本发明属于医药领域，具体涉及一种人脐带华通胶间充质干细胞的制备方法。
背景技术：
间充质干细胞是来源于中胚层的干细胞，是一种非造血来源的多向分化潜能的干细胞。由于其免疫源性弱，并能向多种组织增殖分化，因此，已经成为组织工程技术领域及细胞移植治疗中理想的种子细胞来源。最早，在人骨髓中发现间充质干细胞，然而，骨髓中还存在大量其他细胞，如造血细胞、成纤维细胞、脂肪细胞等，间充质干细胞含量相对较少，分离纯化相对困难，同时发现，随着年龄的增长，骨髓间充质干细胞的数量和增殖分化能力均显著下降。同时，获取骨髓组织对供者带来较大困苦和创伤，难以广泛应用于临床。
相比于骨髓间充质干细胞，华通胶间充质干细胞，来源于新生儿脐带，属于医疗废弃组织，对供者不产生困苦和损伤，且来源广泛，因此更容易得到推广应用于临床。华通胶组织是脐带动静脉之间的胶冻样间质，含有较多胶原纤维，胶原酶能够水解华通胶组织的胶原纤维结构，但不会对wjmscs造成损伤。
技术实现要素：
为了较少对供者的创伤，获取生物纯度及活性更高的间充质干细胞，本发明提供一种wjmscs的制备方法。其技术方案如下：
本发明任一项所述wjmscs的制备方法，包括以下步骤：
1、试剂配制
(1)0.2％ii型胶原酶100mgii型胶原酶加入50mldmem/f12培养基，完全溶解后，0.22μm过滤除菌。
(2)dmed/f12完全培养基
450mldmem/f12培养基内加入50ml特级胎牛血清，配置成含10％胎牛血清的完全培养基，加入青霉素及链霉素，使浓度为100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素。
2、wjmscs分离培养步骤
(1)取足月产健康新生儿脐带约30cm，无菌储存于d-hanks液中，2-6℃保存；
(2)在超净台中用平衡盐溶液洗去脐带残留血液，用手术剪将脐带剪成4cm大小节段，取每一节段，手术剪纵行剪开脐带外膜，仔细游离2条脐带动脉和1条脐带静脉并丢弃，取血管之间以及血管与外膜之间的华通胶组织，剪切成约1mm3大小碎块，平衡盐溶液冲洗后，浸于浓度为0.2％胶原酶溶液中，置37℃恒温消化18小时；
(3)观察消化情况，未见组织块，消化液成粘稠状，2500rpm离心10min，弃掉上层上清，剩余粘稠状液体再用0.25％胰蛋白酶37℃恒温消化30分钟；
(4)消化后2500rpm离心10min，弃上清，加dmem/f12培养基和胎牛血清，使胎牛血清浓度达到20％，于37℃，5％co2条件培养；
(5)细胞于第2天开始贴壁生长，第4天用含20％胎牛血清的dmem/f12完全培养基进行换液；
(6)以后每2到3天换液一次，待细胞融合达到80-90％时，进行传代培养；
(7)弃上清，pbs洗细胞，0.25％胰蛋白酶消化5min，1000rpm离心，进行细胞传代；
(8)传代后用含10％胎牛血清的dmem/f12培养基进行培养，每3天进行换液。
同现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)取材方便，来源广泛，对供者无创伤，分离培养方法简单，不受伦理、道德及法律限制。
(2)本发明获得的wjmscs相对纯净，无杂质细胞，污染机会少。
(3)脐带中mscs含量丰富，高于其他组织，且不受年龄影响，增殖分化能力强，生物性能稳定。
(4)人wjmscs不表达mhc-ii，mhc-i的表达远低于骨髓间充质干细胞，属于免疫缺陷细胞，因此在异体移植中无免疫排斥反应或者反应较弱，临床应用前景广阔。
具体实施例
实施例1分离培养华通胶间充质干细胞
