鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量检测方法与流程

本发明涉及一种鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量pcr检测方法，属于鱼类病毒检测技术领域。

背景技术：

鲤和锦鲤是我国具有重要市场价值的品种，随着养殖规模的不断扩大，鱼类疫病也频繁出现。其中，鲤浮肿病毒(carpedemavirus，cev)和锦鲤疱疹病毒(kioherpesvirus，khv)都可以感染鲤和锦鲤，对水产养殖产业造成严重危害。cev是一种线性双链dna，属于痘病毒，大小约为200nm×400nm。khv也为双链dna，属疱疹病毒，是直径167～200nm的二十面体，有囊膜。以上两种病毒均只感染鲤和锦鲤，且引起的临床症状极其相似，包括烂鳃、眼球凹陷、食欲不振、体表出血等，死亡率高达80％～100％。因此，在养殖生产中，当鲤或锦鲤出现凹眼、烂鳃等症状，并有高死亡率时，现场依靠发病症状和流行特点很难区分这两种病毒病，需进一步进行实验室检测。

分子生物学方法是实验室最常用的检测cev和khv的方法。现有技术中通常采用由英国cefas建立、matras等公布的单重荧光定量pcr法检测cev，采用sc/t7212.1-2011行业标准检测khv，由于cevd和khvd临床症状极其相似，往往需要针对同一样品分别检测cev和khv这两种病原，耗时较长。实时荧光定量pcr具有灵敏度高、特异性强和重复性好等优点,已逐渐成为动物病原检测的重要方法。目前，尚未见应用双重实时荧光定量pcr技术同时检测cev和khv的相关报道。

cev和khv已经成为危害国内外鲤和锦鲤养殖产业的重要病原。鲤和锦鲤养殖具有重要的经济价值和市场价值，目前，对cevd和khvd并没有有效的治疗措施，尽快确诊病原，尽早切断传播途径对降低经济损失有重要作用。

目前，诊断cev主要依靠分子生物学检测方法，还没有筛选到能够稳定易感cev的敏感细胞系。oyamatsu等和英国cefas建立的套式pcr都存在漏检现象。英国cefas建立的实时荧光定量pcr是目前最适用于检测cev的方法，更适用于cev的常规监测。针对khv的敏感细胞系已有大量报道，例如锦鲤鳍细胞(koifincells，kfc)、鲤鱼脑细胞(commoncarpbraincells，ccb)、锦鲤鳃细胞系(thegillofkoi，kog)等，但通常需要传代3～5次，分离培养时间较长，且首次分离成功的很少，故普通pcr检测方法依然是诊断khv首选，但相对于实时荧光定量pcr法来说，耗时较长，检测操作步骤较多。单重实时荧光定量pcr方法对cev和khv的检测已得到较广泛的应用。

技术实现要素：

本发明为了解决上述问题，提供一种新型的鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量pcr检测方法，该方法能够同时检测cev和khv，提高了检测效率，在样品量非常大时具有很大优势。

本发明所述的鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量pcr检测方法包括以下步骤：

第一、合成引物与taqman探针：

根据cevp4a基因序列，对引物序列进行优化，上游引物第1个碱基改为简并碱基w，下游引物第1个碱基改为简并碱基r；根据khvorf7基因保守序列，设计1对特异性引物和1条taqman探针；分别使用fam和vic作为探针报告基团，bhq1作为探针淬灭基团；

第二、确定反应体系及条件：

采用20μl反应体系，2×probepcrmastermix10μl，上、下游引物和探针引物终浓度在0.2μmol/l～0.8μmol/l之间，qnrox参考染料0.1μl，模板2.5μl，depc水补足20μl；反应程序为：95℃预变性2min，1个循环；95℃5s，50～60℃退火31s，40个循环。

优选地，反应体系确定为：2×probepcrmastermix10μl，cev上、下游引物终浓度0.6μmol/l，探针终浓度0.3μmol/l，khv上、下游引物终浓度0.4μmol/l，探针终浓度0.2μmol/l，qnrox参考染料0.1μl；模板2.5μl，depc水补足20μl；反应程序为：95℃预变性2min，1个循环；95℃5s，56℃退火31s，40个循环。

