一株近玫色锁掷孢酵母及其应用的制作方法

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株近玫色锁掷孢酵母，及根据该近玫色锁掷孢酵母制备的微生物种衣剂和应用。

背景技术：

种衣剂是用于种子包衣、具有成膜特性的一类制剂，传统的种衣剂通过采用黏结剂或成膜剂，将农药或农药与化肥等包覆在种子外，从而实现防虫、抗病以及提供营养等作用。微生物种衣剂是种衣剂的一种，其在种衣剂中添加活菌，根据菌的种类和数量不同，微生物种衣剂的功能和效果也不同。例如，根瘤菌可以促进豆科作物根系结瘤；枯草芽孢杆菌具有很好的抑菌效果，可以预防病虫害；胶冻样芽孢杆菌解钾效果好，可以为种子萌发增加养分。

微生物种衣剂能够对植物的生长起到正向的促进作用，但是由于种衣剂是外源施加给种子的物质，在施用种衣剂的同时，往往伴随着种子发芽率的降低，有一部分种子会因为施用了种衣剂而影响正常萌发，甚至造成了不萌发的结果，给农业生产带来损失，因此，在保证种衣剂功效的同时，降低种衣剂副作用，是一种研究方向。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种微生物及其制备的微生物种衣剂，使微生物种衣剂能够促进植物生长并且不会影响植物种子萌发率。

第一方面，本发明提供一株近玫色锁掷孢酵母，其保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmccno：60486。

第二方面，本发明提供一种微生物组合物，所述微生物组合物包括第一方面所述的近玫色锁掷孢酵母。

第三方面，本发明提供一种微生物种衣剂，所述微生物种衣剂包括第一方面所述的近玫色锁掷孢酵母。

进一步的，所述微生物种衣剂还包括杀虫剂。

进一步的，所述微生物种衣剂还包括甲基杆菌，所述杀虫剂为噻虫嗪悬浮剂。

进一步的，所述微生物种衣剂中活菌的数量大于10⁶cfu/ml。

第四方面，本发明还提供一种微生物种衣剂的制备方法，包括如下步骤：

提供杀虫剂与菌液，所述菌液中含有第一方面所述的近玫色锁掷孢酵母，将所述菌液与所述杀虫剂混合，得到所述微生物种衣剂。

进一步的，所述菌液中还含有甲基杆菌；

所述菌液的制备方法包括：挑取所述近玫色锁掷孢酵母的单菌落于液体培养基中培养，得到近玫色锁掷孢酵母培养物；挑取所述甲基杆菌的单菌落于液体培养基中培养，得到甲基杆菌培养物；将所述甲基杆菌培养物与所述近玫色锁掷孢酵母培养物按照1～2：1～2的质量比进行混合，得到所述菌液；

将所述菌液与所述杀虫剂混合时，所述菌液中活菌数量达到10⁷cfu/ml～10⁹cfu/ml，所述菌液与所述杀虫剂按照20～50：50～80的质量比进行混合，得到所述微生物种衣剂；

所述杀虫剂为噻虫嗪悬浮剂。

第五方面，本发明还提供一种微生物种衣剂在促进种子萌发与促进植株生长中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果包括：

1.分离得到一株近玫色锁掷孢酵母，并首次用于制备微生物种衣剂；

2.将分离得到的近玫色锁掷孢酵母培养成菌液与杀虫剂一起混合制备微生物种衣剂，制备方法简单易操作，获得的微生物种衣剂效果更好；

3.将近玫色锁掷孢酵母与甲基杆菌配合使用制备微生物种衣剂，能够更好地克服微生物种衣剂影响种子发芽率的问题并且对于促进植株的生长效果更好。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的近玫色锁掷孢酵母在固体培养基上的菌落形态图。

图2为本发明的近玫色锁掷孢酵母在显微镜下的形态图。

图3为本发明实施例的麦苗经不同种衣剂处理后的发芽率对比图。

图4为本发明实施例的麦苗植株7天生理指标对比图。

图5为本发明实施例的盆栽麦苗14天植株生理指标对比图。

图6为本发明实施例的盆栽麦苗14天植株生理指标对比图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一、菌株分离、筛选与鉴定

