本发明涉及核桃青皮多糖提取领域，具体涉及一种高纯度核桃青皮多糖的提取方法。
背景技术：
核桃也称胡桃，是深受人们喜爱的干果，原产地是伊朗，国内自汉朝时开始种植，在安徽、辽宁、河北、山东等地广泛种植，在浙江省的杭州临安也有大量的山核桃种植。而核桃青皮是核桃果实未成熟时期的外果皮，颜色呈深绿色，含有胡桃醌、氢化胡桃醌、脂肪酸、多酚物质、黄酮类化合物以及多糖等多种活性成分。干燥后的核桃青皮也称青龙衣，是常用的中药药材，经研究具有清热解毒、止痢明目、抗肿瘤的功效。现有对核桃青皮的利用研究主要集中在胡桃醌、氢化胡桃醌等的提取利用，且提取利用技术尚未成熟，而对青皮多糖等活性成分的关注等则更少。少量研究人员通过水提或超声提取等方法从核桃青皮中提取核桃青皮多糖，但是得到的多糖的提取效率低，而且纯度不佳，影响了核桃青皮多糖的利用，也使核桃青皮未能充分利用。而近年来随着核桃的大量推广种植，青皮的产生量也逐年增加，由于开发利用手段不充分，大量的核桃青皮堆弃在田间变成废弃物，不仅造成环境污染，也带来资源浪费。因此如何提取青皮多糖从而多方面充分利用核桃青皮，提高核桃青皮的利用效果，是未来核桃青皮资源利用开发的研究方向之一。
高俊仙(不同提取方法对核桃青皮多糖提取效果的影响，内蒙古林业，2018，第11期30～32)中比较了利用水提法、超声辅助提取法、微波辅助提取法、超声微波双辅助提取法等不同方法从核桃青皮中提取多糖的效果，并且认为超声微波双辅助提取法效率最高。但是上述研究所筛选的超声微波双辅助提取法的能耗大，且受限于微波使用，不适宜中试规模以上的推广，更重要的是仅关注多糖的提取率，对提高多糖纯度帮助不大。
技术实现要素：
针对现有核桃青皮多糖的提取方法所得青皮多糖的纯度不高的问题，本发明的目的在于提供一种高纯度核桃青皮多糖的提取方法，有效提升得到的核桃青皮多糖的纯度。
本发明提供如下的技术方案：
一种高纯度核桃青皮多糖的提取方法，包括以下步骤：
(1)将核桃青皮洗净后晒干、研磨成青皮粉末；
(2)将青皮粉末与酶溶液充分混合均匀、酶解，得到酶解溶液，灭酶活性；
(3)浓缩酶解溶液，直接加入二氯甲烷溶剂，并超声振荡辅助提取，离心分离粉末渣，然后静置离心清液，待分层后保留二氯甲烷提取层；
(4)向二氯甲烷提取层中加入浓度为0.6～3wt％的氢氧化钠溶液，氢氧化钠溶液与二氯甲烷的体积比3～5:1，充分振荡5～15min后静置分层，保留二氯甲烷层，如此操作2～4次，每次加入的氢氧化钠溶液的浓度逐渐增加，体积比逐渐减小；
(5)混合(4)中所得二氯甲烷层，然后常压下加热蒸发二氯甲烷，得到二氯甲烷挥发液和固体结晶，二氯甲烷挥发液加入(3)中再次使用；
(6)向固体结晶中加纯水，加热并充分溶解得到溶解液，经超滤膜超滤并截留分子量4000～15万的化合物分子，然后加入乙醇搅拌醇沉，收集得到的沉淀固体、通风干燥，得到高纯度核桃青皮多糖。
本发明的提取方法中，将粉碎后的青皮粉末经酶酶解，破坏青皮细胞的细胞壁结构，使青皮粉末细胞内物质充分释放出来，然后加入二氯甲烷在超声辅助下提取，二氯甲烷属于极性溶剂，且无毒，能够将多糖从酶解溶液中提取出来，当然也会同时将胡桃醌、氢化胡桃醌、多酚、黄酮类化合物等提取出来。由于上述杂质中含有酚羟基结构，因此在氢氧化钠中的溶解性好；且本申请所用二氯甲烷提取剂的极性比乙醇低，所以相对氢氧化钠溶液溶解上述杂质的选择性低，因此通过氢氧化钠溶液萃取上述杂质。