观察是否扩增出预期的特异性dna电泳带，拍照并做记录；

f）、结果判定：如果阴性对照和空白对照无特异性扩增、阳性对照同时扩增出大小约337bp和662bp的目的条带，待测样品扩增出与阳性对照一致的任一目的条带（337bp或662bp）或同时扩增出与阳性对照一致的两个目的条带（337bp和662bp），则判定为阳性；如果阴性对照和空白对照无特异性扩增、阳性对照同时扩增出大小约337bp和662bp的目的条带，待测样品未扩增出与阳性对照一致的任一目的条带（337bp或662bp），则判定为阴性。

通过实施上述技术方案，本发明具有如下的优点：通过双抗体夹心酶联免疫吸附测定和rt-pcr检测，其中rt-pcr检测检测时，设计两对特异性引物进行pcr扩增观察是否扩增出预期的目的条带，检测结果具有良好的特异性、灵敏性、重复性、重现性、不易出现假阳性。

附图说明

图1为本发明特异性检测结果示意图；

图2为本发明灵敏性检测结果示意图。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。

一种辣椒脉斑驳病毒检疫鉴定方法，其包括：包括如下步骤：

（a）、按照sn/t2122给出的方法进行抽样、取样得到样品；

（b）、对样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定和rt-pcr检测。

1、双抗体夹心酶联免疫吸附测定的步骤：

a）、待测样品：称取0.5g-1.0g样品组织待测样品按1：10（重量：体积，w/v）加入抽提缓冲液，用研钵研磨成浆，4℃下10000g离心10min，取上清液即为检测样品；

阳性对照样品：辣椒脉斑驳病毒的纯病毒或者组织抽提液，由市场提供，用抽提缓冲液制备；

阴性对照样品：未感染辣椒脉斑驳病毒的辣椒叶片，由市场提供，用抽提缓冲液制备；

空白对照：用抽提缓冲液作空白对照；

b）、用包被缓冲液将抗体按说明稀释，加入酶联板的孔中，100μl/孔，加盖，37℃孵育2h或4℃冰箱孵育过夜，倒去酶联板孔中溶液，按每孔200μl的量用pbst洗涤4～6次，每次1min；

c）、将制备好的检测样品、阴性对照样品、阳性对照样品、空白对照分别加入到酶联板中，并且至少一个重复，100μl/孔，加盖，37℃孵育2h或4℃冰箱孵育过夜，倒去酶联板孔中溶液，按每孔200μl的量用pbst洗涤4～6次，每次1min；

d）、用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度，并加入酶联板中，100μl/孔，加盖，37℃孵育2h，倒去酶联板孔中溶液，pbst洗涤4～6次；

e）、将底物pnpp加入到底物缓冲液中使终浓度为1mg/ml，按100μl/孔，加入到酶联板中，室温避光孵育；

f）、将酶联板置于酶联仪中，在405nm处读od值；

g）、结果判定：在满足阴性对照孔的od405值<0.15、阳性对照孔的od405值/阴性对照孔的od405值>5~10，孔的重复性基本一致的质量要求后，样品od405值/阴性对照od405值明显>2，判为阳性；样品od405值/阴性对照od405值在阈值附近，判为可疑样品，需重新做一次，或用其他方法加以验证；样品od405值/阴性对照od405值明显<2，判为阴性。

其中，1×pbst缓冲液（ph7.4）的制备方法是将8.0g氯化钠、0.2g磷酸二氢钾、1.15g磷酸氢二钠、0.2g氯化钾和0.5ml吐温-20溶于900ml灭菌双蒸水中，并定容至1000ml，4℃储存。

抽提缓冲液(ph7.4)的制备方法是将1.3g亚硫酸钠和20.0g聚乙烯基吡咯烷酮溶于900ml的1×pbst中，并用1×pbst定容至1000ml，4℃储存。

酶标抗体稀释缓冲液的制备方法是将2.0g牛血清白蛋白和20.0g聚乙烯基吡咯烷酮溶于900ml1×pbst中，并用1×pbst定容至1000ml，4℃储存。

底物缓冲液(ph9.8)的制备方法是将97ml二乙醇胺和0.1g氯化镁溶于800ml灭菌双蒸水中，用浓盐酸调ph至9.8，定容至1000ml，4℃储存。

通过上述方法，按照sn/t2122给出的方法进行抽样、取样，得到10份不同辣椒的叶片作为样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定，结果如下表1：

2、rt-pcr检测的步骤

a）、根据已报道的chivmv基因组序列（cp和ci基因）设计2对用于特异性扩增的引物chivmv-cp1/chivmv-cp2、chivmv-ci3/chivmv-ci4，两对引物的碱基序列分别如下：

chivmv-cp1：acaccttcttgattatgctcc

chivmv-cp2：ataaggcttctcagaattgcg

chivmv-ci3：ggagccacagaaatcaagaca

chivmv-ci4：tgccacaacttttcatacaac。

其中，chivmv-cp1/chivmv-cp2引物对的目的条带大小为337bp，chivmv-ci3/chivmv-ci4引物对的目的条带大小为662bp。

b）、总rna提取：取样品提取液200μl放入1.5ml离心管中，再加入1mltrizol试剂，剧烈震荡摇匀3min，在4℃下12000g离心10min，取上清液；往上清液中加入氯仿300μl，剧烈震荡15s，室温静置5min，4℃下12000g离心15min，取上层水相；往上层水相中加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后室温下静置15min，4℃下12000g离心10min；弃上清，沉淀用1ml75%的乙醇洗涤2次，每次4℃下7500g离心3min，弃上清；得到rna沉淀并干燥，用20μl～40μl经depc处理过的ddh2o溶解，-20℃保存备用；