菌株分离样本来自广东的农田地里采集到的地瓜叶片，具体的分离步骤如下：

秤取1g地瓜叶片，加入到灭过菌的100ml浓度为0.1％的吐温水中；

用破碎机将地瓜叶片打碎得叶片匀浆；

取叶片匀浆稀释至10^-2、10^-3不同浓度梯度；

将不同浓度梯度的叶片匀浆涂布于ams固体培养基中，于28℃恒温培养箱中倒置培养5天；

5天后挑取单菌落，继续接种于新鲜的ams固体培养基上，于28℃恒温培养箱中倒置培养5d，得菌株mn230304；

观察菌落型态，并用1000x的光学显微镜观察菌体型态。

其中，ams固体培养基的配方以每升培养基中的含量计算为：nh4cl0.5g，k2hpo4·3h2o0.7g，kh2po40.54g，mgso4·7h2o1.0g，cacl2·2h2o0.2g，feso4·7h2o4.0mg，znso4·7h2o100ug，mncl2·4h2o30ug，h3bo3300ug，cocl2·6h2o200ug，cucl2·2h2o10ug，nicl2·6h2o20ug，na2moo4·2h2o60mg，琼脂15g，调节ph至6.8，补水至1l。高温灭菌后加入0.22μm滤膜过滤后的甲醇5ml，即得所述ams固体培养基。可以理解，本发明实施例的菌落分离方法及ams固体培养基的配方仅为最佳实施例，不应理解为对本发明实施例的限制。

观察菌落形态结果如图1所示，该菌株的菌落呈不透明的粉橘色，形状为圆形，向上突起，边缘整齐，表面有层膜状。在1000x的光学显微镜下观察菌体型态结果如图2所示，该菌株的菌体能生芽孢，无鞭毛，呈卵圆形。

通过观察菌株的菌落形态和菌体形态，参照《酵母的特征及鉴定手册》，初步鉴定该菌株为掷孢酵母属(sporobolomyces)。

随后，对该菌株进行内转录间隔区(internaltranscribedspacer，its)序列鉴定，its序列是真菌核糖体rna(rrna)基因非转录区的一部分，its鉴定是指对its序列进行dna测序，通过将测序得到的its序列与已知真菌its序列比较，从而获得未知真菌种属信息的一种方法。

本发明实施例中，通过对菌株的its4/5rrna区序列进行扩增、测序，并与数据库的真菌its序列进行比对分析。其中，扩增引物与测序引物为its4：5'-tcctccgcttattgatatgc-3'；its5：5'-ggaagtaaaagtcgtaacaagg-3'，测序结果见序列seqno.1。经its序列同源性分析、系统发育分析得此酵母为近玫色锁掷孢酵母(sporidioboluspararoseus)。

随后，将此株近玫色锁掷孢酵母(sporidioboluspararoseus)mn230304送至广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)进行保藏，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期：2018年11月16日，保藏编号：gdmccno：60486。

可以理解，该株近玫色锁掷孢酵母(sporidioboluspararoseus)mn230304可以用于制备微生物组合物，该微生物组合物可以是该菌株的富集培养物、分离培养物或生物纯培养物。该微生物组合物还可以是微生物种衣剂或其它微生物制剂，根据其应用可以制备不同的微生物组合物。

在本发明实施例中，该微生物组合物可以为一种微生物种衣剂，该微生物种衣剂包括上述分离得到的近玫色锁掷孢酵母(sporidioboluspararoseus)mn230304。

进一步的，所述微生物种衣剂还包括杀虫剂。杀虫剂为常用的种衣剂，可以起到防治病虫害的作用。

进一步的，所述杀虫剂为噻虫嗪悬浮剂。

噻虫嗪是一种全新结构的第二代烟碱类高效低毒杀虫剂，对害虫具有胃毒、触杀及内吸活性。其施药后迅速被内吸，并传导到植株各部位，对刺吸式害虫如蚜虫、飞虱、叶蝉、粉虱等有良好的防效。

噻虫嗪悬浮剂中含有成膜剂和/或黏着剂，成膜剂和黏着剂可以促进种衣剂包裹种子，利于活菌发挥作用，所述成膜剂可以为聚乙烯吡咯烷酮，所述黏着剂可以为聚乙二醇。

二、小麦种植试验

1、微生物种衣剂的制备及试验设计

为了验证上述近玫色锁掷孢酵母制备的微生物种衣剂的效果，本发明实施例还设计对照试验观察上述近玫色锁掷孢酵母制备的微生物种衣剂与其它菌液制备的微生物种衣剂对小麦种子萌发率的影响，以及对小麦植株生长的影响。

