一种降解黄曲霉毒素B1的菌株及其应用的制作方法

本发明属于微生物领域，尤其涉及一种降解黄曲霉毒素B1的菌株及其应 用。

背景技术：

黄曲霉毒素是一类主要由黄曲霉、寄生曲霉等曲霉产生的次级代谢产 物，具有极强的致癌、致畸、致突变性。目前已鉴定出的黄曲霉毒素种类有 20多种，其中黄曲霉毒素B1(AFB1)的毒性最强，1993年被国际癌症研究机 构(International Agency for Research on Cancer,IARC)归为一级致 癌物。其危害的靶器官主要是肝脏，长期摄入会引起肝癌，并引发肾脏、胃 肠器官的癌变。

花生粕是提取花生油后的副产品，蛋白质含量达48％，是我国重要的植 物来源蛋白饲料。然而，花生粕在储存过程中极易污染黄曲霉毒素，在很大 程度上限制了其在饲料领域的应用。我国饲料卫生标准(GB13078-2017)规 定花生粕中黄曲霉毒素B1的限量标准为≤50μg/kg。传统的去除花生粕中黄 曲霉毒素的方法主要有物理法和化学法，包括吸附法、紫外线照射法、碱处 理法、臭氧法、氨化法等，但都存在效果差、营养损失大、适口性差等缺点。 近几年，生物脱毒法由于具有条件温和、提高产品营养和适口性好等特点逐 渐得到业内广泛认可。

目前用于花生粕生物脱毒的微生物主要有乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢杆 菌等。乳酸菌和酵母菌主要通过菌体对毒素的吸附作用，使毒素在通过胃肠 道时不被吸收，直接排出体外。这种吸附作用存在可逆性，在一定条件下会 解吸附，不是根本意义上的脱毒。枯草芽孢杆菌产生的酶对黄曲霉毒素有一 定的降解作用，但是脱毒效果不稳定且发酵产物适口性差，很难大规模应用。

技术实现要素：

本发明针对上述现有技术存在的不足，提供一种降解黄曲霉毒素B1的菌 株及其应用。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种降解黄曲霉毒素B1的菌株，其保藏编号为CGMCC No.17142。

本发明的第二个目的在于提供上述菌株CGMCC No.17142在降低发霉花 生粕中黄曲霉毒素B1的应用。

本发明的第三个目的在于提供上述菌株的分离方法，步骤如下：

(1)将采集自山东省莱阳市花生种植基地的土壤在无菌生理盐水中摇 床震荡10-20min，制备菌悬液；其中，土壤与无菌生理盐水的用量比为10g： (80-120)mL；

(2)将步骤(1)的菌悬液用无菌生理盐水进行梯度稀释后，涂布在酵 母膏胨葡萄糖琼脂培养基平板上，在35-40℃条件下培养24h；

(3)挑取平板上形态不同的单菌落，采用平板划线法纯化，纯化后的 菌株采用黄曲霉毒素降解实验筛选，得到高效降解黄曲霉毒素B1的菌株 CGMCC No.17142。

其中，步骤(2)中所述的梯度稀释具体操作为：步骤(2)中所述的梯 度稀释具体操作为：取步骤(1)的菌悬液静置5min，取上层清液1mL，用 无菌生理盐水进行逐级稀释10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6，取不同稀释 度的菌悬液，分别吸取100μL均匀涂布于培养基平板上。

本发明的第四个目的在于提供一种降解黄曲霉毒素B1的方法，将菌株 CGMCC No.17142的培养液、菌悬液、发酵液或代谢产物，与含有黄曲霉毒素 B1的物料混合。

进一步，菌株CGMCC No.17142用于降低发霉花生粕中黄曲霉毒素B1的 方法，步骤如下：

(1)将污染有黄曲霉毒素B1的花生粕粉碎，与麸皮按照重量比1: (0.1-0.15)混合，高压蒸汽灭菌；

(2)将菌株CGMCC No.17142接种于液体YPD培养基中，在35-40℃条 件下培养24h，作为菌种培养液；

(3)将步骤(2)的菌种培养液按照1-10％的接种量接入冷却后的花生 粕麸皮混合物料，调整料水比为1:(0.5-1)，混合均匀；在32-37℃条件 下发酵24h，在40-45℃条件下继续发酵24h，在48-53℃条件下继续发酵 24-36h；将发酵后的物料烘干、粉碎。

【生物保藏说明】

本发明所用的菌株，其保藏编号为CGMCC No.17142；生物材料：LH-F001； 分类命名：鲁梅利杆菌(Rummeliibacillus stabekisii)；已于2019年01 月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其地址为： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明的有益效果是：