c）、cdna合成：在pcr管中加入3μl总rna，10μmol/l的随机引物1μl，ddh2o7μl，70℃水浴10min，迅速冰浴5min，再加入下列试剂：5×rt缓冲液5μl、10mmol/l的dntps2μl、200u/μl的m-mlvrt1μl、40u/μl的rnasin1μl，在42℃水浴60min，70℃水浴10min，自然冷却至室温，-20℃保存备用；

d）、pcr扩增：检测时以含有病毒目标片段的质粒或含病毒材料作为阳性对照，以不含病毒的健康植物组织作阴性对照，同时以水代替模板作为空白对照；pcr反应体系为cdna2.0μl、10μmol/l的chivmv-cp11.25μl、10μmol/l的chivmv-cp21.25μl、10μmol/l的chivmv-ci30.75μl、10μmol/l的chivmv-ci40.75μl，2×taqpcrmix12.5μl、ddh2o6.5μl，pcr反应条件：94℃预变性3min,然后94℃变性30s、53℃退火45s、72℃延伸1min，35个循环，最后一个循环结束后72℃继续延伸10min；

e）、琼脂糖凝胶电泳：制备1.5%的琼脂糖凝胶，对pcr产物进行电泳，电压3-5v/cm，缓冲液0.5×tbe。电泳结束后，在0.5g/ml溴化乙锭溶液染色10min后，再在凝胶成像系统中观察是否扩增出预期的特异性dna电泳带，拍照并做记录；

f）、结果判定：如果阴性对照和空白对照无特异性扩增、阳性对照同时扩增出大小约337bp和662bp的目的条带，待测样品扩增出与阳性对照一致的任一目的条带（337bp或662bp）或同时扩增出与阳性对照一致的两个目的条带（337bp和662bp），则判定为阳性；如果阴性对照和空白对照无特异性扩增、阳性对照同时扩增出大小约337bp和662bp的目的条带，待测样品未扩增出与阳性对照一致的任一目的条带（337bp或662bp），则判定为阴性。

其中，0.5×tbe缓冲液的制备方法是将54.0gtris碱、27.5g硼酸和20ml0.5mol/ledta（ph8.0）混合并补充蒸馏水至1l，用时加蒸馏水稀释至0.5×tbe。

对1中的10份辣椒的叶片作为样品进行rt-pcr检测，检测结果如下表2：

（c）、上述双抗体夹心酶联免疫吸附测定和rt-pcr检测方法的结果判定原则为：

1）、双抗体夹心酶联免疫吸附测定初步筛检，若检测结果为阴性，且rt-pcr检测结果为阴性，则判定样品不携带chivmv。

2）、双抗体夹心酶联免疫吸附测定初步筛检，若检测结果为阳性，且rt-pcr检测结果为阳性，则判定样品携带chivmv。

通过上述测试，上述10份样品是否携带chivmv如下表3所示：

（d）、记录好各项实验数据，包括样品来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。血清学检测结果保留吸光值的数据报告，分子生物学检测结果保留电泳照片。

（e）、经检测结果判定为阳性的样品应妥善保存在-20℃～-80℃超低温冰箱中，并作好登记和标记工作，以备复核用。

另外，进行rt-pcr检测的特异性试验和灵敏性试验

（1）、材料：cdna（chivmv、a-e分别为黄瓜花叶病毒（cmw）、烟草花叶病毒（tmv）、马铃薯y病毒（pvy）、辣椒轻斑驳病毒（pmmov）），引物chivmv-cp1/chivmv-cp2（chivmv-cp1：acaccttcttgattatgctcc、chivmv-cp2：ataaggcttctcagaattgcg）

（2）、方法

1）、pcr反应体系见表4，pcr反应条件：94℃预变性3min,然后94℃变性30s、53℃退火45s、72℃延伸1min，35个循环，最后一个循环结束后72℃继续延伸10min。

表4

2）、琼脂糖凝胶电泳：制备1.5%的琼脂糖凝胶，对pcr产物进行电泳，电压3-5v/cm，缓冲液0.5×tbe。电泳结束后，在0.5g/ml溴化乙锭溶液染色10min后，再在凝胶成像系统中观察是否扩增出预期的特异性dna电泳带，拍照并做记录。

3）、结果判定

若样品pcr扩增出大小约337bp目的片段，则判定检测结果为阳性。

（3）特异性试验

以chivmv、a-e的cdna为模板，按照上述（2）进行操作。

如图1所示，特异性检测结果表明，该方法不能从黄瓜花叶病毒（cmw）、烟草花叶病毒（tmv）、马铃薯y病毒（pvy）、辣椒轻斑驳病毒（pmmov）中扩增到预期条带，能从chivmv中扩增出预期的337bp条带，显示出良好的特异性。

4）、灵敏度试验

取cdna原液进行10倍梯度稀释为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7，分别以原液、各稀释液为模板按照（2）的方法进行操作。

如图2所示，利用该方法对系列稀释的chivmv的cdna进行检测，结果表明该方法可以明显检测到稀释10^-2的cdna模板，具有良好的灵敏度。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

序列表

<110>福清出入境检验检疫局综合技术服务中心

<120>一种辣椒脉斑驳病毒检疫鉴定方法

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<222>(1)..(21)

<223>chivmv-cp1

<400>1

acaccttcttgattatgctcc21

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

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<222>(1)..(21)

<223>chivmv-cp2

<400>2

ataaggcttctcagaattgcg21

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<222>(1)..(21)

<223>chivmv-ci3

<400>3

ggagccacagaaatcaagaca21

<210>4

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<222>(1)..(21)

<223>chivmv-ci4

<400>4

tgccacaacttttcatacaac21