一株猪源降胆固醇植物乳杆菌及应用的制作方法

本申请属于微生物
技术领域：
，具体地说，涉及一株猪源降胆固醇植物乳杆菌及应用。
背景技术：
：胆固醇是人体内重要的生理功能物质，但含量过高会造成动脉粥样硬化、冠心病等心脑血管疾病，严重威胁人类健康。我国的心血管疾病发病率较高，死亡率更是高居所有疾病首位。传统的化学药物治疗容易反复，且成本较高，给患者和家属带来沉重负担。因此，寻找更为安全、有效且成本低廉的降胆固醇药物替代品，仍是广大医学和科研工作者研究的一个重点。科学家早在1974年已经发现，长期饮用乳酸菌发酵饮品的人群体内血清胆固醇含量普遍偏低(MannGV,SpoerryA.StudiesofasurfactantandcholesteremiaintheMaasai[J].AmJClinNutr.1974,27:464-469)。随后，人们开始大量研究乳酸菌与体内胆固醇的关系，并证实有些乳酸菌可以降低体内胆固醇的含量。之后，相关学者开展了大量乳酸菌降胆固醇的研究工作，乳酸菌俨然成为食品和医药领域的降胆固醇明星。我国在该领域研究起步较晚，这些年开展了大量相关研究工作，并筛选出多株具有降胆固醇功能的乳酸菌。但这些乳酸菌的筛选，大多是建立在降解机理是胆固醇与游离胆酸共沉淀基础之上，在含结合型胆盐的MRS培养基中分离筛选的。而胆固醇与胆盐水解物的共沉淀现象一般只发生在酸性环境中(pH≦5.5)(国立东,杨丽杰,霍贵成.乳酸菌降胆固醇机制的研究进展[J].食品与发酵工业.2013,39(2):117-122)。然而，人体肠道一般为中性，这种共沉淀效应在人体内很难发挥作用，限制了该类乳酸菌在肠道内的实际功效。此外，降胆固醇乳酸菌的筛选，主要以植物、食品等为原料进行的，乳酸菌在人或动物体内滞留时间和安全性，关乎其功能持效性和应用价值，有待进一步考证。因此，寻找安全、有效，能够直接在体内外吸收或降解胆固醇，且能在体内能够在肠道内长期存在的乳酸菌，在降胆固醇食品或药品开发中更具有实际意义。技术实现要素：有鉴于此，本申请提供了一株猪源降胆固醇植物乳杆菌及应用。为了解决上述技术问题，本申请公开了一株猪源降胆固醇植物乳杆菌R-15(LactobacillusplantarumR-15)，所述植物乳杆菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM2018010，保藏日期为2018年1月8日。本发明所提供的植物乳杆菌是从贵州省某偏远山区散养的成年猪肠道黏膜中分离出。在MRS固体培养基上培养30h时，菌落乳白、圆隆、表面光滑及乳香等特征明显。革兰氏染色镜检时，菌体呈紫色杆状，单个、成对或链状排列。生理生化特征鉴定结果：过氧化氢酶试验、硝酸盐还原试验、明胶液化试验、吲哚试验、硫化氢试验、葡萄糖产气试验、淀粉水解试验等均为阴性。经形态学、生理生化特征及16SrDNA等综合鉴定，菌株R-15为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)。经硫酸铁铵法检测，本发明提供的植物乳杆菌R-15能在不含胆盐的培养基中显著降低胆固醇的含量。经模拟胃液、肠液和胆盐等耐受性试验鉴定，植物乳杆菌R-15对胃液、肠液和胆盐均具有良好的耐受性。经细胞表面疏水性试验分析，植物乳杆菌R-15具有良好的表面疏水性。本发明还公开了一种上述的植物乳杆菌在制备功能性酸奶发酵食品中的应用。可选地，包括以下步骤：1)制备复原脱脂牛奶：以脱脂牛奶为基础原料加无菌水复原，得到复原脱脂牛奶；2)制备种菌：以植物乳杆菌R-15和嗜热链球菌为菌种，均接入灭菌的部分复原脱脂牛奶中，培养制备成酸奶种子，连传3代；制备得到种菌；3)取部分复原脱脂牛奶，添加复合稳定剂和蔗糖，匀质后95℃处理5min，冷却并接入种菌，发酵；至上层刚出现乳清析出时结束，将酸奶置于4℃冰箱至乳清充分吸收。可选地，步骤1)中的脱脂牛奶加7倍无菌水复原。可选地，步骤2)中的复原脱脂牛奶中的植物乳杆菌R-15和嗜热链球菌的接入量均为1.0×108CFU/mL；步骤2)中的培养温度为41℃，培养时间为12h。