在一个实施例中，根据cevp4a基因序列对引物序列进行优化后的cev-r序列为rattcctcaaggagttdcagtaaa。

在一个实施例中，根据cevp4a基因序列对引物序列进行优化后的cev-f序列为wgttttgtakattgtagcatttcc。

在一个实施例中，探针cev-probe序列为fam-agagtttgtttcttgccatacaaact-bhq1。

在一个实施例中，根据khvorf7基因保守序列设计的引物khv-r序列为cacggatcttctatgctaca。

在一个实施例中，根据khvorf7基因保守序列设计的引物khv-f序列为ttgttgtgcgttgatgttc。

在一个实施例中，根据khvorf7基因保守序列设计的探针khv-probe序列vic-cttgacggcactcgtcgagccgtagccc-bhq1。

本发明所述的鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量pcr检测方法对cev和khv的灵敏度为15copies/μl。

本发明所述的鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量pcr检测方法与单重实时荧光定量pcr扩增所获得的ct值的变异系数小于3％。

与现有技术相比，本发明所述的鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量pcr检测方法的有益效果在于：灵敏度高、特异性好，与其他病毒无交叉反应；临床试验结果表明，该方法的结果与实验室常规检测结果一致，针对混合感染样品可特异的检出感染病原，适用于实验室对cev和khv的常规检测，可为cevd和khvd两种常见鱼类疫病的快速诊断提供必要的技术支撑。

附图说明

图1a是cev的敏感性曲线。

图1b是cev的标准曲线。

图2a是khv的敏感性曲线。

图2b是khv的标准曲线。

图3是特异性试验曲线。

图4是real-timepcr组内重复性试验获得的目标扩增曲线。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明所述的鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量pcr检测方法包括以下步骤：

第一、合成引物与taqman探针：根据matras等公布的cevp4a基因序列，对引物序列进行优化，上游引物第1个碱基改为简并碱基w，下游引物第1个碱基改为简并碱基r；根据genbank中khvorf7基因保守序列，应用primer6.0软件设计1对特异性引物和1条taqman探针；分别使用fam和vic作为探针报告基团，bhq1作为探针淬灭基团(见表1)。引物序列由北京六合华大基因科技有限公司合成。

表一引物和taqman探针序列

第二、确定反应体系及条件：

采用20μl反应体系，2×probepcrmastermix10μl，上、下游引物和探针引物终浓度在0.2μmol/l～0.8μmol/l之间，qnrox参考染料0.1μl，模板2.5μl，depc水补足20μl；反应程序为：95℃预变性2min，1个循环；95℃5s，50～60℃退火31s，40个循环。

为了确定最佳引物浓度配比和反应程序，本申请采用多种毒株，进行了大量的特异性试验、重复性试验、干扰性试验，并采用本申请建立的双重实时荧光定量pcr方法，检测本实验室鉴定保存的13份cev阳性样品、7份khv阳性样品，评价该方法的可靠性。

本申请采用的毒株包括鲤浮肿病毒(carpedemavirus，cev)、锦鲤疱疹病毒(kioherpesvirus，khv)、金鱼造血器官坏死病毒(goldfishhaematopoieticnecrosisvirus，gfhnv)、流行性造血器官坏死病毒(epizootichaematopoieticnecrosis，ehnv)、蛙虹彩病毒(bohleiridovirus，biv)、斑点叉尾鮰病毒(channelcatfishvirus，ccv)，由北京市水产技术推广站鉴定保存，白斑综合征病毒(whitespotsyndromevirus，wssv)、虾肝肠胞虫(enterocytozoonhepatopenaei，ehp)标准品购自中国水产科学研究院黄海水产研究所。

本申请采用的dna抽提试剂盒、荧光quantinovatmprobepcrkit试剂盒均购自qiagen公司；dna扩增试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；ab7500荧光定量pcr仪购自lifetechnologies公司。

制备标准品：

参照dna抽提试剂盒说明书，提取鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒的dna，送至北京天成新脉生物技术有限公司，合成cevp4a基因序列(528bp)和khvorf7基因序列(484bp)，分别克隆到peasy-t1载体和puc57-kan载体上，构建cev-p4a和khv-orf7标准质粒，根据质粒浓度计算拷贝数。

