一种胶原蛋白与改性壳聚糖接枝共聚物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及日用化工领域，特别涉及一种胶原蛋白与改性壳聚糖接枝共聚物及其制备方法和应用。
背景技术：
：胶原蛋白(collagen，简称a-coll)是一种生物性高分子物质，是人体的一种白色、不透明、无支链的纤维性蛋白质，对人体皮肤、血管、骨骼、筋腱、牙齿和软骨的形成都十分重要，起着支撑、修复、保护三重抗衰老作用。在分子结构上，a-coll是由平行线型链组成，每一线型链由三条扭曲左旋的α-肽链通过链间相互作用紧密结合而形成的一极强的右旋三重螺旋结构，每条α-肽链由多达300个以上的gly-x-y三联体重复构成，x、y分别为氨基酸，两端连接具有不同结构的其它小片段。a-coll是真皮层强有力的后盾，其对皮肤的作用不言而喻，加入护肤类化妆品中，与其它原料配伍性佳，协同效果良好，可以使皮肤中胶原活性增强，有滋润皮肤，延缓衰老、美容消皱、养发护发等功效，因此被广泛应用在生物医药和化妆品等行业中。但随着应用发现，a-coll在使用和保存过程中存在稳定性差的问题，需要另外添加稳定剂或在特定的条件下使用才能勉强维持其高活性，这对于如何更广泛的使用胶原蛋白来说是个亟待解决的问题。提高蛋白稳定性的方法有化学修饰和物理改性，其中糖基化修饰即糖肽接枝反应就是化学修饰的一种，它是蛋白和糖类在较适合的条件下以共价键形式形成较稳定的糖肽共聚物的过程，共聚物中糖链的存在以及其结构的特殊性质将会直接影响共聚物本身的性能。壳聚糖(chitosan，cs)(β(1-4)-2-氨基-2-脱氧-d-葡萄糖)是经甲壳素(n-乙酰-2-氨基-2-脱氧-d-葡萄糖)脱n-乙酰基所得的一种天然高分子聚合物，目前为止壳聚糖是自然界中唯一存在的天然碱性多糖，它与纤维素结构相似也能进行接枝共聚反应，壳聚糖伯羟基、仲羟基和氨基在一定条件下可进行接枝反应。为了改善壳聚糖的溶解性能，扩大其应用范围，通常是对其进行亲水性羧基化改性，得到相应的羧基化壳聚糖衍生物，本专利中也称“改性壳聚糖”(carboxymethylchitosan，cmcs)。cmcs具有良好的物理化学性能及生物学性能，如水溶性、润湿性、乳化性、抑菌性、吸附缓释性、化学稳定性等，从而被广泛应用于食品工业、化妆品及功能材料等领域。技术实现要素：为解决现有技术当中存在的技术问题，本发明将采用化学修饰与物理改性相结合的方法即超声辅助下湿法接枝的方法对a-coll进行定向改造。一、a-coll-cmcs胶原蛋白与改性壳聚糖接枝共聚物(本专利也简写成a-coll-cmcs)是指a-coll(胶原蛋白的简写)与改性壳聚糖(简写为cmcs)在一定条件下发生接枝反应生成的糖肽接枝共聚物，该共聚物不仅解决了高活性a-coll稳定性差的问题，由于cmcs的引入还赋予了其新的优异性能如抑菌性、乳化性、吸水保湿性等，可以更加广泛的应用在生物医药和化妆品等行业中。本发明公开了一种胶原蛋白与改性壳聚糖接枝共聚物，由如下反应合成：一种胶原蛋白与改性壳聚糖接枝共聚物，其特征在于，其结构式如式(ⅲ)，由如下反应合成，式(ⅰ)与式(ⅱ)反应制得：其中，所述peptide1和peptide2均为胶原蛋白的肽链片段。