一种与玉米籽粒大小相关的分子标记及其应用的制作方法

本发明属于玉米育种和分子生物学领域，尤其涉及一种与玉米籽粒大小相关的分子标记及其应用。

背景技术：

玉米作为粮食、动物饲料和工业材料的来源，在世界各地广泛种植，目前已成为世界第一大粮食作物。随着人口的快速增长、耕地减少和粮食短缺的出现，高产仍将是玉米育种的主要目标。玉米产量主要由玉米每公顷穗数、每穗粒数和每粒平均重量三部分决定。而粒重是由许多基因控制的数量遗传性状，影响较小，主要由粒长、粒宽和粒厚决定，人们对籽粒大小和籽粒重量的遗传基础进行了大量的研究。

粒重作为重要的农学性状和产量组分可用于促进玉米产量，并且近年来在分子遗传学中越来越具有吸引力。分子标记的应用在图位克隆技术中是必不可少的，它能帮助人们对目的基因进行定位。分子标记的种类有很多，如简单序列重复(simplesequencerepeat，ssr)、单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms,snp)、随机扩增多态性dna(randomamplifiedpolymorphicdna，rapd)、dna扩增指纹(dnaamplifiedfingerprints,daf)等。maizegdb网站(http://www.maizegdb.org/)公布了大量的ssr标记，分布在每条染色体的每个区段。即使这样，在图位克隆后期为了精确定位出候选基因，可能还需要开发新的分子标记。考虑到ssr标记原理简单、操作方便，可优先开发。由于b73全基因组序列均已知，可用其作为参考序列，再利用软件ssrhunter搜索区间内的ssr位点，并根据输出结果设计新的引物，从中检测存在多态性的分子标记用于基因定位。若当前定位区间较小，且没有可用的ssr标记，则需考虑开发snp标记，在当前的定位区间内设计引物分别用两种自交系的dna扩增1-2kb的片段，并将两者测序结果进行对比，从中寻找snp位点设计扩增引物。但目前无关于玉米籽粒大小相关的snp分子标记的报导。

技术实现要素：

针对缺乏关于玉米籽粒大小相关的snp分子标记的研究，本发明提供了一种与玉米籽粒大小相关的分子标记。

本发明的另一目的是提供与玉米籽粒大小相关的snp分子标记的应用。

本发明人于2014年在北京顺义种植基地，发现了一个籽粒大小符合3:1分离的自然突变体，经过几代自交鉴定，发现该突变体的表型能够稳定遗传，将其命名为skm。

为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：

一种与玉米籽粒大小相关的分子标记，所述分子标记为玉米skm基因上如seqno：1所示的dna序列，所述dna序列第165bp处存在一个snp位点，此处碱基为g或c，此处碱基为g的对应大籽粒玉米，此处碱基为c的对应小籽粒玉米。

一种上述的分子标记的特异性引物，正向引物的序列如seqno：2所示，反向引物序列如seqno：3所示。

seqno：2：caagtacgtgacggcgaac；

seqno：3：ttcttcgcgacctctttctc；

一种鉴定玉米籽粒基因型的方法，采用以下步骤：

(1)提取待测玉米的基因组dna；

(2)以待测玉米的基因组dna为模板，利用权利要求2的引物，进行pcr扩增反应；

(3)检测扩增产物。

优选地，步骤(2)中利用权利要求2的引物进行pcr扩增，扩增的体系和程序分别为：

所述pcr的反应体系为：10μl

pcr的反应程序为：

一种权利要求1所述的鉴别玉米籽粒基因型相关的分子标记在玉米分子标记辅助育种中的应用。

有益效果

(1)本发明采用正向遗传学方法，准确无误的分离候选基因；

(2)skm基因的功能在植物中没有任何报导，本发明提供了调控玉米籽粒大小的基因skm核苷酸序列，该基因对于解析玉米籽粒大小形成的分子机理等理论研究具有重要的价值。

(3)本发明可鉴别成熟f3果穗的纯合、杂合情况，完全排除人为、生长不足因素的影响，使结果更加准确可靠。可用于大规模筛选育种材料，使得基因定位工作更加准确，大大加快玉米育种研究的进程。

