一种近红外光调控基因编辑方法与流程

本发明属于生物技术领域，公开了一种近红外光调控基因编辑的方法。

背景技术：

簇状规则间隔短回文重复序列（crispr）相关蛋白9（cas9）技术是当前最为热门的一种基因编辑工具，它依靠一段rna（sgrna）进行位点识别，通过非同源末端连接（nhej）或同源定向修复（hdr）纠正基因突变。然而，crispr/cas9系统由于同时需要传递两个大分子：cas9蛋白（约160kd）和sgrna（超过100bp），因此它的递送一直是个问题，特别是在时空上精确地控制crispr/cas9系统的递送方面上。近几十年来，基于刺激响应纳米材料设计的按需传递体系在纳米医药中得到了广泛的关注。在各种各样的控制策略中，光调控已被证明是一种理想的无创方式。通过光，生物活性分子的释放可以很容易地被监测到，且具有很高的时空精度。到目前为止，已经开发出几种光敏分子，如偶氮苯衍生物、螺吡喃衍生物和带邻硝酸苄基基团的光敏分子。这些分子在能在高能量的紫外光下发生光异构化或酯键断裂。然而，紫外线生物体穿透能力比较差且长时间照射易引起癌变。因此，利用红外光调控基因编辑尤具前景。

技术实现要素：

为了红外光调控基因编辑的目的，本发明将cas9体系利用4-羟甲基-3-硝基苯甲酸共价连接在上转换纳米粒子（ucnps）上。由于上转换纳米粒子可以在红外光激发下发出紫外光，使得4-羟甲基-3-硝基苯甲酸和纳米粒子表面形成的酯键断裂，从而释放出cas9体系，使其（即cas9/sgrna）进入细胞核，实现活细胞基因编辑。

为了实现上述发明目的，本发明涉及的近红外光调控基因编辑的方案如下：一种可用于红外光基因编辑的ucnps-cas9@pei复合体，该复合体的制备过程为：将纳米粒子ucnps@sio2表面进行羧酸化，然后借助光敏分子将crispr/cas9体系和纳米粒子ucnps@sio2共价连接得到ucnps-cas9复合体，其中crispr/cas9体系包括cas9蛋白和目标基因的sgrna，并在静电吸附的作用下，在ucnps-cas9复合体最外层包裹上带正电的pei，得到ucnps-cas9@pei复合体；当把ucnps-cas9@pei复合体递送进细胞或者小鼠，可在红外光调控下实现基因编辑。

所述的ucnps@sio2是包裹了一层二氧化硅的上转换纳米粒子，其中上转换纳米粒子为nayf4:yb/tm。

所述的羧酸化过程采用的分子为n-三甲氧基硅丙基乙二胺三乙酸三钠盐（cas#:128850-89-5），羧酸化反应时n-三甲氧基硅丙基乙二胺三乙酸三钠盐的浓度6μg/ml。

所述的光敏分子为4-羟甲基-3-硝基苯甲酸（分子量：181.15，cas#：3113-71-1），光敏反应时4-羟甲基-3-硝基苯甲酸浓度为10μg/ml。

所述的cas9蛋白和sgrna质量比为1:2。所述的pei中文名称为聚乙烯亚胺（分子量：10000），与加入的sgrna质量比为5:1。

所述的ucnps-cas9@pei复合体中的ucnps@sio2终浓度为3.5mg/ml，cas9蛋白终浓度0.36μg/ml，sgrna终浓度0.72μg/ml。

所述的红外光调控过程中，采用的红外光波长980nm，光照时长20min。

本发明还提供一种近红外光调控基因编辑方法，包括如下步骤：

将前述的ucnps-cas9@pei复合体，在980nm红外光照射下实现对目标基因的编辑。所述的目标基因包括egfp、plk-1基因，细胞为a549肺癌细胞，小鼠为balb/c裸鼠。

本发明用4-羟甲基-3-硝基苯甲酸（ona）将包裹了二氧化硅的上转换纳米粒子和crispr/cas9系统共价连接，为了提高内吞效果，在该纳米粒子（即ucnps-cas9复合体）表面包裹一层聚醚酰亚胺（polyetherimide，pei）。将该复合纳米粒子（ucnps-cas9@pei）与细胞共孵育，在红外光调控下实现细胞基因调控(图1)。此外，我们还将该体系应用到活体治疗中。其具体反应步骤如下：