二、技术方案的设计一种胶原蛋白与改性壳聚糖接枝共聚物的制备方法，该接枝共聚物的制备方法包括如下步骤：1)将胶原蛋白与改性壳聚糖在磷酸缓冲液中配成母液，再向配制好的母液中加入nan3，所述胶原蛋白与改性壳聚糖的重量分数比为5-1:1-5，nan3与胶原蛋白的重量分数比为1:20-100，磷酸缓冲液ph值为8-9；2)将已加入nan3的母液在0-4℃温度下水化处理，所述水化处理条件为：密闭环境下，温度为0-4℃，ph为8-9，反应8-12h；3)将母液从0-4℃温度中取出，待母液温度平衡至室温后，将母液置于密闭的超声波仪器中发生美拉德反应，该美拉德反应体系的反应温度为73℃、超声功率为260w、超声处理时间为35min、所述的胶原蛋白浓度为22mg·ml-1；4)反应结束后，对含有母液的样品先进行冷却透析处理，而后进行冷冻干燥，即制得胶原蛋白与改性壳聚糖接枝共聚物，冷冻干燥条件：物料于-4℃--20℃冰箱或液氮中冻结，物料结冰厚度8-15mm，处理时间20-26h。三、a-coll-cmcs的应用a-coll-cmcs产品的配方(重量比例)，包括：a-coll-cmcs为0.01-5.0％；基质辅料为90.0-99.9％。本发明a-coll-cmcs不仅解决了高活性a-coll稳定性差的问题，由于cmcs的引入还赋予了其新的优异性能如抑菌性、乳化性、吸水保湿性等，可以以重量比0.01-5.0％添加到任意化妆品配方中使用，通过添加相关基质辅料还可以做成不同剂型的日化用品，包括但不限于水剂、洗剂、粉剂、片剂、面膜、凝胶、膏霜等。本发明选用牛皮、猪皮、鱼皮、鱼肉、蛙皮或蛙肉来源的胶原蛋白，优选鱼皮和蛙皮胶原蛋白；本发明改性壳聚糖包括酰基化改性、羧基化改性、烷基化改性或季铵化改性得到的改性壳聚糖，优选羧基化改性壳聚糖；本发明提高胶原蛋白稳定性的方法包括化学修饰、物理改性，其中化学修饰包括糖基化修饰(糖肽接枝反应)、烷基化修饰、酰化修饰，本发明优选糖肽接枝反应；其中糖肽接枝反应包括干法接枝反应、湿法接枝反应，本发明优选优化的接枝反应；其中物理改性包括超声、超高压、辐照、高静水压，本发明优选超声处理法；综上本发明提高胶原蛋白稳定性的方法优选化学修饰和物理改性相结合的优化方法。上述的胶原蛋白与改性壳聚糖接枝共聚物的应用，具体的应用方式包括原液、精华、面膜、乳液、洗面乳、沐浴露、沐浴泡腾片或口服液中的任意一种。所述生物医药或化妆品为原液、精华、面膜、乳液、洗面乳、沐浴露、沐浴泡腾片或口服液中的任意一种。作为优选方案，所述的精华包含如下物质：胶原蛋白与改性壳聚糖接枝共聚物、甘油、丁二醇、烟酰胺、蔗糖、泛醇、水杨酸、透明质酸、辛酰羟肟酸、1,2-己二醇、3-o-乙基抗坏血酸、生育酚、红没药醇、羟乙基纤维素、纤维素胶、甘草酸二钾、edta二钠、solubilisantlri。所述solubilisantlri为聚丙二醇-26或丁醇聚醚-26/聚乙二醇-40氢化蓖麻油/水。作为优选方案，所述的面膜包含如下物质：胶原蛋白与改性壳聚糖接枝共聚物、甘油、丁二醇、戊二醇、透明质酸、聚乙二醇-400、甘油聚醚-26、山梨糖醇、卡波姆、羟乙基纤维素、硫辛酸、甘草酸二钾、氢化橄榄油、对羟基苯乙酮、1,2-己二醇、peg-40氢化蓖麻油、三乙醇胺、edta-二钠、香精。作为优选方案，所述的乳液包含如下物质：胶原蛋白与改性壳聚糖接枝共聚物、甘油、丁二醇、异壬酸异壬酯、角鲨烷、甘油聚醚-26、聚二甲基硅氧烷、透明质酸、montanovl、simulgeleg、烟酰胺、生育酚、红没药醇、卡波、三乙醇胺、乙酰壳糖胺、对羟基苯乙酮、1,2-己二醇、edta-二钠、香精。作为优选方案，所述的洗面乳包含如下物质：胶原蛋白与改性壳聚糖接枝共聚物、甘油、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、氢氧化钾、lc、月桂酸、透明质酸、羟苯甲酯、香精、聚乙二醇-14m、edta二钠、瓜儿胶羟丙基三甲基氯化铵。