一种改造信号肽提高肠激酶分泌表达量的方法与流程

本发明涉及一种改造信号肽提高肠激酶分泌表达量的方法，属于基因工程技术领域。

背景技术：

肠激酶(Enterokinase，简写为EK)是存在于哺乳动物十二指肠内的一种异源二聚体丝氨酸蛋白酶，天然的EK有轻链和重链构成，并通过一对二硫键连接。研究表明轻链具备完整的催化活性，无糖基化时其相对分子量大小为27.2KD，EK对其识别序列具有高度的专一性，可识别Asp—Asp—Asp—Asp—Lys，作用于赖氨酸残基C端切割，这些特点使EK成为融合蛋白表达体系中理想的工具酶选择。

商业化来源的牛肠激酶轻链(简写为bEKL)其在大肠杆菌中以包涵体的形式表达，后续需体外复性，且复性率较低，以毕赤酵母为宿主具有翻译后修饰，杂蛋白含量少,高密度发酵等优势，更为重要的是bEKL在毕赤酵母中能以具有酶活的形式分泌出来。EK在毕赤酵母中的表达量并不高，这成为其工业化生产的瓶颈，因此，提高EK的表达量满足工业化生产需求，降低工业化生产成本具有重要意义。

技术实现要素：

本发提供一种重组菌，是以含有SEQ ID NO.1～6任一所示氨基酸序列的信号肽引导肠激酶的分泌表达。

在本发明的一种实施方式中，所述肠激酶的氨基酸序列如GenBank登录号:ACB10253.1所示，编码所述肠激酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

在本发明的一种实施方式中，编码SEQ ID NO.1所示信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

在本发明的一种实施方式中，编码SEQ ID NO.2所示信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

在本发明的一种实施方式中，编码SEQ ID NO.3所示信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。

在本发明的一种实施方式中，编码SEQ ID NO.4所示信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。

在本发明的一种实施方式中，编码SEQ ID NO.5所示信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。

在本发明的一种实施方式中，编码SEQ ID NO.6所示信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。

在本发明的一种实施方式中，以真菌或细菌为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是重组酵母菌。

在本发明的一种实施方式中，所述重组酵母菌的出发菌株包括以下任意一种：Pichia pastoris GS115、Pichia pastoris KM71、Pichia pastoris X-33、Pichia pastoris SMD1168。

在本发明的一种实施方式中，所述重组酵母菌，以Pichia pastoris GS115为出发菌株，将SEQ ID NO.7所示基因编码的肠激酶基因N端融合核苷酸序列为SEQ ID NO.12所示的信号肽形成的重组基因进行表达。

本发明的第二个目的是提供一种重组酵母菌的构建方法，是在编码肠激酶基因的N端融合SEQ ID NO.1～6任一所示的信号肽，得到重组基因，并将该重组基因与表达质粒连接所构成的重组质粒转化到酵母菌细胞中。

在本发明的一种实施方式中，所述编码肠激酶的基因序列如SEQ ID NO.7所示。

在本发明的一种实施方式中，所述的表达质粒是以下任意一种：pGAPZA、pGAPZαA、pPIC9K、pAO815、pPICZB。

在本发明的一种实施方式中，所述重组基因是采用基因合成和一步克隆法得到的含有改造信号肽和肠激酶基因序列的重组基因。

在本发明的一种实施方式中，所述重组酵母菌的构建方法如下：合成SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.16所示的信号肽，分别通过一步克隆的方法将每条信号肽的DNA片段与SEQ ID NO.7所示的基因插入到目的载体的EcoRI和NotI间，得到重组质粒，转入Escherichia coli JM109中，经质粒的抽提和AvrII酶的线性化后导入宿主菌细胞中，得到重组酵母菌。

本发明另外提供了一种提高肠激酶表达的方法，是使用上述构建的重组酵母菌进行发酵生产肠激酶。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将所述重组酵母菌于28～30℃培养4～6d。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将所述重组酵母菌接种至YPD培养基中培养。