附图说明

图1左为疑似f2纯合果穗，右为f2杂合果穗

图2为播种20天后b73和skm植株差异图；

图3为b73和skm胚乳淀粉颗粒大小统计图；

图4为扫描电镜下b73和skm胚乳淀粉颗粒对比图；

图5该snp引物分别扩增b73、纯合大粒、杂合大粒、skm的琼脂糖凝胶电泳检测。

具体实施方式

以下实施例中进一步解释说明本发明的技术方案，根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1

1材料和方法

1.1玉米材料

1.1.1突变体材料skm的获得

2014年，在北京顺义种植基地，发现了一个籽粒大小符合3:1分离的自然突变体，经过几代自交鉴定，发现该突变体的表型能够稳定遗传，将其命名为skm，

1.1.2定位群体的构建

2016年5月在北京顺义种植基地将该小粒突变体的杂合体植株花粉，分别与b73常用自交系做杂交；

2016年11月在海南南繁种植基地繁种skm，并构建b73自交系背景的f2分离群体，作为定位群体；

2017年5月在山东济阳种植基地繁种skm，并构建b73背景的f3分离群体，作为精细定位群体。

1.2突变体skm籽粒性状分离数据统计

分别取5个b73×skmf1、b73×skmf2、b73×skmf3群体的杂合果穗，统计野生型籽粒与突变型籽粒的分离比，统计数据如下表：

表1b73×skmf1群体相关统计及分析

综合以上数据分析，可以得出以下结论：该玉米小粒突变体符合经典的孟德尔遗传规律，属于隐性单基因控制的籽粒突变体。

表2b73×skmf2群体相关统计及分析

表3b73×skmf3群体相关统计及分析

1.3玉米籽粒突变体skm表型分析及其发芽及生长状况调查

如图1所示，突变体skm的突变籽粒外形上小于正常籽粒，种皮皱缩、凹陷。

在突变体skm的出苗率实验中，随机选取有表型分离的杂合穗4个，每个穗上随机选取50小籽粒卷纸发芽，再移到1：1的蛙石/营养土中生长，三叶期时统计各个穗子的出苗率如表4，可以看到仅有约10％左右的突变籽粒可以发芽成苗。与野生型相比，虽然处于同一发育阶段，但突变体的苗弱且生长发育明显迟缓。

表4突变体skm出苗率试验

2017年夏季在济阳基地试验田种植5行亲本杂合穗上的突变体籽粒，每行26粒，双粒播种，总共发芽7株，幼苗明显弱于正常籽粒幼苗，且无法长至抽穗期，见图2。

1.4玉米籽粒突变体skm扫描电镜分析

利用扫描电镜技术对野生型籽粒和突变体籽粒的胚乳的组成成分微观结构观察分析，在扫描电镜下，胚乳组成成像结果如下图：

在微观结构下，突变体胚乳相比于野生型籽粒胚乳发生了显著变化。突变体胚乳的组成成分明显松散，淀粉粒之间掺杂着许多小颗粒，大小不一，填充物质也明显稀少而正常籽粒里淀粉粒大小比较一致，且紧密排列，淀粉粒间的空隙被填充物质塞满。

1.5bsa测序初步定位

用于测序的玉米材料为：亲本1：b73(野生型)，亲本2：skm(突变型)，子代1：b73×skmf3群体野生型籽粒，子代2：b73×skmf3群体突变型籽粒。

挑选具备萌发条件的亲本1、亲本2、子代1、子代2籽粒，置与1:1的蛙石/营养土中，28℃光照16h，22℃黑暗8h，温室中培养至三叶期时，剪取等量的10份亲本1、亲本2叶片置于自封袋，剪取200份等量的子代1、子代2叶片分别置于自封袋并编号。

1.5.1bsa测序生物实验

1.提取样本中的基因组dna，电泳检测合格后进行建库。

2.检测合格的dna样品先经过covaris随机打断成350bp的片段，采用truseqdnaltsampleprepkit试剂盒进行建库，dna片段经过末端修复、加ploya尾、加测序接头、纯化、pcr扩增等步骤，最终完成文库构建。

1.5.2bsa测序生物信息学分析

测序数据下机后，首先进行数据过滤，去掉低质量数据，获得cleanreads；然后将cleanreads与参考基因组比对，根据比对结果检测snp和indel位点并注释；根据snp位点信息和snp-index进行突变位点过滤和定位，最后筛选出候选基因。

1.5.3连锁区间定位

在分离群体搭建过程中，子代会根据表型进行选择，筛选出突变型子代池和野生型子代池，根据遗传连锁交换定律，子代池的基因型会和表型产生共分离，反应在物理图谱层面，与表型连锁的染色体区段会和不连锁的染色体区间产生稳定的snp-index差异。

1.5.4候选基因筛选

1.5.4.1筛选原理

(1)δsnp-index定位时，在超出置信线的染色体区域内筛选候选基因

正向峰表明：在连锁区间中，子代的snp突变类型与突变亲本一致，会导致突变表型的产生。因此，筛选子代中突变类型与突变亲本一致，且snp-index差异较大的位点作为候选基因；

负向峰表明：在连锁区间中，子代的snp突变类型与突变亲本不同，会导致突变表型的产生。因此，筛选子代中突变类型与突变亲本不同，且snp-index差异较大的位点作为候选基因。

(2)snp-index定位时，在snp-index接近1的染色体区域内筛选候选基因

筛选子代中突变类型与突变亲本一致，且snp-index接近1的位点作为候选基因；

(3)筛选标准

检测snp&indel的过程中，需要用参考基因组作为桥梁，因此，利用参考基因组检测出的各样本snpratio(不同于参考碱基的reads数与该位点总reads数的比值)筛选候选基因。考虑到取样误差、测序错误等均会给数据造成影响，将ratio值≥0.9的位点定义为纯合突变，将ratio值≤0.1的位点定义为纯合不突变。筛选标准如下：