先采用低浓度的氢氧化钠提取大部分的杂质，然后逐渐提高浓度萃取残留杂质，其中多酚稳定性受影响，多酚水解并被氧化从而被萃取，这样即提升对杂质的深度萃取，而且避免了高浓度、过量碱液的使用对多糖性能的影响。这样通过氢氧化钠溶液萃取后脱除了大部分的杂质，且得到的碱液层可作为提取胡桃醌等的原料液。由于本申请所用二氯甲烷溶剂的常压沸点低，仅为39.8℃，挥发性高，因此容易通过蒸发结晶的方式分离二氯甲烷和多糖晶体，二氯甲烷可以再次使用，所得多糖晶体的多糖纯度为75～77％，然后将得到的多糖晶体溶解后经超滤膜超滤，进一步脱除残留的杂质，然后再经乙醇醇沉分离多糖，这样经过三层深度脱杂质，所得多糖的纯度高，并且避免了活性炭等吸附剂的使用，多糖的提取率也有所增加。
作为本发明方法的优选，步骤(2)中加入的酶为木瓜蛋白酶或纤维素酶，酶溶液浓度为8～12wt％，青皮粉末与酶溶液的料液比为1g:14～20ml，酶解温度35～60℃，酶解时间3～7h。
作为本发明方法的优选，步骤(3)中二氯甲烷与浓缩酶解溶液体积比3～5:1，超声振荡功率150～200w，温度30～60℃，时间1～2h。
作为本发明方法的优选，步骤(3)还包括向粉末渣中再加入二氯甲烷超声辅助浸提萃取，这样操作1～3次，粉末渣与二氯甲烷的料液比为1g:5～8ml，然后将分离得到的二氯甲烷萃取层与二氯甲烷提取层混合得到总的二氯甲烷提取层。这样通过二氯甲烷多次提取，尽可能的将粉末渣中的多糖等提取出来，提高多糖的提取率。
作为本发明方法的优选，步骤(4)中向二氯甲烷提取层中重复加入氢氧化钠溶液并分层分离3次，氢氧化钠溶液浓度依次为0.6～0.8wt％、1.2～1.3wt％、2.0～2.4wt％，与二氯甲烷提取层体积比为3～5:1、3～5:1、1～2:1。首先通过低浓度的氢氧化钠溶液尽可能的大量萃取胡桃醌等物质，然后提高氢氧化钠的浓度，并减少氢氧化钠的体积，深度提取残留物质，与直接使用大量的氢氧化钠溶液相比，对多糖的影响小，而且节约了氢氧化钠的使用。
作为本发明方法的优选，步骤(6)中乙醇在溶解液中的体积浓度为60％～62v/v％，醇沉温度为1～5℃。通过乙醇醇沉分离青皮多糖，同时进一步提升青皮多糖的纯度。
作为本发明方法的优选，步骤(6)还包括超滤前超声处理，超声功率为200～250w，超声时间10～15min，处理后静置10～20min。醇沉前经超声处理，使核桃青皮多糖溶解液的粘度降低，这样核桃青皮多糖在超滤和醇沉时会尽可能的避免截留或夹带残留的胡桃醌、多酚等物质，有助于核桃青皮多糖纯度的提高，而处理后静置一段时间有助于核桃青皮多糖溶解液粘度趋于稳定。
本发明的有益效果如下：
本发明的核桃青皮提取方法利用二氯甲烷多次提取核桃青皮多糖，然后依次通过氢氧化钠萃取、超滤膜超滤和乙醇醇沉得到高纯度的核桃青皮多糖，而且核桃青皮多糖的提取效率高。并且所得氢氧化钠萃取液可以作为胡桃醌等的提取原料液，二氯甲烷蒸发后可以重复使用，因此废液排放少，提取过程更加清洁环保。
具体实施方式
下面就本发明的具体实施方式作进一步说明。
如无特别说明，本发明中所采用的原料均可从市场上购得或是本领域常用的，如无特别说明，下述实施例中的方法均为本领域的常规方法。
实施例1
一种高纯度核桃青皮多糖的提取方法，包括以下步骤：
(1)将核桃青皮洗净后晒干、研磨成青皮粉末；
(2)将青皮粉末与木瓜蛋白酶或纤维素酶溶液充分混合均匀，酶溶液浓度为10wt％，青皮粉末与酶溶液的料液比为1g:20ml，在60℃充分酶解3h，得到酶解溶液，
(3)浓缩酶解溶液，直接加入二氯甲烷溶剂，二氯甲烷与浓缩酶解溶液体积比5:1，采用200w的超声振荡辅助提取1h，温度50℃，离心分离粉末渣，然后静置离心清液，待分层后保留二氯甲烷提取层；