本发明还要求保护所述重组菌在食品、生物领域的应用。

本发明还要求保护SEQ ID NO.1～6任一所述的信号肽在提高蛋白分泌表达效果或蛋白质生产方面的应用。

有益效果：在本发明中通过改造α-factor信号肽，实现了肠激酶在毕赤酵母中高效的胞外表达，解决了肠激酶胞外分泌不足的问题，使肠激酶的酶活由165200U/mL提高到687400U/mL，酶活提高4.2倍，产酶量由12mg/L提高至68mg/L。应用本发明中的信号肽明显提高了肠激酶的胞外分泌，降低了工业上生产肠激酶的成本，同时也为毕赤酵母外源分泌蛋白表达量的提高奠定了基础。

附图说明

图1为肠激酶在毕赤酵母中表达载体的构建图；

图2为重组毕赤酵母表达肠激酶酶活测定。

具体实施方式

信号肽Seka，Sekb，Sekc，Sekd，Seke，Sekf的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1～6所示，编码上述信号肽的基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.11～16所示。

编码肠激酶的基因bEKL的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

YPD培养基(g/L)：酵母膏10、蛋白胨20、葡萄糖20。

肠激酶的酶活测定方法：肠激酶可特异性切割GVDDDDK-β-萘胺底物，将β萘胺释放出来，随着β萘胺的积累，荧光值线性增加，可用来表征肠激酶酶活。

酶活定义：在0.5mM底物中，单位时间内荧光值增加1(1U＝1abs/min)为一个酶活单位。方法：取1μL发酵液上清与199μL底物混合至于黑色96孔板在37℃，激发波长337nm，发射波长420nm下，读数间隔1min，测7min，以荧光值的变化率来表征酶活。

实施例1出发菌株重组质粒的构建

将bEKL(GenBank:EU375507.1)基因两端加入EcoRI和NotI酶切位点，肠激酶C端加入GGGGS柔性Linker和10×His组氨酸标签，合成全长共1029bp的核苷酸序列(由金唯智完成)，设计上下游引物经过一步PCR得到序列为SEQ ID NO.7的目的片段；用同样的限制性内切酶处理pGAPZαA质粒得到具有粘性末端的载体片段，用T4连接酶16℃过夜连接，将连接产物通过化学法转化至大肠杆菌JM109感受态细胞，转化液涂在含有博来霉素(25mg/L)的LB平板上，转化子的测序由上海生工完成，测序无误后得到出发菌株的重组质粒。

实施例2产肠激酶的毕赤酵母出发菌株的构建

将出发菌株的重组质粒，用LB(含25mg/L)培养基培养过夜后抽提质粒，得到的质粒用AvrII酶进行线性化，柱回收后电击转化待用，转化毕赤酵母GS115，具体操作如下：

(1)从甘油管中挑取一环GS115菌液，在YPD平板上划线，30℃恒温培养3d；

(2)从平板上挑取酵母单菌落，接种至含有5ml YPD培养基的50ml三角瓶中，30℃，250-300r/min培养过夜；

(3)取1％的接种量培接种至含有100ml新鲜培养基的500mL三角摇瓶中，28～30℃、250-300r/min培养过夜，至OD600达到1.3～1.5；

(4)将细胞培养物于4℃，5000rpm离心5min，用等体积的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；

(5)按步骤4离心，用1/2菌液体积的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；

(6)按步骤4离心，用1/5菌液体积的冰预冷的1mol/L的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；

(7)按步骤4离心，用上一步山梨醇用量的1％体积的冰预冷的1mol/L的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为1.5ml感受态；

(8)感受态每80uL分装入1.5mL EP管中，加入20uL待用的线性化后的质粒混合，冰上静置15min；

(9)将上述混合物加入事先预冷好的无菌2mm电转杯中，2000V、25μF、200Ω条件下电击一下，立即加入预冷的1M山梨醇，轻微重悬；

(10)将上述重悬后的液体30℃培养1小时后，涂在含有博来霉素100mg/L的YPD平板上，继续30℃培养3d得到转化子；

(11)将转化子依次点在博来霉素浓度为200mg/L、300mg/L、400mg/L博来霉素板上，挑取400mg/L板上的转化子摇瓶发酵。

实施例3含有不同信号肽重组毕赤酵母菌的构建

设计上下游引物，上游引物序列如SEQ ID NO.9所示，下游序列如SEQ ID NO.10所示，以实施例1构建的重组质粒为模板进行PCR扩增，扩增如核苷酸序列SEQ ID NO.8所示的载体，作为一步克隆的载体片段；合成编码SEQ ID NO.1～6所示信号肽的基因，分别命名为Seka，Sekb，Sekc，Sekd，Seke，Sekf(核苷酸序列分别为11～16所示)作为一步克隆的插入片段；过程如附图1所示，用一步克隆法连接后转化、测序得到信号肽改造后的重组质粒。将重组质粒用实施例2所述的电转方法转入毕赤酵母GS115得到重组毕赤酵母菌。

