一种超声波收获细胞的方法和装置与流程

本发明涉及生物制品技术领域，具体涉及一种利用超声技术收获细胞工厂内细胞的方法。

背景技术：

细胞工厂是生物、医药行业常用的一种细胞培养工具，适用于工业上批量生产疫苗，如水痘疫苗、甲肝疫苗。大部分细胞在培养的过程中都是贴壁生长，在制备疫苗时，特别是对于一些具有很强细胞结合性的细胞内病毒疫苗的制备，如水痘病毒、轮状病毒、ev71病毒、ca16病毒、甲肝病毒，需要将培养好的细胞从细胞工厂、转瓶或克氏瓶等培养工具中剥离收集，破碎，才能能得到游离的病毒颗粒。目前，对于细胞的收集主要为以下两种方法：一是冷冻法，具体为，将细胞培养器皿放入冰箱中进行冷冻，然后取出、融化，再进行收获，其冷冻耗时长，病毒损失量大，若将其用于细胞工厂内细胞的收集，则需要配备大量的超低温保存设备，可行性差；二是消化液法，具体为，将含有消化酶的消化液加入到细胞培养器皿中，切断细胞与细胞培养器皿之间的粘附分子，将细胞从细胞培养器皿剥离收集，再通过离心去除引入的外源物质，实现细胞的收获，该种方式工艺步骤复杂，工艺过程会有病毒的损失，同时污染风险高。适用于细胞工厂系统，但存在引入消化液成分并难以去除的弊端，对疫苗的安全性存在风险。综上所述，亟待开发一种安全、高效的细胞工厂内收获细胞的方法。

技术实现要素：

本发明目的在于克服现有技术存在的缺点，寻求设计一种基于超声波收获细胞的的方法和装置，解决了现有收获细胞方法耗时长、处理工艺复杂的问题。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种超声波收获细胞的方法，采用超声波将待收获细胞从细胞工厂壁上剥离，剥离的细胞随培养液一起从细胞工厂出液口（或进液口）排出。

一种超声波收获细胞的装置，包括超声波装置和细胞工厂，超声波装置的振动端置于细胞工厂外侧，通过产生超声波实现细胞工厂的振动，进而将细胞从细胞工厂壁上剥离。

超声波装置的振动端紧贴细胞工厂外壁，或与细胞工厂外壁之间有一定距离。

所述超声波装置包括超声波发生器、超声波换能器和振动端，超声波发生器、超声波换能器和振动端依次连接，振动端与细胞工厂外壁接触。

振动端2截面为“一”字型或“c”型。

超声波收获细胞的装置，包括实现振动端向细胞工厂外壁靠近的水平移动装置。

水平移动装置包括平台、水平导轨和气缸，在平台上固定至少一条水平导轨，超声波装置与水平导轨滑动连接，气缸的活塞杆与超声波装置连接,在气缸的带动下，超声波装置沿水平导轨左右移动，带动振动端靠近或远离细胞工厂。

振动端能够同时对细胞工厂至少一层产生将细胞剥离的超声波。

振动端置于细胞工厂某一层的外侧，通过控制振动端相对于细胞工厂高度方向上移动，实现对细胞工厂的每一层的剥离。

超声波收获细胞的装置，还应当包括竖直移动装置，竖直移动装置用于带动振动端2沿细胞工厂高度方向移动，并在细胞工厂的每一层停靠。

所述竖直移动装置包括丝杠、丝杠螺母、伺服电机、轴承、联轴器、竖直导轨，伺服电机依次通过联轴器和轴承与丝杠转动连接，丝杠螺母与在丝杠连接，竖直导轨与丝杠平行设置，平台固定在丝杠螺母上，与竖直导轨滑动连接。

超声波收获细胞的装置，还包括控制器和触摸屏，控制器分别与超声波发生器、气缸和伺服电机连接，实现对超声波功率、开启时间，水平移动距离和竖直移动距离的精准控制，触摸屏与控制器连接，通过触摸屏进行操作实现上述控制过程。

超声波收获细胞的装置，还包括移动箱体，箱体底部固定安装万向轮，将超声波装置、细胞工厂、水平移动装置和竖直移动装置均放置在箱体内，在箱体内一侧设置放置细胞工厂的容纳腔，在容纳腔底部两侧边固定滑轨，抽槽外侧固定的滑块与滑轨滑动连接，容纳腔外侧设置推拉门，移动推拉门实现细胞工厂的存取，平行放置的丝杠和竖直导轨两端均固定在容纳腔一侧的移动箱体上。