可选地，步骤3)中的复合稳定剂为质量比为2:1的果胶和魔芋胶；复合稳定剂的添加量为复原脱脂牛奶的质量总量的0.3％；蔗糖的添加量为复原脱脂牛奶的质量总量的8％。可选地，步骤3)中的种菌的接入量占复原脱脂牛奶质量总量的5％；发酵时间为6～8h，发酵温度为42℃。本发明所制酸奶色泽均一、表面光滑无乳清，酸香纯正无异味，口感细腻、酸甜适口。本发明还公开了一种上述的植物乳杆菌在制备降高胆固醇血脂药物中的应用。该降高胆固醇血脂药物用于降胆固醇。可选地，所述的植物乳杆菌为植物乳杆菌菌悬液或者植物乳杆菌发酵液。可选地，植物乳杆菌菌悬液通过以下方法制备得到：取37℃培养12h的植物乳杆菌R-15发酵液，8000rpm离心2min，弃上清液，菌体用pH7.0的PBS溶液洗涤3次，制备成活菌浓度为1.0×108cfu/ml的菌悬液。与现有技术相比，本申请可以获得包括以下技术效果：本发明的植物乳杆菌R-15酸奶和R-15菌悬液本身分别灌喂小鼠，每只10μL/d。28后，灌喂R-15酸奶和R-15菌悬液的小鼠血清中总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL)和甘油三脂(TG)显著低于高脂模型对照组(P≤0.05)，说明植物乳杆菌R-15及其酸奶制品能有效降低小鼠对胆固醇和脂肪的吸收，减少TC(尤其是LDL)和TG在血清中的积累。当然，实施本申请的任一产品必不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。附图说明此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：图1是本申请小鼠血清总胆固醇(TC)检测结果；图2是本申请小鼠血清甘油三酯(TG)检测结果；图3是本申请小鼠血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL)检测结果；图4是本申请小鼠血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL)检测结果。具体实施方式以下将配合附图及实施例来详细说明本申请的实施方式，藉此对本申请如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。实施例1本发明所述植物乳杆菌R-15的筛选和鉴定1.菌株的筛选1.1样品来源本发明提供的菌株是从贵州省毕节市某偏远山区散养猪的肠道黏膜中分离得到。被采样猪生长健壮，在生育期间从未生病，且从未饲喂过任何成品饲料、活菌制剂或抗生素。1.2分离纯化取上述被宰杀猪的肠道，用消毒过的解剖剪剪开，小心剔除肠道内容物，并用消毒过的解剖刀刮取肠道黏膜附属物，收集于5mL的无菌离心管中。梯度稀释后，取200μL稀释液均匀涂布于含0.5％碳酸钙的MRS平板中(蛋白胨10.0g，酵母膏10g，吐温801.0mL，牛肉膏10g，柠檬酸氢二铵2.0g，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，葡萄糖20.0g，硫酸锰0.25g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH6.6)，并置于厌氧培养罐中(厌氧产气袋除氧)，37℃培养静置48h。培养结束后，从稀释度高的平板中，挑取100个具有典型特征、且碳酸钙水解圈较大的菌落，划线分离纯化，至菌落形态均一，挑取单菌落转接于MRS斜面中培养24h。1.3菌株筛选将上述制备的斜面种子分别转接于10mL含胆固醇MRS液体培养基中(胆固醇含量为100μg/L，制备方法参考于长青(2007)和李妮(2012)等)，37℃下150rpm培养24h。取1ml液体种子转接于100mLMRS胆固醇培养基中，150rpm培养48h，制备发酵液。采用硫酸铁铵法检测发酵液中胆固醇含量(参考GB5009.128-2016)，并计算各菌株的胆固醇脱除率。胆固醇脱除率＝(C-A)/C×100％式中：C指发酵起始胆固醇浓度；A指发酵终了胆固醇浓度。