一种鸡A亚群禽白血病抗性分子标记tva304-305insGCCC及其应用的制作方法

本发明属于疾病抗性品种选育技术领域，更具体地，涉及一种鸡a亚群禽白血病抗性分子标记tva^{304-305insgccc}及其应用。

背景技术：

a亚群禽白血病是由a亚群禽白血病病毒(avianleukosisvirussubgroupa，alv-a)引起的一种鸡免疫抑制性肿瘤性传染病。alv-a主要侵害鸡的淋巴细胞，并转移至肝、肾、脾等其它器官，导致淋巴细胞瘤和其他恶性肿瘤。alv-a可引起感染鸡群产生免疫抑制、生产性能下降，乃至发生特征性肿瘤而死亡，给养禽业造成巨大的经济损失。迄今为止，该病尚无商品化疫苗和有效的治疗方法，主要通过淘汰阳性鸡来净化种鸡群和生物安全措施进行预防。然而，近年来已从商品肉鸡、蛋鸡、地方鸡种、野生鸟类以及国外进口疫苗和祖代鸡中均分离出alv-a。可见，现有措施并不能完全控制a亚群禽白血病在中国的发生与流行，该病已成为威胁我国养鸡业(尤其是种鸡业)可持续健康发展的重大疾病之一。因此，研发更适合防控我国禽白血病的新策略已迫在眉睫。国外已有研究证实，从宿主遗传抗性方面研究禽白血病的抗病育种已成为防控该病的有效策略。

alv-a由tva受体基因编码的细胞表面特异性受体tva介导侵入宿主细胞，继而发生感染，决定宿主细胞对alv-a感染的易感性或抗性。tva受体基因的遗传突变会导致受体蛋白的完全缺失或表达一个不适宜作为alv-a受体的缺陷型受体蛋白，从而引起宿主细胞对alv-a的感染产生遗传抗性。

因此，鉴定a亚群禽白血病抗性分子标记，并应用于筛选a亚群禽白血病遗传抗性特异种质以培育遗传抗a亚群禽白血病鸡品种(系)是实现禽白血病抗病育种的关键。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服现有技术并不能完全控制a亚群禽白血病在中国的发生与流行的不足，提供一种鸡a亚群禽白血病抗性分子标记tva^{304-305insgccc}及其应用。

本发明的第一个目的是提供一种鸡a亚群禽白血病遗传抗性的分子标记。

本发明的第二个目的是提供所述分子标记在筛选a亚群禽白血病抗性鸡中的应用。

本发明的第三个目的是提供所述分子标记在筛选a亚群禽白血病抗性鸡检测试剂盒中的应用。

本发明的第四个目的是提供所述分子标记在鸡a亚群禽白血病抗病育种中的应用。

本发明的第五个目的是提供一对检测所述分子标记的引物。

本发明的第六个目的是提供检测所述分子标记的引物在筛选a亚群禽白血病抗性鸡检测试剂盒中的应用。

本发明的第七个目的是提供所述试剂盒在鸡a亚群禽白血病抗病育种中的应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

本发明分析了中国鸡种tva受体基因的遗传变异情况，发现中国鸡种中tva基因dna序列(genbank登录号为ay531262.1)第304与305碱基之间存在gccc插入突变，发明人通过体外实验证明了该tva基因自然突变引起宿主抗alv-a的感染。具体原因在于tva^{304-305insgccc}突变位于tva受体基因第1外显子，引起tva受体基因发生移码突变并产生提前终止编码，导致tva受体蛋白表达的完全缺失，从而引起宿主抗alv-a的感染。本发明还进一步利用该分子标记建立了对alv-a感染抗性的检测方法及检测试剂盒，其检测结果与体外alv-a攻毒一致。

因此本发明要求保护一个影响鸡a亚群禽白血病抗性的分子标记，所述分子标记为鸡tva基因dna序列第304与305碱基之间存在gccc插入突变，记为tva^{304-305insgccc}。

若tva基因dna序列第304与305位碱基之间无插入突变则为野生型，则对alv-a的感染易感(无抗性)；即如待测鸡的tva^{304-305insgccc}抗性位点基因型为野生型tva^s/s，则该个体为a亚群禽白血病易感鸡；

若tva基因dna序列第304与305位碱基之间存在杂合插入突变(tva^s/insgccc)，则该个体为a亚群禽白血病易感鸡，但是对alv-a的感染产生隐形遗传抗性，杂合型突变(tva^s/insgccc)的公母鸡交配后的下一代可以筛选出对alv-a感染产生抗性的表型；即如待测种公鸡、种母鸡的基因型均为tva^s/insgccc，其交配后的下一代可能产生基因型为tva^{insgccc/insgccc}的个体；

若tva基因序列第304与305位碱基之间存在纯合插入突变(tva^{insgccc/insgccc})，则具有对alv-a的感染产生抗性的表型，即如待测鸡的基因型为tva^{insgccc/insgccc}，则该个体为a亚群禽白血病抗性鸡。