双重实时荧光定量pcr反应条件及引物浓度优化：

浓度为1.5×10⁷copies/μl的质粒cev-p4a和khv-orf7混合液作为标准品，采用20μl反应体系，2×probepcrmastermix10μl，应用矩阵法对引物浓度进行最佳配比和筛选，将上、下游引物和探针引物终浓度在0.2μmol/l～0.8μmol/l之间调整，qnrox参考染料0.1μl，模板2.5μl，depc水补足20μl。反应程序为：95℃预变性2min，1个循环；95℃5s，50～60℃退火31s，40个循环。根据荧光pcr结果曲线和ct值确定最佳引物浓度配比和反应程序。

敏感性试验与标准曲线的建立：

对质粒cev-p4a和khv-orf7进行10倍系列稀释，将相同稀释倍数的质粒充分混合作为模板，按照已优化好的双重实时荧光定量pcr反应条件进行扩增，建立标准曲线。

特异性试验：

分别以3.0×10⁵copies/μl的质粒cev-p4a或khv-orf7作为模板，同时加入cev和khv的引物和探针，按照优化好的反应条件进行二重单检的实时荧光pcr扩增，每个样品孔同时收集fam和vic两种荧光信号，确定该方法的引物与探针在cev和khv之间的特异性。采用本申请建立的方法，对gfhnv、ehnv、ccv等dna病毒进行特异性验证。

重复性试验：

将浓度为3.0×10⁵copies/μl的cev-p4a和khv-orf7质粒等体积混合，获得1.5×10⁵copies/μl的质粒混合液作为模板，分为5个标本同时检测。在第4天、第7天重复检测保存于-20℃的模板，通过计算ct值的标准差(s)和变异系数(cv)验证本申请的方法的批内重复性和批间重复性。

干扰性试验：

将质粒cev-p4a和khv-orf7按不同浓度进行组合(3.0×10⁷和3.0×10¹；3.0×10¹和3.0×10⁷)，分别进行单重和双重荧光定量pcr检测，确定当模板浓度相差较大时cev和khv之间的检测是否存在干扰现象。

临床样品检测应用：

采用本申请建立的双重实时荧光定量pcr方法，检测本实验室鉴定保存的13份cev阳性样品、7份khv阳性样品，评价该方法的可靠性。

反应体系及条件的优化：

通过对引物及探针浓度的筛选及退火温度的优化，最佳反应体系确定为：2×probepcrmastermix10μl，cev上、下游引物终浓度0.6μmol/l，探针终浓度0.3μmol/l，khv上、下游引物终浓度0.4μmol/l，探针终浓度0.2μmol/l，qnrox参考染料0.1μl.模板2.5μl，depc水补足20μl。反应程序为：95℃预变性2min，1个循环；95℃5s，56℃退火31s，40个循环。

敏感性试验结果及标准曲线的建立：

以10倍系列稀释的cev-p4a或khv-orf7质粒混合液(1.5×10⁷～1.5×10¹copies/μl)作为模板，进行双重实时荧光定量pcr扩增，结果见图1a、图1b、图2a和图2b。图1a和图2a中附图标记1-7表示1.5×10⁷拷贝/μl～1.5×10¹拷贝/μl，附图标记8表示空白对照。

图1至图4中，阈值：荧光扩增曲线上仪器自动设定或人为设定的一个值，一般是pcr扩增的3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，在pcr扩增的指数期。

ct值：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。

rn:是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光发射强度的比值；

△rn：是rn扣除基线后得到的相对荧光值(△rn＝rn-基线)；

基线：在pcr扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线就是基线。

本申请的方法最低能检测到的cev浓度为1.5×10¹copies/μl，以质粒拷贝数的lg值为横坐标，ct为纵坐标建立标准曲线，回归方程为：y＝-3.4551x+38.76；该方法最低能检测到的khv浓度为1.5×10¹copies/μl，以质粒拷贝数的lg值为横坐标，ct为纵坐标建立标准曲线，回归方程为：y＝-3.5287x+39.099。结果表明本申请建立的方法对cev和khv的灵敏度为15copies/μl。

特异性实验结果：

当反应体系中只加入cev或khv基因组dna作为模板，采用本申请建立的方法进行pcr扩增时，结果只得到相应模板的特异性荧光曲线，表明引物及探针在这两种病毒间具有特异性。对gfhnv、ehnv、ccv等阳性核酸的扩增结果显示，这几种dna病毒、阴性对照以及空白对照均不能产生扩增曲线，呈现阴性结果，见图3，表明本申请建立的双重实时荧光定量pcr法具有良好的特异性。图3中，1为鲤浮肿病毒；2为锦鲤疱疹病毒；3为金鱼造血器官坏死病毒；4为流行性造血器官坏死病毒；5为蛙虹彩病毒；6为斑点叉尾鮰病毒；7为白斑综合征病毒；8为虾肝肠胞虫；9为空白对照。