本发明与现有技术相比具有以下有益效果：采用超声波震荡将细胞从培养器皿表面剥离，工艺简单，耗时短，效率高，降低污染风险，且病毒损失少,提高病毒收率；另外，超声收集的过程中能够同时将部分细胞破碎，降低后续破碎步骤压力，特别适用于细胞工厂这种批量化的细胞培养工具。

附图说明

图1是实施例1涉及的超声波收获细胞的装置主视图。

图2是实施例1涉及的超声波收获细胞的装置侧视图。

图3是图2的剖视图。

具体实施方式

下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步说明。

实施例1：

一种超声波收获细胞的方法，采用超声波将待收获细胞从细胞工厂壁上剥离，剥离的细胞随培养液一起从细胞工厂出液口（或进液口）排出。

一种超声波收获细胞的装置，包括超声波装置和细胞工厂1，超声波装置的振动端2置于细胞工厂外侧，通过产生超声波实现细胞工厂的振动，进而将细胞从细胞工厂壁上剥离。

超声波装置的振动端2紧贴细胞工厂外壁，或与细胞工厂外壁之间有一定距离，无论哪种情况，只要超声波装置产生的超声波能够通过振动细胞工厂，将细胞从细胞工厂内壁上剥离即可。为了达到较好的剥离效果，超声波装置的振动端2紧贴细胞工厂外壁为优选的技术方案。

所述超声波装置包括超声波发生器11、超声波换能器3和振动端2，超声波发生器11、超声波换能器3和振动端依次连接，振动端2与细胞工厂1外壁接触。

更进一步的方案，根据实际需要对振动端2的外形进行设置，将振动端2设计成“一”字型，置于细胞工厂一侧，也可以设计成“c”型，将细胞工厂半包围，以提高对细胞的剥离效果。也可以根据需要将其设计成成其他的的形状。

超声波收获细胞的装置工作时，振动端向细胞工厂1外壁靠近，当与细胞工厂外壁接触时，启动超声波发生器11，超声波发生器11将产生的高频交流电信号输送给超声波换能器3，超声波换能器3产生高频机械震荡（即超声波）并将其传递到振动端2，实现细胞工厂内培养液和培养细胞震荡，将细胞从细胞工厂1内壁上剥离。

更进一步的方案，超声波收获细胞的装置，包括实现振动端2向细胞工厂外壁靠近的水平移动装置。水平移动装置包括平台4、水平导轨（图中未示）和气缸5，在平台4上固定至少一条水平导轨，优选为两条水平导轨，超声波装置与水平导轨滑动连接，具体地，超声波换能器3与水平导轨滑动连接，气缸5的活塞杆与超声波换能器3连接。在气缸5的带动下，超声波换能器3沿水平导轨向左（或右）移动，带动振动端2靠近细胞工厂1，直至与细胞工厂某一层的侧壁接触，对该层进行超声处理，处理完成后，气缸5收缩，超声波换能器3沿水平导轨向右（或左）移动，带动振动端2远离细胞工厂1。

更进一步的方案，振动端2能够同时对细胞工厂至少一层产生将细胞剥离的超声波。由于实际使用过程中细胞工厂的层数是不确定的，优选的技术方案为，振动端置于细胞工厂某一层的外侧，通过控制振动端2相对于细胞工厂1高度方向上移动，实现对细胞工厂的每一层的剥离。

为了实现上述竖直方向上的移动，超声波收获细胞的装置，还应当包括竖直移动装置，竖直移动装置用于带动振动端2沿细胞工厂高度方向移动，并在细胞工厂的每一层停靠。所述竖直移动装置包括丝杠6、丝杠螺母（图中未示）、伺服电机7、轴承8、联轴器9、竖直导轨10，伺服电机7依次通过联轴器9和轴承8与丝杠6转动连接，丝杠螺母与在丝杠6连接，竖直导轨10与丝杠6平行设置，平台4固定在丝杠螺母上，与竖直导轨10滑动连接。伺服电机7工作时，驱动丝杠螺母上下移动，由于平台4固定在丝杠螺母上，平台4带动振动端2与丝杠螺母同步移动，实现在细胞工厂不同层之间的移动。