(1)ucnps-cas9@pei的制备

首先，在ucnps@sio2中加入20μln-三甲氧基硅丙基乙二胺三乙酸三钠盐反应4.5小时后，由于纳米粒子表面的羧酸化，因此电位由-28.3mv降至-41.5mv（图2）。然后是ona和羧酸化纳米粒子通过酯化反应的连接，其中溶剂使用的是干燥四氢呋喃，催化剂为二环己基碳二亚胺和4-二甲基氨基吡啶。12小时后，用四氢呋喃洗涤3次，继续加入二环己基碳二亚胺进一步活化羧基。随后收集粒子并转移到水相中，由于表面ona的连接，电位再次发生变化，变为-12.7mv。同时，在cas9蛋白溶液中以1:2的质量比加入sgrna，溶液从正电（+20.0mv）变为负电（-22.2mv），说明了crispr/cas9体系的形成（图2）。然后，将crispr/cas9系统与羧酸化纳米粒子-ona混合，4^oc孵育过夜。离心后，为了提高内吞效果，用带正电的pei包裹ucnps-cas9，室温平衡5分钟后，测得电位由-36.1mv转变为15.0mv。

(2)红外光控crispr/cas9的释放

为了验证系统的近红外响应，可将ucnps-cas9溶液暴露在近红外激光(980nm)下，在不同时刻离心取上清，测280nm(常见的蛋白吸收峰)处的吸收峰强度，结果如图3a所示，随着时间的增加，吸收峰增强，这意味着蛋白从粒子上脱落。此外，为了验证上转换纳米粒子把红外光转化出紫外光的作用，可将ucnps-cas9溶液暴露在紫外光下，在不同时刻离心取上清，测280nm(常见的蛋白吸收峰)处的吸收峰强度，得到类似的结果如图3b。

(3)ucnps-cas9@pei的细胞毒性

纳米粒子ucnps-cas9@pei的毒性可以通过将其分别与肺癌细胞（a549)共同孵育后，利用cellcountingkit-8(cck-8)检测法检测不同条件下细胞的活性，结果见图4。从实验结果中确定之后细胞所用纳米粒子浓度，红外光强度和光照时长。在这个实验中sgrna靶向的位点是非致死性基因egfp，其靶向序列为：

5’-gggcgaggagctgttcaccg-3’（seqidno.1）。

(4)细胞中的红外光控基因编辑

plk-1基因是一种与癌细胞增殖相关的基因，对该基因的敲除可以抑制癌细胞的生长。为了验证ucnps-cas9@pei的红外光控基因编辑效果，可将ucnps-cas9@pei与细胞孵育，48小时后提取细胞裂解液，通过t7核酸内切酶i对基因突变率进行检测，（图5a）和westernblot（图5b）对靶点蛋白进行了分析，确认了红外光控基因编辑的可行性。从流式对细胞死活的分析，可直观地证实红外光在此体系中对细胞凋亡作用（图5c）。在步骤（4）和步骤（5）中，sgrna靶向的位点为plk-1基因，其靶向序列为：

5’-tacctacggcaaattgtgct-3’（seqidno.2）。

(5)红外光控基因编辑对于小鼠肿瘤的治疗效果

给小鼠殖瘤（a549细胞），待瘤大小达到80mm³后，将其随机分为5组，每组5只，并分别用pbs+nir、ucnps@pei+nir,ucnps@pei+freecas9+nir,ucnps-cas9@pei（无nir）和ucnps-cas9@pei+nir进行处理，给药监测20天。在此期间，记录肿瘤体积。最后在第20天时对动物实施安乐死。其结果如图6所示。

相对于现有技术，本发明有益效果为：（1）本发明利用光这种无创的外部手段，可实现对目标位置进行基因编辑，提高基因编辑的靶向性；（2）由于红外光的组织穿透性比紫外强，因此本项发明可以很好的运用于生物活体中。

附图说明

图1是所述方法的反应原理图；（a）是复合纳米粒子ucnps-cas9@pei的制备方法；(b)为nir触发的cas9-sgrna进核递送过程：(i)与细胞膜结合,(ii)内吞,(iii)内涵体逃逸，(iv)从纳米粒子上脱落进入细胞核，(v)寻找目标dna位点并实现双链切割；

图2是纳米粒子修饰各个过程的电位；图中电位从左到右依次是cas9蛋白、cas9/sgrna,ucnps@sio2、ucnps@sio2-cooh、ucnps@sio2-ona、ucnps-cas9和ucnps-cas9@pei；

图3是ucnps-cas9的上清液在280nm的紫外吸收随时间变化图，图3a是在红外光照射下，图3b是在紫外光下；

图4是cck-8检测法测得的在不同条件下细胞的活性，图4a是考察的是不同功率下980nm激光对细胞活性的影响，图4b不同纳米粒子的浓度对细胞活性的影响，图4c不同光照时长的影响；

图5是细胞层面红外光控基因敲除的验证，图5a是t7核酸内切酶i对基因突变率的检测，图5b是westernblot对不同条件处理后，测得的plk-1蛋白的含量（a549细胞），图5c不同条件下的采用流式测得的细胞存活率；i:pbs+nir,ii:crispr/cas9@pei+nir,iii:ucnps+nir,iv:ucnps-cas9@pei,v:ucnps-cas9@pei+nir.