重复性试验结果：

以1.5×10⁵copies/μl的质粒混合液作为模板，进行批内重复性试验，结果5个平行样品均获得目标扩增曲线，见图4。图4中1～5为1.5×10⁵拷贝/μlcev；6～10为1.5×10⁵拷贝/μlkhv；11为空白对照。cev的sd为0.10，cv为0.49﹪；khv的sd为0.13，cv为0.66﹪，见表2。第4、7天后进行批间重复性试验，cev的sd为0.10，cv为0.52％；khv的sd为0.13，cv为0.67％，见表3。结果表明，本申请建立的双重实时荧光定量pcr法具有良好的重复性。

表2组内重复性试验

表3组间重复性试验

干扰性试验结果：

将质粒cev-p4a和khv-orf7按不同浓度进行组合进行荧光定量pcr检测，发现当两种模板浓度相差很大时，本申请的方法依然能够检出低浓度模板，且与单重实时荧光定量pcr扩增所获得的ct值的变异系数小于3％，见表4。

表4干扰性试验结果

临床样品应用检测结果：

采用本申请建立的cev和khv双重实时荧光定量pcr法，对经单重pcr检测阳性的13份cev样品和采用sc/t7212.1-2011行业标准检测阳性的7份khv样品进行扩增，结果13份cev阳性样品在fam荧光通道均有特异的荧光曲线和ct值，在vic荧光通道无扩增曲线和ct值，且病毒浓度为1.05×10²—7.09×10⁴copies/μl。7份khv阳性样品在vic荧光通道均有特异性的荧光曲线和ct值，病毒浓度为3.91×10²—3.02×10⁵copies/μl，在fam荧光通道6份样品无扩增曲线和ct值；1份样品有特异的荧光曲线和ct值，且病毒浓度为5.6×10⁴copies/μl。

本申请根据matras等公布的cevp4a基因序列，对引物序列进行优化，合成1对特异性引物和1条taqman探针；根据khvorf7基因保守序列，设计筛选1对特异性引物和1条taqman探针。引物序列间无相互干扰，通过矩阵法筛选出了cev和khv的最佳引物和探针浓度组合，优化反应条件，成功建立双重实时荧光定量pcr方法，大大缩短了检测时间，全程约需1.5h，与用单重荧光定量pcr分别检测两种病毒相比，减少1.5h，与普通pcr相比则减少约4h；本申请的方法具有较高的敏感性，可检测到15copies/μl的cev或khv；具有良好的特异性，不与其它病毒发生交叉反应；由于扩增产物不需电泳，则有效避免普通pcr方法可能产生的气溶胶污染风险。

临床样品检测结果表明，有1份khv阳性样品也为cev阳性。经查，该样品为2015年由本实验室采集，由于实验室是2016年后开始开展大量cev相关研究，并未对2016年之前的样品进行cev复检，因此针对该样品只进行了khv鉴定。采用单重实时荧光定量pcr对该样品进行扩增，有明显扩增曲线和ct值，为cev阳性，表明本申请建立的双重实时荧光定量pcr方法检测结果与实验室常规方法结果一致。通过对临床样品的检测证明cev和khv在临床上确实有混合感染的情况发生。在同一样品中两种病原的含量可能相差较大，本申请通过干扰性试验，探讨当模板浓度相差较大时，高浓度模板对低浓度模板是否存在干扰现象。结果表明，当两种模板浓度相差很大时，本申请的方法依然能够检出低浓度模板，且与单重实时荧光定量pcr扩增所获得的ct值的变异系数小于3％。

综上，本申请建立的双重实时荧光定量pcr检测方法灵敏度高、特异性好，与其他病毒无交叉反应；临床试验结果表明，该方法的结果与实验室常规检测结果一致，针对混合感染样品可特异的检出感染病原，适用于实验室对cev和khv的常规检测，可为cevd和khvd两种常见鱼类疫病的快速诊断提供必要的技术支撑。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。