本发明的菌株具有高效降解黄曲霉毒素B1的作用，将其应用于发霉花生 粕中，发酵3-4天，降解率可达到90％以上，脱毒的花生粕中黄曲霉毒素B1含量低于国家限量标准。该菌株作为降解黄曲霉毒素B1的生物材料，可开发 成生物脱毒剂，对饲料、养殖工业具有很好的应用前景。

附图说明

图1示菌株LH-F001的平板培养性状；

图2示黄曲霉毒素标准品(5μg/kg)的高效液相图谱；

图3示发霉花生粕发酵前(上图)、后(下图)黄曲霉毒素B1的高效液 相图谱；

图4示不同发酵时间黄曲霉毒素B1的降解率。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本 发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1菌株LH-F001的分离与鉴定

一、菌株的分离纯化

(1)将采集自山东省莱阳市花生种植基地的土壤10g在100mL无菌生 理盐水中摇床震荡10-20min，制备菌悬液；

(2)取步骤(1)的菌悬液静置5min，取上层清液1mL，用无菌生理盐 水进行逐级稀释10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6，取不同稀释度的菌悬液， 分别吸取100μL均匀涂布于酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基平板上，在37℃条 件下培养24h；

(3)挑取平板上形态不同的单菌落，采用平板划线法纯化，纯化后的 菌株采用黄曲霉毒素降解实验筛选，得到高效降解黄曲霉毒素B1的菌株，命 名为LH-F001。

将所得菌株LH-F001在YPD培养基上、在37℃条件下培养24h，见图1， 菌落呈圆形、半透明、边缘整齐。革兰氏染色镜检阳性，菌体有芽孢。

二、菌株的鉴定

提取LH-F001的总DNA，利用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，将 扩增产物测序，经NCBI数据库同源序列比对分析，菌株LH-F001与Rummeliibacillus stabekisii strain PP9(2016)(GenBank登录号为 CP014806.1)同源性为100％，判定该菌株为鲁梅利杆菌Rummeliibacillus stabekisii。

实施例2菌株LH-F001在降解黄曲霉毒素B1中的应用

一、菌种培养液

菌株LH-F001接种于液体YPD培养基中，在37℃条件下培养24h，作为 菌种培养液，用于后续黄曲霉毒素B1的降解实验。

二、菌株LH-F001用于降低发霉花生粕中黄曲霉毒素B1的方法，步骤如 下：

(1)取180g污染有黄曲霉毒素B1的花生粕粉碎，加入20g麸皮，混合 均匀后置于1L烧杯中，高压蒸汽灭菌；

(2)将菌株LH-F001接种于液体YPD培养基中，在37℃条件下培养24h， 作为菌种培养液；

(3)将步骤(2)的菌种培养液以10％(v/w)的接种量接入冷却后的花 生粕麸皮混合物料，调整料水比为1:0.6，混合均匀，用8层纱布包裹烧杯 口；将烧杯置于培养箱中，在37℃条件下发酵24h，45℃条件下继续发酵24h， 在50℃条件下继续发酵36h；将发酵后的花生粕烘干、粉碎。

三、检测黄曲霉毒素B1

1、检测方法：称取样品20.00g，使用甲醇：水(体积比6:4)溶液进 行萃取，萃取液经免疫亲和柱净化提取后，用高效液相色谱(柱后碘液衍生) 对样品进行检测。

样品为黄曲霉毒素标准品(5μg/kg)、上述步骤(1)的污染有黄曲霉 毒素B1的花生粕、步骤(3)发酵后的花生粕、对照样品；其中，对照样品 为上述步骤(1)的污染有黄曲霉毒素B1的花生粕不接种菌株LH-F001，调 整料水比为1:0.6，混合均匀，用8层纱布包裹烧杯口；将烧杯置于培养箱 中，在37℃条件下发酵24h，45℃条件下继续发酵24h，在50℃条件下继续 发酵36h所得。

2、检测结果：

步骤(1)的污染有黄曲霉毒素B1的花生粕中黄曲霉毒素B1含量为 219.87μg/kg；步骤(3)发酵后的花生粕中黄曲霉毒素B1含量降低至 15.17μg/kg，降解率达93.1％；对照样品中黄曲霉毒素B1的含量为 197.88μg/kg。

高效液相色谱检测图谱及降解效果见图2、图3。

可见，脱毒后发酵花生粕中黄曲霉毒素B1含量远低于国家对饲料的限量 要求(≤50μg/kg)，适合应用于对发霉花生粕中黄曲霉毒素B1的工业化脱 毒处理。

AFB1降解率(％)＝(发酵前原料AFB1含量-发酵后残留AFB1含量)/发酵 前原料AFB1含量×100。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明 的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发 明的保护范围之内。