同时本发明还要求保护以下内容：

所述分子标记在筛选a亚群禽白血病抗性鸡检测试剂盒中的应用。

所述分子标记在鸡a亚群禽白血病抗病育种中的应用。

进一步，本发明还要求保护一对检测所述分子标记的引物，其核苷酸序列如seqidno：1所示。

正向引物f：5’-ggttcagcagatcctcatc-3’

反向引物r：5’-agcactacaaagccgttc-3’

检测所述分子标记的试剂在制备筛选a亚群禽白血病抗性鸡检测试剂盒中的应用，也属于本发明的保护范围。

优选地，所述试剂为以上所述引物。

进一步，本发明还要求保护一个检测鸡a亚群禽白血病抗性的试剂盒，包括所述的试剂。

优选地，所述试剂为以上所述引物。

最优选地，所述试剂盒包括：检测引物和pcr扩增试剂；

其中，检测引物其核苷酸序列如seqidno：1所示；

pcr扩增试剂包括：10×buffer，dntps，kod-fx，ddh2o。

其使用方法包括以下步骤：

s1、提取待测样本基因组dna；

s2、pcr检测

pcr反应体系组成：dna模板1μl，10×buffer2.5μl，dntps2μl，上下游检测引物(其核苷酸序列如seqidno：1所示)1μl，kod-fx0.5μl，ddh2o补至25μl。

pcr反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；72℃后延伸10min，最后4℃保存。

s3、2％琼脂糖凝胶电泳检测后pcr扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司纯化并进行测序。

s4、结果判读

若待测鸡tva^{304-305insgccc}抗性位点的基因型为野生型tva^s/s，则该个体为a亚群禽白血病易感鸡；

若待测鸡tva^{304-305insgccc}抗性位点的基因型为杂合突变型tva^s/insgccc，则该个体不具有alv-a的感染抗性表型，该个体仍为a亚群禽白血病易感鸡，但是携带对alv-a感染抗性的隐性基因；

若待测鸡tva^{304-305insgccc}抗性位点的基因型为纯合突变型tva^{insgccc/insgccc}，则该个体为a亚群禽白血病抗性鸡。

同时本发明还要求保护以下内容：

检测所述分子标记的引物在筛选a亚群禽白血病抗性鸡检测试剂盒中的应用.

所述试剂盒在鸡a亚群禽白血病抗病育种中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明首次发现tva基因dna序列第304与305位碱基之间存在gccc插入突变，发明人进一步研究证实该tva基因自然突变能够引起宿主抗alv-a的感染。本发明利用该分子标记建立了筛选a亚群禽白血病抗性鸡检测试剂盒，能够准确判定样本为a亚群禽白血病抗性鸡还是易感鸡，可应用于筛选alv-a遗传抗性鸡品种(系)的育种素材，从而开展alv-a遗传抗性鸡品种(系)的选育，具有很好的应用和推广价值。

附图说明

图1为tva基因3个片段pcr扩增结果；m：dl2000marker；a-c：引物a、b、c的pcr扩增产物。

图2为tva^{304-305insgccc}位点不同基因型序列测序图谱。

图3为为rcasbp(a)-egfp表达质粒结构示意图。

图4为rcasbp(a)-gfp病毒感染tva^{304-305insgccc}位点不同基因型cef细胞。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例

1tva受体基因的遗传变异分析

一、实验方法

1、tva受体基因的引物设计

以ncbi数据库中鸡tva基因的dna序列(genbank登录号：ay531262.1)为参考，设计3对引物分3个片段pcr扩增tva基因全长序列3607bp(a段、b段和c段)，引物序列、位置及pcr扩增片段大小如表1所示。

表1tva受体基因全长序列pcr扩增信息

2、pcr反应

提取不同中国鸡种(包括地方鸡种和商业品系)血液样品的基因组dna，用该3对引物pcr扩增tva基因全长序列。

pcr反应体系组成：dna模板1μl，10×buffer2.5μl，dntps2μl，上下游引物各1μl，kod-fx0.5μl，ddh2o补至25μl。

pcr反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火(a段67℃，b、c段60℃)退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；72℃后延伸10min，最后4℃保存。

pcr产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测。

并将pcr扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司纯化并进行测序，利用dnastar中seqman功能模块对测序所得序列进行拼接组装，并进行序列比对筛选变异位点。

二、实验结果

结果如图1所示，pcr扩增出tva基因的a、b和c片段的目的条带，片段大小与预期结果相符。

tva受体基因的遗传变异分析发现中国鸡种中tva基因序列第304与305位碱基之间存在gccc插入突变(tva^{304-305insgccc})，序列测序图谱如图2所示。图2中序列由上至下依次是参考序列(野生型个体)、杂合突变型个体和纯合突变型个体的序列，方框所示为tva基因序列第304与305碱基之间的gccc插入突变。