更进一步的方案，超声波收获细胞的装置，还包括控制器（图中未示）和触摸屏12，控制器分别与超声波发生器11、气缸5和伺服电机7连接，实现对超声波功率、开启时间，水平移动距离和竖直移动距离的精准控制，触摸屏12与控制器11连接，通过触摸屏12进行操作实现上述控制过程。

更进一步的方案，超声波收获细胞的装置，还包括移动箱体，箱体底部固定安装万向轮13，以便于超声波收获细胞的装置移动，将超声波装置、细胞工厂1、水平移动装置和竖直移动装置均放置在箱体内，在箱体内一侧设置放置细胞工厂的容纳腔，抽槽14与容纳腔滑动连接，具体地，在容纳腔底部两侧边固定滑轨15，抽槽14外侧固定的滑块16与滑轨15滑动连接，容纳腔外侧设置推拉门17，移动推拉门17实现细胞工厂1的存取。平行放置的丝杠6和竖直导轨10两端均固定在容纳腔一侧的移动箱体上，丝杠螺母与在丝杠6连接，伺服电机7依次通过联轴器9和轴承8与丝杠6转动连接，平台4固定在丝杠螺母上，与竖直导轨10滑动连接，在平台4上固定水平导轨，超声波换能器3一端与气缸5的活塞杆连接，在气缸5的带动下超声波换能器3沿水平导轨滑动。

使用时，拉出抽槽14，将细胞工厂放入抽槽14中，将抽槽14推入容纳腔内。在气缸的带动下，振动端2向细胞工厂靠近，紧贴在细胞工厂外壁后，启动超声波装置，产生超声波，通过振动端2传递到细胞工厂，完成细胞工厂内细胞的剥离，然后气缸收缩，振动端2沿水平导轨移动，振动端2远离细胞工厂，达到指定位置后，伺服电机启动，振动端2沿竖直导轨向上或向下移动一个细胞工厂的距离，如此重复，直至完成对整个细胞工厂内细胞的剥离。

实施例2

本实施例分别采用三种不同方法对水痘病毒进行收获。本实施例中所述百分数均为体积百分数。

细胞培养：复苏、传代mrc-5人二倍体细胞至生产规模（本实施例为10层细胞工厂），生长液为mem细胞培养基+10%新生牛血清+1.8%碳酸氢钠（7.5%）并补加适量l-谷氨酰胺，待细胞长成致密单层后用于病毒接种。

病毒接种：取一瓶细胞进行细胞计数，按照细胞数和病毒滴度计算moi；弃掉细胞生长液上清，毒种按照计算好的moi接种于细胞中，先将毒种与病毒培养液进行稀释后加入细胞瓶中，于35℃恒温室中吸附60分钟，吸附结束后每瓶加入合适的病毒培养液，放入35℃恒温室中继续培养，病毒培养液为mem+2%新生牛血清+2%碳酸氢钠（7.5%）并补加适量l-谷氨酰胺；

洗换：病毒接种后48h，弃病毒培养液上清，加入pbs溶液清洗细胞表面4次，补加病毒维持液，放入35℃恒温室中继续培养，病毒培养液为mem+2%碳酸氢钠（7.5%）并补加适量l-谷氨酰胺；

收获：病毒培养72h左右，细胞病变达到60-70%，采用下面3种方法进行病毒收获。每种方法3个细胞工厂。

方法1：冻融收获：弃病毒维持液，加入收获液，放置于冰箱中冻存16-24小时。取出细胞工厂，室温融化，收获、破碎细胞。制备收获液。

方法2：消化收获：弃病毒维持液，加入消化液，消化完成后加入收获液收集细胞；离心去除引入的消化液成分；再加入收获液复融细胞沉淀。进行细胞和病毒收获。制备收获液。

方法3：超声收获：弃病毒维持液，加入收获液，采用实施例1涉及的超声剥离、破碎，收获细胞。制备收获液。

重复试验3次。

实验结果：

本实验结果表明：

1、采用三种方式水痘病毒的收获，冻融工艺病毒滴度为4.2-4.4；消化工艺病毒滴度为4.8-4.9；超声工艺病毒滴度为5.5-5.6。超声工艺的结果高于冻融和消化工艺。

2、采用三种方式水痘病毒的收获，冻融工艺收获时间为28-32小时；消化工艺收获时间为3小时左右；超声工艺收获时间为0.5小时。超声工艺收获时间远少于冻融和消化工艺。

通过实验可以表明超声工艺的病毒滴度和操作时间优于其他工艺。