实施例4构建重组酵母菌的摇瓶发酵培养

将本发明的信号肽用到重组毕赤酵母菌为生产菌株，构建的出发重组毕赤酵母菌为对照，将构建好的6种重组酵母菌划平板活化，从平板上挑取酵母单菌落，接种至含有50ml YPD培养基的250ml三角瓶中，30℃，250-300r/min培养过夜，然后按照10％的接种量再次转接50ml YPD培养基的250ml三角瓶中，30℃，250-300r/min培养5d后测发酵上清酶活，其中菌株Sekd酶活最高达到687400U/mL，产酶量达到68mg/L。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 美药星(南京)制药有限公司

江南大学

南京汉欣医药科技有限公司

<120> 一种改造信号肽提高肠激酶分泌表达量的方法

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 88

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Lys Phe Thr Phe Ala Ala Val Thr Ala Ala Leu Ala Ser Ser Ala

1 5 10 15

Met Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln Ile

20 25 30

Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe Asp

35 40 45

Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu Phe

50 55 60

Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val Ser

65 70 75 80

Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala

85

<210> 2

<211> 86

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Lys Phe Ser Thr Ala Leu Leu Ala Leu Ala Ala Val Ala Thr Ala

1 5 10 15

Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln Ile Pro Ala

20 25 30

Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe Asp Val Ala

35 40 45

Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu Phe Ile Asn

50 55 60

Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val Ser Leu Glu

65 70 75 80

Lys Arg Glu Ala Glu Ala

85

<210> 3

<211> 85

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Lys Ser Leu Leu Leu Ser Leu Leu Ala Val Pro Ala Thr Ala Ala

1 5 10 15

Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln Ile Pro Ala Glu

20 25 30

Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe Asp Val Ala Val

35 40 45

Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu Phe Ile Asn Thr

50 55 60

Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val Ser Leu Glu Lys

65 70 75 80

Arg Glu Ala Glu Ala

85

<210> 4

<211> 88

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Lys Phe Ser Ala Val Ser Ile Ala Ala Ala Leu Ala Ser Leu Val

1 5 10 15

Ala Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln Ile

20 25 30

Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe Asp

35 40 45

Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu Phe

50 55 60

Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val Ser

65 70 75 80

Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala

85

<210> 5

<211> 89

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Met Lys Leu Ser Thr Ile Leu Phe Thr Ala Cys Ala Thr Leu Ala Leu

1 5 10 15

Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln

20 25 30

Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe

35 40 45

Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu

50 55 60

Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val

65 70 75 80

Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala

85

<210> 6

<211> 87

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Met Lys Val Leu Ala Leu Leu Val Thr Val Cys Phe Ser Val Ala Ser

1 5 10 15

Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln Ile Pro

20 25 30

Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe Asp Val

35 40 45

Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu Phe Ile

50 55 60

Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val Ser Leu

65 70 75 80

Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala

85

<210> 7

<211> 762

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gaattcatga tagttggtgg ttctgattcc agggagggag catggccttg ggttgtggca 60