(4)向二氯甲烷提取层中加入氢氧化钠溶液，充分振荡10min后静置分层，保留二氯甲烷层，并收集碱液层，这样操作4次，氢氧化钠溶液浓度依次为0.6wt％、0.8wt％、1.4wt％、2.7wt％，氢氧化钠溶液与二氯甲烷的体积比5:1、4:1、3:1、2:1；
(5)混合(4)中所得二氯甲烷层，然后常压下加热蒸发二氯甲烷，得到二氯甲烷挥发液和固体结晶，二氯甲烷挥发液加入(3)中再次使用；
(6)向固体结晶中加入纯水，加热并充分溶解得到溶解液，经超滤膜超滤，截留分子量为4000～15万的化合物分子，然后加入乙醇搅拌并1℃醇沉、过夜，乙醇在溶解液中的体积浓度为62v/v％，收集得到的沉淀固体、通风干燥，得到精制的高纯度核桃青皮多糖。
实施例2
一种高纯度核桃青皮多糖的提取方法，包括以下步骤：
(1)将核桃青皮洗净后晒干、研磨成青皮粉末；
(2)将青皮粉末与木瓜蛋白酶或纤维素酶溶液充分混合均匀，酶溶液浓度为8wt％，青皮粉末与酶溶液的料液比为1g:14ml，在50℃充分酶解4h，得到酶解溶液，
(3)浓缩酶解溶液，直接加入二氯甲烷溶剂，二氯甲烷与浓缩酶解溶液体积比3:1，采用150w的超声振荡辅助提取2h，温度30℃，离心分离粉末渣，然后静置离心清液，待分层后保留二氯甲烷提取层；
(4)向二氯甲烷提取层中加氢氧化钠溶液，充分振荡15min后静置分层，保留二氯甲烷层，并收集碱液层，这样操作3次，氢氧化钠溶液浓度依次为0.7wt％、1.5wt％、2.2wt％，氢氧化钠溶液与二氯甲烷的体积比5:1、3:1、2:1；
(5)混合(4)中所得二氯甲烷层，然后常压下加热蒸发二氯甲烷，得到二氯甲烷挥发液和固体结晶，二氯甲烷挥发液加入(3)中再次使用；
(6)向固体结晶中加入纯水，加热并充分溶解得到溶解液，经超滤膜超滤，截留分子量为4000～15万的化合物分子，然后加入乙醇搅拌并5℃醇沉、过夜，乙醇在溶解液中的体积浓度为60％v/v％，收集得到的沉淀固体、通风干燥，得到精制的高纯度核桃青皮多糖。
实施例3
一种高纯度核桃青皮多糖的提取方法，包括以下步骤：
(1)将核桃青皮洗净后晒干、研磨成青皮粉末；
(2)将青皮粉末与木瓜蛋白酶或纤维素酶溶液充分混合均匀，酶溶液浓度为12wt％，青皮粉末与酶溶液的料液比为1g:18ml，在35℃充分酶解7h，得到酶解溶液，
(3)浓缩酶解溶液，直接加入二氯甲烷溶剂，二氯甲烷与浓缩酶解溶液体积比4:1，采用180w的超声振荡辅助提取2h，温度60℃，离心分离粉末渣，然后静置离心清液，待分层后保留二氯甲烷提取层；
(4)向二氯甲烷提取层中加入氢氧化钠溶液，充分振荡5min后静置分层，保留二氯甲烷层，并收集碱液层，这样操作2次，氢氧化钠溶液浓度依次为0.7wt％、3wt％，氢氧化钠溶液与二氯甲烷的体积比5:1、1:1；
(5)混合(4)中所得二氯甲烷层，然后常压下加热蒸发二氯甲烷，得到二氯甲烷挥发液和固体结晶，二氯甲烷挥发液加入(3)中再次使用；
(6)向固体结晶中加入纯水，加热并充分溶解得到溶解液，经超滤膜超滤，截留分子量为4000～15万的化合物分子，然后加入乙醇搅拌并3℃醇沉、过夜，乙醇在溶解液中的体积浓度为62v/v％，收集得到的沉淀固体、通风干燥，得到精制的高纯度核桃青皮多糖。
实施例4
一种高纯度核桃青皮多糖的提取方法，与实施例1的不同之处在于，步骤(4)中向二氯甲烷提取层中加入氢氧化钠溶液分层、分离操作3次，氢氧化钠溶液浓度依次为0.8wt％、1.3wt％、2.2wt％，与二氯甲烷提取层体积比为3:1、2:1、1:1。