本发明实施例中，选用的用于制备微生物种衣剂的其它微生物有甲基杆菌(methylotrophicbacteria)和花溪掷孢酵母(sporobolomyceshuaxiensisliu)。其中，甲基杆菌是一类能够利用自然界中的一碳有机化合物(one–carbonorganiccompounds)的微生物。甲基杆菌属的细菌大多数呈粉红色，它们通常被称作ppfm细菌(pink-pigmentedfacultativelymethylotrophicbacteria)。ppfm细菌通常寄生在植物根、茎、叶表上，尤以叶表最为丰富，ppfm以植物分泌的一碳化合物如甲醇为碳源，并产生植物激素如生长素(iaa)、细胞分裂素(ck)，并对植物氮代谢、种子发芽、光合作用、植物营养等有着正向作用。甲基杆菌常被用来制备微生物种衣剂，能够对植物的生长起到正向的促进作用。本发明实施例中，甲基杆菌采购自北纳生物，编号为bncc165774。

花溪掷孢酵母为公开号cn101037657a的专利文献中的菌株，该文献公开了花溪掷孢酵母在促进萝卜种子发芽上的应用，该菌株保藏编号为：cctccno：m207017。

本发明实施例中，除了利用单一的菌株制备微生物种衣剂外，还将不同的菌株混合制备微生物种衣剂。例如将近玫色锁掷孢酵母与甲基杆菌混合制备微生物种衣剂，花溪掷孢酵母与甲基杆菌混合制备微生物种衣剂。

本发明实施例提供一种微生物种衣剂的制备方法，包括如下步骤：

提供杀虫剂与菌液，所述菌液中含有上述实施例所述的近玫色锁掷孢酵母，将所述菌液与所述杀虫剂混合，得到所述微生物种衣剂。

将菌液和杀虫剂混合制备微生物种衣剂，方法简单易操作，得到的微生物种衣剂具有杀虫防病虫害的作用，又能促进植物生长。

进一步的，所述杀虫剂为噻虫嗪悬浮剂。

噻虫嗪是一种全新结构的第二代烟碱类高效低毒杀虫剂，对害虫具有胃毒、触杀及内吸活性。其施药后迅速被内吸，并传导到植株各部位，对刺吸式害虫如蚜虫、飞虱、叶蝉、粉虱等有良好的防效。

噻虫嗪悬浮剂中含有成膜剂和/或黏着剂，成膜剂和黏着剂可以促进种衣剂包裹种子，利于活菌发挥作用，所述成膜剂可以为聚乙烯吡咯烷酮，所述黏着剂可以为聚乙二醇。

进一步的，所述噻虫嗪悬浮剂的浓度为35％。

进一步的，本发明的一实施例中，所述微生物种衣剂的制备方法为：

步骤1、先将近玫色锁掷孢酵母(sporidioboluspararoseus)mn230304菌株于固体培养基中培养得到单克隆菌落。

步骤2、挑一株单克隆菌落接入液体培养基中。

步骤3、接种了菌株的液体培养基培养至活菌数量为10⁷cfu/ml～10⁹cfu/ml时，得到含有近玫色锁掷孢酵母的菌液。

步骤4、将含有近玫色锁掷孢酵母的菌液与35％的噻虫嗪悬浮剂按照20～50：50～80的质量比进行混合，得到微生物种衣剂。

进一步的，所述液体培养基为agps液体培养基，agps液体培养基的配方为：无水磷酸氢二钾700mg、无水磷酸二氢钾540mg、七水合硫酸镁1g、无水氯化铵500mg、脱水氯化钙200mg、七水合硫酸铁4mg、七水合硫酸锌100μg、四水合氯化锰30μg、无水硼酸300μg、六水合氯化钴200μg、脱水氯化铜10μg、六水合氯化镍20μg、脱水钼酸钠60μg、甘油10g、蛋白胨10g，补水至1l，高温灭菌，即得。