图6是经各种制剂处理后的肿瘤生长曲线。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例和附图进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施方式。其中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1

本实施例提供ucnps-cas9@pei的制备方法：

将ucnps@sio2（100mg）用20μln-三甲氧基硅丙基乙二胺三乙酸三钠盐进行羧酸化，反应4.5h。然后将羧酸化纳米粒子转移到10ml（含100μgona）干燥四氢呋喃中用二环己基碳二亚胺和4-二甲基氨基吡啶作为催化剂进行酯化反应。12小时后，用四氢呋喃洗涤3次，然后将20μg二环己基碳二亚胺溶解在四氢呋喃中，进一步活化羧基。8小时后，收集粒子并转移到pbs中。同时，将cas9蛋白和sgrna（1:2）在pbs中混合5分钟，形成crispr/cas9体系。然后，将crispr/cas9系统与羧酸化纳米粒子-ona（即前述的羧酸化纳米粒子与ona的连接产物）混合，并在4^oc孵育过夜。离心后，以5:1重量比（pei:sgrna）将pei包裹在ucnps-cas9上，并在室温下进一步平衡5分钟后，即可用于细胞研究。这一过程的表面修饰可以利用电位得以验证（图2）。

实施例2

本实施例验证了系统的近红外响应，方法如下：

利用准直器，将980nm近红外激光器的光强固定在2w/cm²。将ucnps-cas9溶液至于该光强下，每隔5min离心取得上清液，测280nm(常见的蛋白吸收峰)处的紫外吸收峰，结果如图3a所示，随着时间的增加，吸收峰增强，这意味着蛋白从粒子上脱落。此外，为了验证是上转换纳米粒子将红外光转化出紫外光的作用，可将ucnps-cas9溶液暴露在紫外光下，每隔2.5min离心取得上清液测280nm吸收峰，得到类似的结果如图3b。

实施例3

测试实施例1的纳米复合物（sgrna靶向egfp基因，其靶向序列为：

5’-gggcgaggagctgttcaccg-3’（seqidno.1））的细胞毒性，方法如下：

选择肺癌细胞（a549)，分别在不同强度的红外光下照射10分钟，从cck-8检测法得到的结果来看，0.5~2.5w/cm²的红外光并不会对细胞活性有太大的影响（图4a）。随后，在2.0w/cm²的红外光强下，选取不同ucnps-cas9@pei复合体浓度与细胞孵育，发现纳米粒子对细胞的毒性随着浓度增大而增大（图4b）。最后，考察不同光照时长对于细胞活性的影响，为了减少ucnps-cas9@pei复合体本身和红外光条件对于细胞的毒性影响，之后的细胞实验中，均采用2.0w/cm²的红外光照射20分钟，且ucnps-cas9@pei复合体浓度均控制在50ppm。

实施例4

本实施例提供体外进行红外光控基因编辑的具体步骤：按照实施例1制备出靶向到plk-1基因（其靶向序列为seqidno.2）的纳米复合物，选取实施例3中确定的低毒性条件，与细胞孵育48小时。通过流式直观对细胞凋亡进行统计分析分析，结果如图5c，ucnps-cas9@pei+nir实验组晚凋率达到50%，远高于其他组。随后，为了验证细胞凋亡与靶点基因敲除相关，可提取细胞裂解液，通过t7核酸内切酶i检测基因突变率，验证红外光调控下目标基因的敲除，图5b印证了在实验组v:ucnps-cas9@pei+nir中，plk-1基因被大量敲除。此外，通过westernblot的实验对靶点蛋白进行了分析，也得到了相似的结果（图5a），这进一步分析了红外光控基因编辑的可行性。本实施例中为了防止由于980nm激光引起培养基过热的问题，应每隔30秒让细胞冷却一下，再继续让激光照射。

实施例5

本实施例动物实验均是在南京大学实验动物使用和管理委员会指导下进行的。本实施例验证了红外光控基因编辑（靶向plk-1基因）在小鼠活体上的效果，具体实验步骤：

将荷瘤小鼠（a549，肿瘤大小约80mm³）随机分为5组，每组5只，分别用pbs+nir、ucnps@pei+nir,ucnps@pei+freecas9+nir,ucnps-cas9@pei（无nir）和ucnps-cas9@pei+nir处理，每隔3天通过肿瘤内注射一次试剂，药物剂量100μl，浓度为3.5mg/ml。实验组中的980nm脉冲激光强度采用2.0w/cm²，每次照射25分钟。给药监测20天，在此期间，记录肿瘤体积以供分析，然后在第20天对动物实施安乐死。结果如图6，只有ucnps@pei+nir实验组中小鼠中肿瘤体积得到控制，其他组小鼠中肿瘤体积均不断增大。这意味着，经过本发明近红外光调控基因编辑的方法处理（ucnps@pei+nir），可以有效控制肿瘤的生长，证明成功完成了基因编辑（目的基因敲除）。

上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>南京大学

<120>一种近红外光调控基因编辑方法

<130>xhx2019040101

<141>2019-04-01

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gggcgaggagctgttcaccg20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

tacctacggcaaattgtgct20