作为优选方案，所述的沐浴露包含如下物质：胶原蛋白与改性壳聚糖接枝共聚物、甲基椰油酰基牛磺酸钠、月桂酰两性基乙酸钠、月桂酰肌氨酸钠、椰油酰胺甲基mea、癸基单油酸甘油酯、聚甘油-10油酸酯、辛酸/癸酸甘油酯类聚甘油-10酯类、peg-120甲基葡糖二油酸酯、椰油酰羟乙磺酸酯钠、月桂基葡糖苷、ms621、透明质酸、聚季铵盐-10、柠檬酸钠、edta二钠、甘油月桂酸酯、柠檬酸、泛醇、脱氢乙酸、苯甲醇、香精。作为优选方案，所述的沐浴泡腾片包含如下物质：胶原蛋白与改性壳聚糖接枝共聚物、柠檬酸、碳酸氢钠、氯化钠、山梨醇、薄荷、聚乙二醇4000、透明质酸、氨基酸起泡剂、苯甲酸钠、乙醇、香精。作为优选方案，所述的口服液包含如下物质：胶原蛋白与改性壳聚糖接枝共聚物、甜橙汁、蓝莓汁、葡萄汁、维生素c、透明质酸、乳糖、麦芽糊精、氨基酸、氯化钠。胶原蛋白是一类蛋白质家族，已至少发现了30余种胶原蛋白链的编码基因，可以形成16种以上的胶原蛋白胶原蛋白的种类及其在组织中的分布，根据其结构，可以分为纤维胶原、基膜胶原、微纤维胶原、锚定胶原、六边网状胶原、非纤维胶原、跨膜胶原等。根据它们在体内的分布和功能特点，可以将胶原分成间质胶原、基底膜胶原和细胞外周胶原。间质型胶原蛋白分子占整个机体胶原的绝大部分，包括ⅰ、ⅱ、ⅲ型胶原蛋白分子，ⅰ型胶原蛋白主要分布于皮肤、肌腱等组织，也是水产品加工废弃物(皮、骨和鳞)含量最多的蛋白质，占全部胶原蛋白含量的80-90％左右，在医学上的应用最为广泛。ⅰ型胶原在鱼类胶原中一个最显著的的特点是热稳定性比较低，并呈现有鱼种的特异性。ⅱ型胶原蛋白由软骨细胞产生；基底膜胶原蛋白通常是指ⅳ型胶原蛋白，其主要分布于基底膜；细胞外周胶原蛋白通常中指ⅴ型胶原蛋白，在结缔组织中大量存在。按功能，可将胶原分为两组，第一组是成纤维胶原，包括第ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅺ、ⅹⅹⅳ和ⅹⅹⅶ型胶原；其余是第二组，非成纤维胶原。非成纤维胶原的α-链既含有三螺旋域(胶原域，col)，还含有非三螺旋域(非胶原域，nc)，其中成纤维胶原约占胶原总数的90％。胶原的热稳定性是指测定其在水系中纤维的热收缩温度(ts)，或溶液中分子的热变性温度(td)。ts和td之差一般在20～25℃，而ts值较td值容易测定。td还可以表示胶原螺旋被破坏的温度，另外还与其亚氨基酸(脯氨酸和羟脯氨酸)的含量有关，尤其是羟脯氨酸含量，它们之间存在正相关，冷水性鱼类的羟脯氨酸含量最低，所以冷水性鱼类胶原蛋白td值明显低于暖水性鱼类，而又都低于陆生动物。但鱼皮胶原蛋白与鱼肉胶原蛋白相比，其真皮的td要比肌肉的低1℃左右，这与肌肉胶原中脯氨酸的羟基化率较真皮胶原高有关。有人测定了多种鱼皮可溶性胶原蛋白的氨基酸组成，并与牛皮的氨基酸组成进行了比较，发现鱼皮胶原蛋白的羟脯氨酸和脯氨酸等亚氨酸含量比牛皮的低。此外，鱼皮明胶与牛皮明胶相比，其固有的粘度、热变性温度均比较低。胶原蛋白的热变性温度可以通过测定胶原蛋白溶液增比黏度的变化来确定。其方法是将胶原蛋白样品溶于一定量的缓冲溶液中，并配制成一定浓度的溶液，然后用乌式黏度计测量溶液在一定温度区间内保持一定时间后的增比黏度，以增比黏度对温度作图，当增比黏度变化50％时所对应的温度即为热变性温度。热变性温度还可通过拉曼光谱和差示扫描量热法等进行测定。