进一步的，所述近玫色锁掷孢酵母的培养条件为30℃，180rpm。

进一步的，所述近玫色锁掷孢酵母培养至活菌数量10⁸cfu/ml时，将菌液与35％的噻虫嗪悬浮剂按照30：70的质量比进行混合。

进一步的，将菌液与噻虫嗪悬浮剂用振荡仪振荡混匀，得微生物种衣剂。该微生物种衣剂中，活菌的数量大于10⁶cfu/ml，使得微生物种衣剂的效果更好。

进一步的，本发明微生物种衣剂的制备方法的一实施例中，所述菌液中含有近玫色锁掷孢酵母和甲基杆菌；

所述菌液的制备方法包括：挑取所述近玫色锁掷孢酵母的单菌落于液体培养基中培养，得近玫色锁掷孢酵母培养物；挑取所述甲基杆菌的单菌落于液体培养基中培养，得到甲基杆菌培养物；将所述甲基杆菌培养物与所述近玫色锁掷孢酵母培养物按照1～2：1～2的质量比进行混合，得到所述菌液；

将所述菌液与所述杀虫剂混合时，所述菌液中活菌数量达到10⁷cfu/ml～10⁹cfu/ml，所述菌液与所述杀虫剂按照20～50：50～80的质量比进行混合。

优选的，当所述甲基杆菌培养物和所述近玫色锁掷孢酵母培养物中的活菌数量均达到10⁸cfu/ml时，将甲基杆菌培养物和近玫色锁掷孢酵母培养物按照1:1的质量比进行混合，得到所述菌液，再将所述菌液与35％的噻虫嗪悬浮剂按照30：70的质量比进行混合，得到微生物种衣剂。

下面以具体实施例的形式结合小麦种子萌发实验来设置对照实验验证本发明微生物种衣剂在促进种子萌发和植株生长方面的技术效果，具体的实验设计参见表1。

所述种子萌发实验中设置的实验组包括：y304、m、y304+m、blank、ck、p+m、p。其中，ck表示未采用微生物种衣剂对小麦种子进行处理；blank表示采用35％噻虫嗪种衣剂对小麦种子进行处理；y304、m、y304+m、p+m、p均表示采用微生物种衣剂对小麦种子进行处理。

其中，y304处理组中的微生物种衣剂的制备方法为：

步骤1、先将近玫色锁掷孢酵母mn230304菌株于固体培养基中培养得到单克隆菌落；步骤2、挑一株单克隆菌落接入agps液体培养基中在30℃，180rpm条件下培养；步骤3、接种了菌株的液体培养基培养至活菌数量为10⁸cfu/ml时，得到近玫色锁掷孢酵母培养物；步骤4、将近玫色锁掷孢酵母培养物与35％的噻虫嗪悬浮剂按照30：70的质量比进行混合，得到微生物种衣剂。

m处理组中的微生物种衣剂的制备方法为：

步骤1、先将甲基杆菌bncc165774菌株于固体培养基中培养得到单克隆菌落；步骤2、挑一株单克隆菌落接入agps液体培养基中在30℃，180rpm条件下培养；步骤3、接种了菌株的液体培养基培养至活菌数量为10⁸cfu/ml时，得到甲基杆菌培养物；步骤4、将甲基杆菌培养物与35％的噻虫嗪悬浮剂按照30：70的质量比进行混合，得到微生物种衣剂。

p处理组中的微生物种衣剂的制备方法为：

步骤1、先将花溪掷孢酵母m207107菌株于固体培养基中培养得到单克隆菌落；步骤2、挑一株单克隆菌落接入agps液体培养基中在30℃，180rpm条件下培养；步骤3、接种了菌株的液体培养基培养至活菌数量为10⁸cfu/ml时，得到花溪掷孢酵母菌液；步骤4、将花溪掷孢酵母菌液与35％的噻虫嗪悬浮剂按照30：70的质量比进行混合，得到微生物种衣剂。

y304+m处理组中的微生物种衣剂的制备方法为：

步骤1、先将近玫色锁掷孢酵母mn230304菌株与甲基杆菌bncc165774菌株分别于固体培养基中培养得到单克隆菌落；步骤2、分别挑取近玫色锁掷孢酵母和甲基杆菌的单克隆菌落接入agps液体培养基中在30℃，180rpm条件下分别培养；步骤3、接种了菌株的液体培养基培养至活菌数量为10⁸cfu/ml时，分别得到近玫色锁掷孢酵母培养物和甲基杆菌培养物；步骤4、将所述近玫色锁掷孢酵母培养物和所述甲基杆菌培养物按照1：1的质量比混合，得到混合菌液；步骤5、将混合菌液与35％的噻虫嗪悬浮剂按照30：70的质量比进行混合，得到微生物种衣剂。