表3.5.1ratio值筛选标准

备注：(1)性状分类：性状一般分为质量性状、数量性状、致死质量性状，不同的性状涉及到取样方式不同；(2)基因显隐性：为导致突变性状的基因的显隐性；(3)pm_ratio：突变亲本ratio值；(4)pwt_ratio：野生亲本ratio值；(5)fm_ratio：突变子代ratio值；(6)fwt_ratio：野生子代ratio值

1.5.4.2定位区间信息

表3.5.2group1定位区间信息

备注：(1)chromosome：染色体位置；(2)start_position：定位区间起始位置；(3)end_position：定位区间终止位置；(4)gene_number：定位区间基因个数；(5)snp_number：定位区间snp个数；(6)indel_number：定位区间indel个数；(7)peak：定位区间内的最高置信区间阈值。

1.6parms精细定位

parms(penta-primeramplificationrefractorymutationsystem，五引物扩增受阻突变体系)是由武汉市景肽生物科技有限公司自主研发的新型snp分子标记检测技术，具有完全自主的知识产权。parms是一种结合了一对通用荧光引物、一对snp等位基因特异引物以及一条反向共用引物的snppcr分析技术。可快速简单地进行snp等位基因基因型检测。本研究采用parms技术进行精细定位。

1.6.2parmssnp检测实验材料

在精细定位中，所需的群体数目可能较大，突变体的发芽率又相对较低，为了防止浪费突变体籽粒，又为了能够快速便捷地进行定位实验，故采取碱煮法提取玉米叶片dna。

用于parmssnp检测的玉米材料为：亲本1：b73(野生型)，亲本2：skm(突变型)，子代：b73×skmf3群体突变型籽粒。

挑选具备萌发条件的亲本1、亲本2、子代突变型籽粒，置与1:1的蛙石/营养土中，28℃温室中培养至三叶期时，剪取等量的2份亲本1、亲本2叶片置于2ml离心管中，剪取300份子代叶片分别置于2ml离心管中并编号，碱煮法提取玉米叶片dna；

1.6.3碱煮法提取玉米叶片dna

1.取适量叶片(长约2cm，宽约0.5-1cm，)放入2ml离心管中，加入200μl0.3m的naoh溶液，磨样机中进行磨样，1200rpm离心1min，沸水中煮30s-1min；

2.向2ml离心管中加入300μl0.75mtris-hcl(ph7.4-7.8)，沸水煮30s-1min，1200r离心，样本颜色均匀，表现为青绿(嫩叶)或深绿(老叶)；

3.取上清液50μl到pcr板中。

1.6.4parms定位结果

利用b73×skmf3的200份突变籽粒群体，筛选出9个交换单株，成功将该突变体定位到玉米第7号染色体的152.27mb-152.34mb(70kb)，与野生型序列进行比对，发现zm00001d021439基因在skm中有一个碱基g→c的突变，造成了移码突变，而其他基因没有变化。由此推断，zm00001d021439可能是控制该表型的基因。

实施例2

由于skm籽粒营养成分低、生长状况不佳，在田间收获的部分f2果穗无法断定是否为纯合果穗(如图2)，利用snp分子标记zm00001d021439可以在玉米苗期完成籽粒基因型的鉴定。

实验对象为野生型玉米自交系b73(10粒)、f2(疑似)纯合果穗正常籽粒(10粒)、f2杂合果穗正常籽粒(10粒)、f2杂合果穗突变籽粒(10粒)，于温室培养至三叶期，提取玉米叶片dna，将dna稀释成20ng/ul，等体积混合，构建b73基因池、疑似纯合大粒基因池、杂合大粒基因池、突变籽粒基因池。

snp分子标记的特异性引物为：

正向引物：(caagtacgtgacggcgaac)

反向引物：(ttcttcgcgacctctttctc)

分别以b73、疑似纯合大粒、杂合大粒、突变籽粒叶片dna为模板，利用snp分子标记的特异性引物进行pcr扩增，琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1，从左至右分别为疑似纯合大粒、杂合大粒、突变籽粒、b73。由此可以确定，该疑似纯合大粒的基因型与b73一直，为纯合大粒果穗。

序列表

<110>济南大学

<120>一种与玉米籽粒大小相关的分子标记及其应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>178

<212>dna

<213>玉米

<400>1

gcatcgtgagaccgcctcgaccgcggagcggcccctgcgagacgggctggagtgcggccg60

cgcctgcaacgcaaaggcgccggcagccgtcggcgaggtgctcgccatgcgcctcaaggt120

ggaaggcctcgcgcgggagcccatatacgccaacgcggagaaagaggtcgcgaagaaa178

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>玉米

<400>2

caagtacgtgacggcgaac19

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>玉米

<400>3

ttcttcgcgacctctttctc20