实施例2

tva^{304-305insgccc}突变致宿主抗alv-a感染

一、实验方法

成功构建了rcasbp(a)-egfp表达质粒(alv-a报告载体)，见图3。将rcasbp(a)-egfp表达质粒转染入df-1细胞中，转染后7天，收集细胞上清液的rcasbp(a)-gfp病毒(即alv-a报告病毒，该病毒可感染鸡成纤维细胞cef)。利用rcasbp(a)-gfp病毒感染的tva^{304-305insgccc}突变位点野生型tva^s/s、杂合突变型tva^s/insgccc和纯合突变型tva^{insgccc/insgccc}cef(利用实施例1中检测的鸡制备的)，感染后1、2、4、7天，利用流式细胞技术检测rcasbp(a)-gfp病毒感染tva^{304-305insgccc}突变位点不同基因型cef的情况。

二、实验结果

结果如图4所示，野生型tva^s/scef和杂合突变型tva^s/insgccccef对alv-a易感，而纯合突变型tva^{insgccc/insgccc}cef抗alv-a的感染，证实tva^{304-305insgccc}自然突变导致宿主抗alv-a的感染。

实施例3

一种筛选鸡对alv-a感染抗性的检测试剂盒

一、组成

检测引物和pcr扩增试剂，

其中，检测引物其核苷酸序列如seqidno：1所示，

pcr扩增试剂包括：10×buffer，dntps，kod-fx，ddh2o。

二、使用方法

1、提取待测样本基因组dna；

2、pcr检测

pcr反应体系组成：dna模板1μl，10×buffer2.5μl，dntps2μl，上下游检测引物(其核苷酸序列如seqidno：1所示)1μl，kod-fx0.5μl，ddh2o补至25μl。

pcr反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；72℃后延伸10min，最后4℃保存。

3、2％琼脂糖凝胶电泳检测后pcr扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司纯化并进行测序。

4、结果判读

表2a亚群禽白血病遗传抗性鸡的鉴定标准

若tva^{304-305insgccc}抗性位点基因型为野生型tva^s/s，则对alv-a感染的无抗性(易感)，该个体为a亚群禽白血病易感鸡；

若tva^{304-305insgccc}抗性位点基因型为tva^s/insgccc，则对alv-a的感染易感，但该个体携带a亚群禽白血病隐性遗传抗性基因；

若tva^{304-305insgccc}抗性位点基因型为tva^{insgccc/insgccc}，则对alv-a的感染产生抗性，该个体为a亚群禽白血病抗性鸡。

实施例4

鸡体内感染alv-a的抗性检测

一、实验方法

用实施例3建立的试剂盒检测鸡对alv-a感染的抗性情况，对同一批样本进行alv-a体内感染宿主的试验，具体操作如下：

将tva^{304-305insgccc}突变野生型、杂合突变型和纯合突变型的1日龄小鸡随机分组，饲养于隔离器，1日龄和5日龄分别腹腔注射等量alv-a(gd08株)。alv-a攻毒1个月后，采集小鸡的血样，利用trizol试剂盒抽提血样总rna。

设计alv-a-env的rt-pcr扩增上游引物和下游引物：

env-f：5’-ggatgaggtgactaagaaag-3’；

env-r：5’-agagaaagaggggtgtctaaggaga-3’。

rt-pcr扩增alv-a的env基因编码序列，rt-pcr扩增片段长度为692bp。利用onesteprt-pcrkitver.2试剂盒进行rt-pcr扩增，pcr反应程序：50℃反转录30min；94℃30s，56℃60s，72℃60s，35个循环；72℃后延伸10min。pcr产物在2％琼脂糖凝胶电泳检测，如观察到692bp的目的条带，则该样品发生病毒血症(alv-a阳性)，如无目的条带的扩增，则该样品没有发生病毒血症(alv-a阴性)。

二、实验结果

alv-a攻毒试验结果表明：tva^{304-305insgccc}突变位点野生型tva^s/s小鸡(20只)攻alv-a野毒后均为alv-a阳性，杂合突变型tva^s/insgccc小鸡(25只)攻alv-a野毒后也均为alv-a阳性，而纯合突变型tva^{insgccc/insgccc}小鸡(23只)攻alv-a野毒后均为alv-a阴性，见表3。

表3alv-a感染发生率

alv-a攻毒试验与实施例3的试剂盒检测结果一致。

实施例5

alv-a遗传抗性鸡的筛选与应用

一、实验方法

用实施例3的试剂盒检测8个地方鸡种和10个商业肉鸡品系共966个样品抗alv-a的抗性和遗传改良潜力。

二、实验结果

结果见表4，表4结果表明康乐鸡和宁都黄鸡等地方鸡种以及cb03、cb07和cb08等商业肉鸡品系具有良好的抗alv-a遗传改良潜力，可从这些品种(系)中筛选出培育抗alv-a感染的育种素材，并运用于alv-a遗传抗性鸡品种(系)的选育，以防控a亚群禽白血病。

表4中国鸡种tva^{304-305insgccc}突变位点的基因型频率

备注：cb01-cb10等代表10个商业肉鸡品系。