ctatactttg atgatcagca agtctgcggt gcaagtctag tgagtagaga ttggcttgtc 120

agtgcagctc actgcgtgta cggaaggaat atggagccaa gtaagtggaa agccgtcttg 180

ggcctgcaca tggcctctaa tctgacgagt ccacaaatcg aaacgagatt gatcgaccag 240

atagtaatca atccacatta taacaaaaga cgtaaggaca acgatattgc tatgatgcac 300

ctagaaatga aggtgaatta cacggattac atccaaccca tctgtctacc agaggaaaac 360

caggtgttta gtcctggcag gatttgctca atagctggtt ggggcaccct tatctaccaa 420

ggctcaactg ccgacgttct gcaagaagcc gatgtccccc tactatccaa cgagaaatgc 480

cagcaacaga tgccagaata caatatcacg gaaaatatgg tgtgtgcagg atacgaagct 540

ggtggcgttg attcatgtca aggtgattca ggtggcccct taatgtgcca ggagaacaac 600

aggtggcttt tggctggagt gacttccttt ggctatcaat gtgccttgcc caataggccc 660

ggtgtttacg cacgtgtgcc ccgttttaca gaatggattc agtcattttt gcacggtgga 720

ggaggttctc atcaccatca tcatcatcac catcaccatt ag 762

<210> 8

<211> 3593

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

agatcttttt tgtagaaatg tcttggtgtc ctcgtccaat caggtagcca tctctgaaat 60

atctggctcc gttgcaactc cgaacgacct gctggcaacg taaaattctc cggggtaaaa 120

cttaaatgtg gagtaatgga accagaaacg tctcttccct tctctctcct tccaccgccc 180

gttaccgtcc ctaggaaatt ttactctgct ggagagcttc ttctacggcc cccttgcagc 240

aatgctcttc ccagcattac gttgcgggta aaacggaggt cgtgtacccg acctagcagc 300

ccagggatgg aaaagtcccg gccgtcgctg gcaataatag cgggcggacg catgtcatga 360

gattattgga aaccaccaga atcgaatata aaaggcgaac acctttccca attttggttt 420

ctcctgaccc aaagacttta aatttaattt atttgtccct atttcaatca attgaacaac 480

tatttcgaaa cggaattcat gatagttggt ggttctgatt ccagggaggg agcatggcct 540

tgggttgtgg cactatactt tgatgatcag caagtctgcg gtgcaagtct agtgagtaga 600

gattggcttg tcagtgcagc tcactgcgtg tacggaagga atatggagcc aagtaagtgg 660

aaagccgtct tgggcctgca catggcctct aatctgacga gtccacaaat cgaaacgaga 720

ttgatcgacc agatagtaat caatccacat tataacaaaa gacgtaagga caacgatatt 780

gctatgatgc acctagaaat gaaggtgaat tacacggatt acatccaacc catctgtcta 840

ccagaggaaa accaggtgtt tagtcctggc aggatttgct caatagctgg ttggggcacc 900

cttatctacc aaggctcaac tgccgacgtt ctgcaagaag ccgatgtccc cctactatcc 960

aacgagaaat gccagcaaca gatgccagaa tacaatatca cggaaaatat ggtgtgtgca 1020

ggatacgaag ctggtggcgt tgattcatgt caaggtgatt caggtggccc cttaatgtgc 1080

caggagaaca acaggtggct tttggctgga gtgacttcct ttggctatca atgtgccttg 1140

cccaataggc ccggtgttta cgcacgtgtg ccccgtttta cagaatggat tcagtcattt 1200

ttgcacggtg gaggaggttc tcatcaccat catcatcatc accatcacca ttaggcggcc 1260

gccagctttc tagaacaaaa actcatctca gaagaggatc tgaatagcgc cgtcgaccat 1320

catcatcatc atcattgagt tttagcctta gacatgactg ttcctcagtt caagttgggc 1380

acttacgaga agaccggtct tgctagattc taatcaagag gatgtcagaa tgccatttgc 1440

ctgagagatg caggcttcat ttttgatact tttttatttg taacctatat agtataggat 1500

tttttttgtc attttgtttc ttctcgtacg agcttgctcc tgatcagcct atctcgcagc 1560

tgatgaatat cttgtggtag gggtttggga aaatcattcg agtttgatgt ttttcttggt 1620

atttcccact cctcttcaga gtacagaaga ttaagtgaga ccttcgtttg tgcggatccc 1680

ccacacacca tagcttcaaa atgtttctac tcctttttta ctcttccaga ttttctcgga 1740

ctccgcgcat cgccgtacca cttcaaaaca cccaagcaca gcatactaaa ttttccctct 1800

ttcttcctct agggtgtcgt taattacccg tactaaaggt ttggaaaaga aaaaagagac 1860

cgcctcgttt ctttttcttc gtcgaaaaag gcaataaaaa tttttatcac gtttcttttt 1920

cttgaaattt ttttttttag tttttttctc tttcagtgac ctccattgat atttaagtta 1980

ataaacggtc ttcaatttct caagtttcag tttcattttt cttgttctat tacaactttt 2040

tttacttctt gttcattaga aagaaagcat agcaatctaa tctaagggcg gtgttgacaa 2100

ttaatcatcg gcatagtata tcggcatagt ataatacgac aaggtgagga actaaaccat 2160

ggccaagttg accagtgccg ttccggtgct caccgcgcgc gacgtcgccg gagcggtcga 2220

gttctggacc gaccggctcg ggttctcccg ggacttcgtg gaggacgact tcgccggtgt 2280

ggtccgggac gacgtgaccc tgttcatcag cgcggtccag gaccaggtgg tgccggacaa 2340

