3种猪圆环病毒通用型PCR检测引物和检测方法与流程

本发明提供3种猪圆环病毒通用型pcr检测引物和检测方法，属于动物病毒学领域。

背景技术：

猪圆环病毒（porcinecircovirus,pcv）是迄今发现的最小的动物病毒之一，当前猪圆环病毒有3种：pcv1、pcv2和pcv3。pcv1为非致病性的病毒；pcv2为致病性的病毒；pcv3的有无致病力好需要更进一步深入明确。研究发现，pcv2是断奶仔猪多系统衰竭综合征（postweaningmultisystemicwastingsyndrome,pmws），皮炎与肾病综合征(pnds)的主要病原。对pcv1和pcv2的基因组进行分析发现，pcv1基因组全长1759bp，pcv2全长1768bp（或1767bp）。orf1是pcv1和pcv2最大的开放阅读框（orf），位于病毒基因组的5’端，编码病毒的复制蛋白（rep），分子量大小为37kda，与病毒的复制转录有关。

2016年，美国堪萨斯州立大学科研人员利用宏基因组测序技术，从患有皮炎肾病综合征（pdns）和繁殖障碍母猪及其流产胎儿体内首次鉴定出一种新型猪圆环病毒，命名为猪圆环病毒3型（porcinecircovirus3，pcv3）。流行病学调查发现pcv3感染多见于具有pdns和繁殖障碍症状猪群，目前已于美国多个州猪群内普遍流行。随后，我国多个省市猪群中也检测出pcv3。近来，波兰和韩国相继报道存在pcv3感染猪群。作为一种新发现病原体，pcv3对猪致病性及在猪圆环病毒相关疾病（pcvad）中作用以及现有商品化pcv2疫苗对其免疫效力等有待进一步研究。和pcv1、pcv2一样，pcv3病毒颗粒直径为17-20nm，核酸类型为单股dna病毒，基因组长度为2000bp，包含有与复制相关的复制蛋白rep和与抗原相关的抗原蛋白cap。

当前，已见有pcv1和pcv2鉴别诊断的研究报道，也见有pcv2和pcv3鉴别诊断的报道，但当前尚未见一组可同时对3种猪圆环病毒类型（pcv1、pcv2和pcv3）的方法报道。一般而言，对三种或以上的病原进行同时pcr扩增均为困难，尤其三种核苷酸同源性低于80%，且基因组长度不同的病原进行检测，需要分别设计引物，再进行分别扩增。但上述建立的方法均是基于鉴别诊断而设计的，只能扩增出各自相应的病毒条带，没有通用型的pcr检测方法，本发明可填补上述研究空白。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对上述现有技术中的不足，提供了一种特异性强、敏感性高的三种猪圆环病毒通用型pcr检测引物及其检测方法。

为实现上述目的，采用以下技术方案:

3种猪圆环病毒通用型pcr检测引物，所述引物组其核苷酸序列如下所示：

上游引物p1：5’-agcgagtattgcarkaaaga-3’

下游引物p2：5’-ccatkrtaaccatcccacca-3’。

用于非诊断目的的3种猪圆环病毒的pcr检测方法，包含以下步骤：

（1）、从疑似临床样品中提取基因组dna；

（2）、以提取的dna为模板，用所述的引物p1和p2进行pcr扩增；

（3）、该组引物对pcv1、pcv2和pcv3均可有效扩增。

所述的引物在制备3种猪圆环病毒通用型pcr检测试剂盒上的应用。

本发明的优点在于：

本发明根据pcv1、pcv2、pcv3的基因组，进行核苷酸同源性比较分析，设计了通用型引物，并利用该引物建立pcr方法，最终实现了pcv1、pcv2、pcv3三种病毒的快速检测。采用该引物及优化的pcr方法，不仅能够同时检测pcv1、pcv2、pcv3三种病毒，而且还具有重复性好、特异性强、敏感性高的特点。

附图说明

图13种猪圆环病毒基因组核苷酸比较。

图2上游引物设计区域。

图3下游引物设计区域。

图4pcr扩增电泳图，其中m：dl2000分子量标准；1：pcv1；2：pcv2；3：pcv3；4：ppv；5：prv；6：v-prv；7：prrsv；8：pedv。

具体实施方式

下面实施例对本发明做进一步的描述。

实施例1

1、毒株：

猪圆环病毒1型（pcv1）、猪圆环病毒2型（pcv2）、猪圆环病毒3型（pcv3）、猪细小病毒（ppv）、经典猪伪狂犬病毒（prv）、变异型猪伪狂犬病毒（v-prv）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（prrsv）、猪流行性腹泻病毒（pedv）均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所分离鉴定和保存。