实施例5
一种高纯度核桃青皮多糖的提取方法，与实施例1的不同之处在于，步骤(4)中向二氯甲烷提取层中加入氢氧化钠溶液分层、分离操作3次，氢氧化钠溶液浓度依次为0.6wt％、1.2wt％、2.4wt％，与二氯甲烷提取层体积比为4:1、2:1、1:1。
实施例6
一种高纯度核桃青皮多糖的提取方法，与实施例1的不同之处在于，步骤(4)中向二氯甲烷提取层中加入氢氧化钠溶液分层、分离操作3次，氢氧化钠溶液浓度依次为0.6wt％、1.1wt％、2.0wt％，与二氯甲烷提取层体积比为5:1、3:1、2:1。
实施例7
一种高纯度核桃青皮多糖的提取方法，与实施例1的不同之处在于，步骤(3)还包括向粉末渣中再次加入二氯甲烷超声辅助浸提萃取，这样操作2次，粉末渣与二氯甲烷料液比1g:7ml，然后将分离得到的二氯甲烷萃取层与二氯甲烷提取层混合得到总的二氯甲烷提取层，然后蒸发总的二氯甲烷提取层。
实施例8
一种高纯度核桃青皮多糖的提取方法，与实施例1的不同之处在于，步骤(3)还包括向粉末渣中再次加入二氯甲烷超声辅助浸提萃取，这样操作3次，粉末渣与二氯甲烷料液比1g:5ml，然后将分离得到的二氯甲烷萃取层与二氯甲烷提取层混合得到总的二氯甲烷提取层，然后蒸发总的二氯甲烷提取层。
实施例9
一种高纯度核桃青皮多糖的提取方法，与实施例1的不同之处在于，步骤(3)还包括向粉末渣中再次加入二氯甲烷超声辅助浸提萃取，这样操作1次，粉末渣与二氯甲烷料液比1g:8ml，然后将分离得到的二氯甲烷萃取层与二氯甲烷提取层混合得到总的二氯甲烷提取层，然后蒸发总的二氯甲烷提取层。
实施例10
一种高纯度核桃青皮多糖的提取方法，与实施例1的不同之处在于，步骤(6)还包括超滤前进行超声处理，超声功率为230w，超声时间12min，然后醇沉。
实施例11
一种高纯度核桃青皮多糖的提取方法，与实施例1的不同之处在于，步骤(6)还包括超滤前进行超声处理，超声功率为2000w，超声时间10min，超声后静置10min，然后醇沉。
实施例12
一种高纯度核桃青皮多糖的提取方法，与实施例1的不同之处在于，步骤(6)还包括超滤前进行超声处理，超声功率为250w，超声时间15min，超声后静置20min，然后醇沉。
实施例13
一种高纯度核桃青皮多糖的提取方法，与实施例1的不同之处在于：
步骤(3)还包括向粉末渣中再次加入二氯甲烷超声辅助浸提萃取，这样操作2次，粉末渣与二氯甲烷料液比1g:7ml，然后将分离得到的二氯甲烷萃取层与二氯甲烷提取层混合得到总的二氯甲烷提取层，然后蒸发总的二氯甲烷提取层；
步骤(4)中向二氯甲烷提取层中加入氢氧化钠溶液分层、分离操作3次，氢氧化钠溶液浓度依次为0.8wt％、1.3wt％、2.2wt％，与二氯甲烷提取层体积比为3:1、2:1、1:1。
一种高纯度核桃青皮多糖的提取方法，与实施例1的不同之处在于，步骤(6)还包括超滤前进行超声处理，超声功率为230w，超声时间12min，然后醇沉。
对比例
按实施例1的步骤(1)到步骤(3)操作得到二氯甲烷提取层，然后按照步骤(5)和步骤(6)的操作获得对比例核桃青皮多糖。
高纯度核桃青皮多糖的检测
采用蒽酮-硫酸法测定各实施例步骤(6)所得高纯度核桃青皮多糖中核桃青皮多糖的质量，并分别计算核桃青皮多糖的纯度和相对青皮粉末的提取率，结果如表1所示，其中提取率为所得青皮多糖相对青皮粉末质量的百分比。
表1核桃青皮多糖的提取率和纯度