caccctggcc tgggtgtggg tgcgcggcct ggacgagctg tacgccgagt ggtcggaggt 2400

cgtgtccacg aacttccggg acgcctccgg gccggccatg accgagatcg gcgagcagcc 2460

gtgggggcgg gagttcgccc tgcgcgaccc ggccggcaac tgcgtgcact tcgtggccga 2520

ggagcaggac tgacacgtcc gacggcggcc cacgggtccc aggcctcgga gatccgtccc 2580

ccttttcctt tgtcgatatc atgtaattag ttatgtcacg cttacattca cgccctcccc 2640

ccacatccgc tctaaccgaa aaggaaggag ttagacaacc tgaagtctag gtccctattt 2700

atttttttat agttatgtta gtattaagaa cgttatttat atttcaaatt tttctttttt 2760

ttctgtacag acgcgtgtac gcatgtaaca ttatactgaa aaccttgctt gagaaggttt 2820

tgggacgctc gaaggcttta atttgcaagc tggagaccaa catgtgagca aaaggccagc 2880

aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc 2940

ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat 3000

aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc 3060

cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcaatgct 3120

cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg 3180

aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc 3240

cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga 3300

ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa 3360

ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta 3420

gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc 3480

agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg 3540

acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgcatgag atc 3593

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gaattcatga tagttggtgg ttctg 25

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cgtttcgaaa tagttgttca attgattg 28

<210> 11

<211> 264

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atgaagttca catttgctgc cgttaccgcc gcgctggcct cgtccgccat ggccgctcca 60

gtcaacacta caacagaaga tgaaacggca caaattccgg ctgaagctgt catcggttac 120

tcagatttag aaggggattt cgatgttgct gttttgccat tttccaacag cacaaataac 180

gggttattgt ttataaatac tactattgcc agcattgctg ctaaagaaga aggggtatct 240

ctcgagaaaa gagaggctga agct 264

<210> 12

<211> 258

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

atgaagttct ccaccgccct tctggctctg gccgccgtcg ccaccgccgc tccagtcaac 60

actacaacag aagatgaaac ggcacaaatt ccggctgaag ctgtcatcgg ttactcagat 120

ttagaagggg atttcgatgt tgctgttttg ccattttcca acagcacaaa taacgggtta 180

ttgtttataa atactactat tgccagcatt gctgctaaag aagaaggggt atctctcgag 240

aaaagagagg ctgaagct 258

<210> 13

<211> 255

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

atgaaatctc tattgctgtc gctgctggcg gtcccggcca ccgccgctcc agtcaacact 60

acaacagaag atgaaacggc acaaattccg gctgaagctg tcatcggtta ctcagattta 120

gaaggggatt tcgatgttgc tgttttgcca ttttccaaca gcacaaataa cgggttattg 180

tttataaata ctactattgc cagcattgct gctaaagaag aaggggtatc tctcgagaaa 240

agagaggctg aagct 255

<210> 14

<211> 264

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

atgaagttct cagcggtctc aatcgctgct gccctggcct cgctggtggc agcagctcca 60

gtcaacacta caacagaaga tgaaacggca caaattccgg ctgaagctgt catcggttac 120

tcagatttag aaggggattt cgatgttgct gttttgccat tttccaacag cacaaataac 180

gggttattgt ttataaatac tactattgcc agcattgctg ctaaagaaga aggggtatct 240

ctcgagaaaa gagaggctga agct 264

<210> 15

<211> 267

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

atgaagctgt ctaccattct gtttaccgct tgtgctactc tggctctcgc tctggctgct 60

ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120

tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180

aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240

tctctcgaga aaagagaggc tgaagct 267

<210> 16

<211> 261

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

atgaaggtgc tcgccctgct ggttactgtc tgcttttccg ttgcctcggc tgctccagtc 60

aacactacaa cagaagatga aacggcacaa attccggctg aagctgtcat cggttactca 120

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