2、主要试剂

病毒核酸提取试剂盒easypureviraldna/rnakit购自北京全式金生物技术有限公司；pcr扩增试剂盒quicktaqhsdyemix购自toyobo公司；其他常规化学试剂、耗材、引物合成和序列测定均为生工生物工程（上海）股份有限公司产品。

3、核苷酸序列分析

选择pcv1代表株（pk株，genbank登陆号dg650650；bj-1株，genbank登陆号fj475129），pcv2代表株（jz-9株，genbank登陆号mh059556；pcv-45株，genbank登陆号kc514989），和pcv3代表株（pcv3-cn2018ln-2株，genbank登陆号mh277116；pcv3-cn2018ln-3株，genbank登陆号mh277117）为例，选择dnastar生物学软件进行核苷酸同源性比较，结果可见（图1）：pcv1和pcv3的基因组核苷酸同源性低于50%（47.3%左右）；pcv1和pcv2的基因组核苷酸在77.7%-77.8%之间；pcv2和pcv3的基因组核苷酸同源性低于50%（47.4%左右）。

4、引物设计

基于3的分析结果，寻找3种猪圆环病毒（pcv1、pcv2和pcv3）的保守区来设计通用型引物，该引物就可以同时对3种猪圆环病毒（pcv1、pcv2和pcv3）进行扩增，其中引物p1和p2序列为：

上游引物p1：5’-agcgagtattgcarkaaaga-3’

下游引物p2：5’-ccatkrtaaccatcccacca-3’。

但是该引物组（p1和p2）对3种猪圆环病毒（pcv1、pcv2和pcv3）的扩增大小分别为344bp、344bp和347bp。

其中上游引物p1的设计区域见图2，该区域可对3种猪圆环病毒（pcv1、pcv2和pcv3），rk表示修饰引物，其中r=a/g，k=g/t。

其中下游引物p2的设计区域见图3，该区域可对3种猪圆环病毒（pcv1、pcv2和pcv3），rk表示修饰引物，其中y=c/t，m=a/c。

5、pcr方法的建立

5.1核酸dna的提取

以试剂盒说明书进行，提取猪圆环病毒1型（pcv1）、猪圆环病毒2型（pcv2）、猪圆环病毒3型（pcv3）、猪细小病毒（ppv）、经典猪伪狂犬病毒（prv）、变异型猪伪狂犬病毒（v-prv）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（prrsv）、猪流行性腹泻病毒（pedv）的基因组核酸dna。

5.2pcr条件优化

以提取pcv1、pcv2和pcv3的基因组dna，分别作为模板。用所设计的特异性pcr引物p1和p2进行常规pcr扩增，并对退火温度（50-60）℃进行优化。按照quicktaqhsdyemix扩增试剂盒推荐的50μl配置pcr反应液：quicktaqhsdyemix25μl、上/下游引物（10μmeach）各1μl、模板1μl、水补足至50μl。经过优化后，56℃位最佳退火温度，此时pcv1、pcv2和pcv3均可有效扩增。优化后的最佳反应条件为：94℃2min预变性；94℃40s、56℃30s、72℃30s，共30个循环，72℃总延伸7min。

5.3特异性实验

以优化后条件对猪群常见传染病，如猪圆环病毒1型（pcv1）、猪圆环病毒2型（pcv2）、猪圆环病毒3型（pcv3）、猪细小病毒（ppv）、经典猪伪狂犬病毒（prv）、变异型猪伪狂犬病毒（v-prv）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（prrsv）、猪流行性腹泻病毒（pedv）进行扩增，判断本研究的特异性。结果可见（图4），仅pcv1、pcv2和pcv3出现阳性特异性扩增条带，而ppv、prv、v-prv、prrsv、pedv均未见条带扩增。

6、临床应用

应用本方法对临床送检49份猪pmws病料进行检测，将病料按照常规方法研磨处理后，利用核酸提取试剂盒提取病毒的基因组dna，利用优化后的方法进行pcr检测，结果检测到27份核酸阳性，阳性率为55.10%。对这个27份检测阳性样品进行ta克隆测序，结果其中有pcv1阳性3株、pcv2阳性15株，pcv3阳性9株。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

sequencelisting

<110>福建省农科院畜牧兽医研究所

<120>3种猪圆环病毒通用型pcr检测引物和检测方法

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