有人测得鲈鱼、鲫鱼和鳙鱼鱼皮胶原蛋白的热变性温度分别为25、27和30℃，它们的栖息水温分别为26～27、29和32℃，亚氨基酸含量分别为17.2％、18.1％和18.6％，与3种鱼皮胶原的热变性温度相吻合ⅱ型胶原和ⅺ型胶原ⅱ型胶原由三条α1肽链组成，即[α1(ⅱ)]3，富含羟赖氨酸，并且糖化率高，含糖量可达4％，是软骨中的主要胶原。另外，即使同一生物，皮和骨胶原蛋白的热变形温度也可能不一，像来自日本海鲈、鲐鱼、大头鲨和眼斑鲀的皮胶原蛋白的变性温度为25.0～26.5℃，而骨胶原蛋白的变性温度则为29.5～30.0℃。附带结论是骨胶原蛋白的变性温度范围整体上比皮胶原蛋白的变性温度范围要高。而且骨胶原蛋白和皮胶原蛋白在不同ph时的溶解度不同。这表明皮和骨胶原蛋白的分子特性和构型存在差异。本发明的改性壳聚糖的壳聚糖原材料选自壳聚糖(chitosan，cs)(β(1-4)-2-氨基-2-脱氧-d-葡萄糖)是经甲壳素(n-乙酰-2-氨基-2-脱氧-d-葡萄糖)脱n-乙酰基所得的一种天然高分子聚合物。与现有技术相比，本发明具有的有益效果：本发明得到的共聚物a-coll-cmcs由于共价结合的原因解决了高活性a-coll的稳定性差的问题，同时高分子cmcs的引入还赋予了共聚物a-coll-cmcs新的优异性能如抑菌性、乳化性、吸水保湿性等，使得改性后的共聚物a-coll-cmcs广泛的应用在生物医药和化妆品等行业中。附图说明图1为接枝反应过程中蛋白溶解性的变化；图2为溶液ph对样品溶解度的影响；图3为a-coll-cmcs稳定性的测定结果；图4为rh81％时吸水率与时间的关系；图5为rh32％时吸水率与时间的关系；图6为硅胶环境下保湿率与时间的关系；图7为接枝反应过程中蛋白溶解性和乳化性的变化；图8为溶液ph对样品乳化性的影响；图9为考马斯亮蓝染色聚丙烯酰胺凝胶电泳图；图10为pas反应染色聚丙烯酰胺凝胶电泳图；图11为a-coll(a)的hplc色谱图；图12为a-coll-cmcs(b)的hplc色谱图；图13为a-coll(a)、湿法条件下的a-coll-cmcs(b)和超声条件下的a-coll-cmcs(c)的红外光谱图。具体实施方式为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。试验例1(1)a-coll-cmcs溶解性的测定蛋白的溶解度是肽链骨架上一些极性基团与水分子发生水合作用的结果，能够间接反映蛋白分子结构的变化。一般依据蛋白的分散指数和蛋白中氮的溶解指数来衡量蛋白的溶解度，溶解度是蛋白最重要的功能特性之一。蛋白其他的功能特性则依赖于蛋白的初始溶解性，也就是说，蛋白要有好的功能特性，就必须要有较好的溶解性。实验证明a-coll本身具有很好的溶解性，但a-coll-cmcs共聚物是蛋白的改性产物，所以对其溶解性的研究是研究其功能特性的基础。实验中a-coll-cmcs共聚物的溶解性采用其氮的溶解指数(nsi％)来表示。测定方法：准确称量一定量由本发明方法制得的a-coll-cmcs溶于蒸馏水，配制成浓度为22mg·ml-1的样液，分别在20℃不同ph(2、4、6、6.3、6.5、6.8、7、8、10)条件下1000-2000r·min-1搅拌20-30min，8000-10000r·min-1下离心15-30min。静置一段时间后，取上清液，用凯氏定氮仪测定其中的氮含量。根据样品中蛋白含量和上清液中蛋白含量计算nsi％。