结果共筛选出6株具有具有明显降胆固醇功能的乳酸菌，其中一株降胆固醇高达36.25％。在对培养基碳源、氮源及培养条件优化时，该菌株在48h内的最高降胆固醇率高达73.40％，在已知非胆盐培养基中体外降解率最高，具有较高的研究和应用价值。将该菌株命名为R-15。2.菌株的鉴定2.1形态鉴定将R-15培养液稀释涂布，37℃倒置培养48h，观察菌落特征。挑取R-15单菌落进行革兰氏染色，制备好的薄片经油镜镜检。结果显示：R-15菌落乳白、圆隆、表面光滑、乳香特征明显，并且产酸能力强，48h能形成较大的碳酸钙水解圈；菌体染色呈紫色，形态为单杆状、双杆状或链杆状排列。2.2生理生化特征鉴定以R-15为出发菌株进行过氧化氢酶试验、葡萄糖产气试验、石蕊牛奶试验、硝酸盐还原试验、明胶液化试验、吲哚试验、硫化氢试验、淀粉水解试验和V.P试验等，具体操作参考《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》(第八版)。鉴定结果如下：表1R-15生理生化特征鉴定结果试验内容结果试验内容结果过氧化氢酶试验-吲哚试验-葡萄糖产气试验-硫化氢试验-石蕊牛奶试验+淀粉水解试验-硝酸盐还原试验-V.P试验-明胶液化试验-注：+表示阳性；-表示阴性2.316SrDNA鉴定以平板划线分离的R-15单菌落为模板，细菌通用引物27F和1492R为引物，加入一定量的2×TaqPCRmix进行16SrDNAPCR扩增。反应条件为：98℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃90s；72℃5min，循环30次。琼脂糖凝胶电泳验证后，取PCR产物送至上海生工生物工程有限公司进行序列分析。将所测的16SrDNA序列在GenBank中BLAST比对(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)。经比对，R-15的16SrDNA序列与LactobacillusplantarumCLP0611同源率达100％。结合形态、生理生化特征和分子鉴定结果，鉴定菌株R-15为植物乳杆菌，保藏编号为：CCTCCNO：M2018010；于2018年1月8日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)，命名为：植物乳杆菌R-15(LactobacillusplantarumR-15)。实施例2植物乳杆菌R-15的耐受性试验1.耐酸性试验取活化的1％液体种子，转接于pH为2的液体MRS培养基中，37℃静置培养，取0、2、4h的培养液进行梯度稀释，取200μL稀释液涂布于MRS平板中，37℃培养48h，统计菌落数量，并计算存活率。结果如表2。表2植物乳杆菌R-15的耐酸试验结果(菌数单位为107CFU)2.耐胆盐试验取活化的1％液体种子，转接于含0.3％胆盐的MRS液体培养基中，37℃静置培养，取0、2、4h的培养液进行梯度稀释，取200μL稀释液涂布于MRS平板中，37℃培养48h，统计菌落数量，并计算存活率。结果如表3。表3植物乳杆菌R-15的耐胆盐试验结果(菌数单位为107CFU)3.模拟胃液耐受性试验取活化的1％液体种子，转接于人工模拟胃液中(参考张艳萍等，2016)，37℃静置培养，取0、2、4h的培养液进行梯度稀释，取200μL稀释液涂布于MRS平板中，37℃培养48h，统计菌落数量，并计算存活率。结果如表4。表4植物乳杆菌R-15的模拟胃液耐受性试验结果(菌数单位为107CFU)4.模拟肠液耐受性试验取活化的1％液体种子，转接于人工模拟肠液中(参考张艳萍等，2016)，37℃静置培养，取0、2、4h的培养液进行梯度稀释，取200μL稀释液涂布于MRS平板中，37℃培养48h，统计菌落数量，并计算存活率。结果如表5。表5植物乳杆菌R-15的模拟肠液耐受性试验结果(菌数单位为107CFU)以上试验结果表明，植物乳杆菌R-15对模拟胃液、肠液及高浓度胆盐均有较强的抵抗力，处理4h后仍能保持高数量乳酸菌活菌，能够保证乳酸菌通过肠胃之后足够的存活率，充分发挥益生菌功效。