26岁女性，初产妇，胎儿足月产，剖宫产，取新鲜新生儿脐带约30cm为材料，无菌储存于d-hanks液中，2-6℃保存。所取脐带材料以足月产健康新生儿脐带为优，可保证其脐带发育良好；再则，优选剖腹产新生儿脐带，较之阴道产感染率低。
在超净工作台中用平衡盐溶液洗去脐带残留血液，将脐带剪成4cm大小节段，对每一节段均纵行剪开脐带外膜，游离去除2条脐动脉和1条脐静脉，取血管之间以及血管与外膜之间的华通胶组织，剪切成约1mm3大小碎块，以平衡盐溶液冲洗后，浸于浓度为0.2％胶原酶溶液中，胶原酶溶液，置37℃消化5小时，观察消化情况，未见组织块，消化液成粘稠状，2500rpm离心10分钟，弃掉上层上清液，剩余粘稠液体再用0.25％胰蛋白酶37℃恒温消化30分钟，2500rpm离心10分钟，弃上清液，加dmem/f12培养基和胎牛血清，使胎牛血清浓度达到20％，于37℃、5％二氧化碳条件培养。细胞于第2天开始贴壁，第4天用含20％胎牛血清的dmem/f12完全培养基进行换液。以后每2～3天换液一次，待细胞融合达到80-90％时，进行传代培养。弃上清液，pbs洗细胞，0.25％胰蛋白酶消化5分钟，1000rpm离心，进行细胞传代。传代后用含10％胎牛血清的dmem/f12培养基进行培养，每3天进行换液。
实施例2分离培养华通胶间充质干细胞
28岁女性，经产妇，胎儿足月产，剖宫产，取新鲜新生儿脐带约20cm为材料，无菌储存于d-hanks液中，2-6℃保存。
在超净工作台中用平衡盐溶液洗去脐带残留血液，将脐带剪成5cm大小节段，对每一节段均纵行剪开脐带外膜，游离去除脐动脉、脐静脉，取血管之间以及血管与外膜之间的华通胶组织，剪切成约1mm3大小碎块，以平衡盐溶液冲洗后，浸于浓度为0.2％胶原酶溶液中，置37℃消化5小时，待消化液成粘稠状，2500rpm离心10分钟，弃掉上清液，再用0.25％胰蛋白酶37℃恒温消化30分钟，2500rpm离心10分钟，弃上清液，加dmem/f12培养基和胎牛血清，使胎牛血清浓度为20％，37℃、5％二氧化碳条件培养。细胞于第3天开始贴壁，第5天用含20％胎牛血清的dmem/f12完全培养基进行换液。以后每2～3天换液一次，待细胞融合达到80-90％时，进行传代培养。弃上清液，pbs洗细胞，0.25％胰蛋白酶消化5分钟，1000rpm离心，进行细胞传代。传代后用含10％胎牛血清的dmem/f12培养基进行培养，每3天进行换液。
实施例3分离培养华通胶间充质干细胞
25岁女性，经产妇，胎儿足月产，剖宫产，取新鲜新生儿脐带约30cm为材料，在超净工作台中用平衡盐溶液洗去脐带残留血液，将脐带剪成6cm大小节段，均纵行剪开脐带外膜，游离去除脐动脉、脐静脉，取华通胶组织，剪切成约1mm3大小碎块，以平衡盐溶液冲洗后，浸于浓度为0.2％胶原酶溶液中，置37℃消化5小时，待消化液成粘稠状，2500rpm离心10分钟，弃掉上清液，再用0.25％胰蛋白酶37℃恒温消化30分钟，2500rpm离心10分钟，弃上清液，加dmem/f12培养基和胎牛血清，使胎牛血清浓度为20％，37℃、5％二氧化碳条件培养。细胞于第2天开始贴壁，第4天用含20％胎牛血清的dmem/f12完全培养基进行换液。以后每3天换液一次，待细胞融合达到80-90％时，进行传代培养。弃上清液，pbs洗细胞，0.25％胰蛋白酶消化5分钟，1000rpm离心，进行细胞传代。传代后用含10％胎牛血清的dmem/f12培养基进行培养，每3天进行换液。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。