p+m处理组中的微生物种衣剂的制备方法为：

步骤1、先将花溪掷孢酵母m207107菌株与甲基杆菌bncc165774菌株分别于固体培养基中培养得到单克隆菌落；步骤2、分别挑取花溪掷孢酵母和甲基杆菌的单克隆菌落接入agps液体培养基中在30℃，180rpm条件下分别培养；步骤3、接种了菌株的液体培养基培养至活菌数量为10⁸cfu/ml时，分别得到花溪掷孢酵母菌液和甲基杆菌培养物；步骤4、将所述花溪掷孢酵母菌液和所述甲基杆菌培养物按照1：1的质量比混合，得到混合菌液；步骤5、将混合菌液与35％的噻虫嗪悬浮剂按照30：70的质量比进行混合，得到微生物种衣剂。

表1实验设计

2、小麦种子萌发及植株生长实验

将上述制备得到的不同处理组的微生物种衣剂用于处理小麦种子，观察小麦种子的萌发率以及小麦植株的生长情况。将上述各处理组的微生物种衣剂以1:50的药种比与小麦种子进行混匀，晾干。晾干后将小麦种子进行纸卷法(标准参见gb/t3543.4)观察种子发芽力与种子活力，以安科38号发芽纸进行纸卷，每个处理组处理100颗小麦种子，小麦种子发芽率统计见表2，根据表2的统计数据统计得到小麦种子发芽率的折线图，如图3所示。

表2小麦种子发芽率

根据纸卷法观察种子萌发率实验可知，近玫色锁掷孢酵母mn230304菌株和甲基杆菌bncc165774菌株制备得到的微生物种衣剂，即处理组y304+m处理后的小麦种子相对于其它处理组的微生物种衣剂处理后的小麦种子的发芽率都要高，证明近玫色锁掷孢酵母和甲基杆菌混合制备微生物种衣剂比单独使用甲基杆菌制备微生物种衣剂的效果更好，同时也比近玫色锁掷孢酵母同属的花溪掷孢酵母的效果更好。

将发芽的小麦种子种入盆栽中观察小麦苗期长势。盆栽种植小麦使用的土壤为碳土与珍珠岩按照2：1的质量比混合而成，灭菌后使用。将灭菌后的土壤装于直径为10cm的小塑料盆中，每盆种三颗小麦种子，每个处理组共30株麦苗，温室实验重复三次，采用随机区组排列，在小麦苗期第7天测定植株的平均根长、平均芽长以及平均根数，测定统计结果见表3，依据统计结果绘制小麦苗期第7天植株生理指标的柱形图，如图4所示；测定小麦苗期第14天测定植株的平均根长、平均株高和平均鲜重，测定统计结果见表4，依据统计结果绘制小麦苗期第14天植株生理指标的柱形图，如图5-图6所示。

表3小麦苗期7天植株生理指标

表4小麦苗期14天植株生理指标

根据观察小麦不同苗期的生理指标结果可知，近玫色锁掷孢酵母mn230304菌株和甲基杆菌bncc165774菌株制备得到的微生物种衣剂，即处理组y304+m处理后的小麦种子生长的小麦苗，相对于其它处理组的微生物种衣剂处理后的小麦种子生长的小麦苗，在7天苗期的时候各项生理指标都要高，在14天苗期的时候，平均株高和平均鲜重也明显高于其它处理组，证明近玫色锁掷孢酵母和甲基杆菌混合制备微生物种衣剂比单独使用甲基杆菌制备微生物种衣剂对促进小麦植株的生长效果更好，同时也比近玫色锁掷孢酵母同属的花溪掷孢酵母制备的微生物种衣剂对促进小麦植株的生长效果更好。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，对前述各实施例所记载的技术方案的部分或者全部技术特征进行等同替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

序列表

<110>慕恩（广州）生物科技有限公司

<120>一株近玫色锁掷孢酵母及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>569

<212>dna

<213>近玫色锁掷孢酵母(sporidioboluspararoseus)

<400>1

agagatcattattgaaaacaagggtgtccaatttaacttggaacccaaacttctcaattc60

taactttgtgcatctgtattaatggcgagcaacttcggttgtgagccttcacttacaaaa120

cactagtctatgaatgtaaaatttttataacaaataaaaactttcaacaacggatctctt180

ggctctcgcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgatacgtaatgtgaattgcagaattc240

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