实施例3植物乳杆菌R-15细胞表面疏水试验菌体的疏水性与细胞粘附性正相关，即疏水性越高粘附性越好，可采用二甲苯菌体吸附法，测量植物乳杆菌R-15的表面疏水性。疏水性检测方法参考郭旭升等(2014)所述，具体为：植物乳杆菌R-15在液体MRS培养基中培养16h(37℃)，8000rpm离心5min，0.1molKNO3(pH6.2)洗涤两次，等体积该溶液悬浮，可见分光光度计测初始吸光度OD600值(A0)；吸取该菌悬液6ml，加入2ml二甲苯，混合后室温静置10min，涡旋2min，室温静止放置15min使之分层，小心用灭菌吸头移取3ml下层水相，测量最终吸光度OD600值(A)，重复三次，取平均值，并进行记录和计算。细胞表面疏水性检测结果如表6所示，以二甲苯为疏水剂时，植物乳杆菌R-15的细胞疏水指数高达69.23％，表明其有较高的疏水性。这一特征与其分离原料来源相对应，乳酸菌R-15本身来源于高度稀释的猪肠道黏膜附属物，具有较高的肠道细胞吸附性。表6植物乳杆菌R-15对二甲苯的疏水性菌株A0A疏水性H植物乳杆菌R-151.69±0.030.52±0.0669.23％实施例4植物乳杆菌R-15发酵酸奶的制备植物乳杆菌R-15的产酸能力强，升酸速度快，发酵液具有明显的乳酸特征，在制备酸奶方面具有一定潜力。本发明以R-15和具有凝乳功能的嗜热链球菌(市售)为菌种，分别按1.0×108CFU/mL的量接入灭菌的复原脱脂牛奶中(一份牛奶加7份无菌水)，41℃培养12h制备成酸奶种子，连传3代。稳定后取5％的种子转接入脱脂牛奶中(含0.2％果胶、0.1％魔芋胶和8％蔗糖，匀质后95℃维持5min，冷却)，于42℃下发酵6～8h，至上层刚出现乳清析出时结束，将酸奶置于4℃冰箱至乳清充分吸收。参考GB-19302对所制酸奶进行感官评价，结果如表6所示。表7植物乳杆菌R-15所制酸奶感官评价结果实施例5植物乳杆菌R-15及其酸奶制品的动物试验将40只雄性成年昆明小鼠分成4组，每组10只，分别灌喂R-15菌悬液(菌体浓度约108CFU/mL)、实施例4中制备的酸奶及两组PBS溶液(每组每只灌喂剂量均是10μL/只/d)，期间自由釆食。其中，R-15组、酸奶组及一组PBS对照饲喂高脂饲料(10％猪油、0.2％胆盐、1％胆固醇和88.8％的基础饲料(小鼠、基础饲料和垫料等均购自重庆腾鑫华阜实验动物销售有限公司)，另一组PBS对照饲喂基础饲料，连续28d。结束后记录各组小鼠体重变化及采食量，并断尾采血，用进口民康血脂检测仪(LipidProTM)及配套血脂试纸检测小鼠血清总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL)和甘油三酯(TG)等。结果如图1、2、3、4等所示，灌喂R-15酸奶和R-15菌悬液的小鼠血清中TC、LDL和TG显著低于对照组(P≤0.05)，说明植物乳杆菌R-15及其酸奶制剂能有效降低小鼠对胆固醇和脂肪的吸收，在预防及治疗高血脂症方面具有一定的应用价值。另外，体重检测结果显示(如表8)，R-15组和R-15酸奶组的小鼠增重较高脂组为低，采食量较高脂组为高。表8是指小鼠体重变化与采食量检测结果如在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定成分或方法。本领域技术人员应可理解，不同地区可能会用不同名词来称呼同一个成分。本说明书及权利要求并不以名称的差异来作为区分成分的方式。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。“大致”是指在可接收的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明本申请的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系统中还存在另外的相同要素。上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。当前第1页1 2 3