(1)、接枝反应过程中蛋白溶解性的变化超声辅助条件下a-coll-cmcs接枝反应的接枝度dg值和蛋白溶解度nsi随反应时间变化的趋势如图1所示：随着接枝反应时间的延长，共聚物a-coll-cmcs的dg值呈现先增加后略有下降的趋势，蛋白nsi值是先下降再增加后趋于平缓的规律。这是由于a-coll本身溶解很好，在反应初期，接枝反应刚开始进行，接枝度不高，a-coll分子中引入了少量的壳聚糖大分子，使得a-coll溶解度降低；随着反应的继续进行，共聚物的接枝度快速增加，共聚物中引入了大量的cmcs糖链，糖链中含有亲水性基团-oh，另一方面超声作用将大分子蛋白分解成小分子肽，从而增加了蛋白的亲水性，同时适当的热处理有助于蛋白溶解度的改善；但到一定的反应时间，共聚物的接枝度达到饱和，亲水性羟基的再引入对蛋白溶解性的增加影响便不太显著，同时随着反应加热时间的延长，也可能会造成部分a-coll分子的聚集以及大分子量分子cmcs的引入会使共聚物的空间位阻变大，因此都会对溶解性产生不良影响。说明当超声辅助接枝反应的时间进行到40min左右时，a-coll-cmcs的接枝度达到最高，而此时反应体系的蛋白溶解度也趋于稳定，达到很高的水平与单独的a-coll分子的溶解度相当，如图1所示。(2)、不同ph下a-coll-cmcs溶解性的分析各样品在不同ph下的nsi如图2所示：共聚物a-coll-cmcs与a-coll相比，在a-coll溶解性不太好的等电点ph6-7范围内有明显的提高；而且a-coll的等电点原为ph6.5-6.8，接枝反应共价结合后，a-coll-cmcs的等电点向酸性移动，大概为ph6.0-6.3；且共聚物a-coll-cmcs的nsi随ph的改变变化并不大，说明a-coll-cmcs并没有明显的等电点，从而减少了因外界环境带来的a-coll-cmcs溶解度降低的问题而造成其性能方面的影响，使a-coll-cmcs有更广泛的应用范围，如图2所示。综上分析，共聚物a-coll-cmcs的溶解度受接枝程度的影响很大，接枝程度越高a-coll-cmcs的溶解性越好，而且接枝反应共价结合后，a-coll-cmcs没有明显的等电点，溶解范围变大，所以其应用领域更为广泛。(2)a-coll-cmcs稳定性的测定蛋白在应用过程中会存在稳定性差的问题，这将严重影响蛋白的活性，是个亟待解决的瓶颈问题。当蛋白在保存、受热或其他条件作用下分子会发生一系列的变化，如蛋白分子之间的聚集，分子结构的变化等，势必影响其活性和功能性。a-coll经改性后得到a-coll-cmcs共聚物，对其稳定性的研究显得非常重要。测定方法：准确称量一定量的a-coll-cmcs溶解在浓度为0.1mol/l的磷酸缓冲溶液(ph8.0)中，配制成浓度为22mg·ml-1的样液，然后对样液加热(30-100℃)1h，冷却至室温后测定a-coll-cmcs的溶解性，将上述样品在ph8.0条件下1000-2000r·min-1搅拌20-30min，8000-10000r·min-1下离心15-30min。静置一段时间后，取上清液，用凯氏定氮仪测定其中的氮含量。根据样品中蛋白含量和上清液中蛋白含量计算nsi％。在ph8.0下样品的稳定性随温度的变化如图3所示：共聚物a-coll-cmcs溶解度随温度的升高并没有太大变化，即使是在较高的温度下a-coll-cmcs仍保持较好的溶解性，而a-coll溶解度随温度的升高下降的非常明显，说明接枝改性后的a-coll-cmcs稳定性更好。这是因为随着亲水性羟基糖链的引入，蛋白中所带的净负电荷数量增加，提高了蛋白的空间位阻和静电排斥作用，使得共聚物在高温下不易凝聚，从而提高了共聚物的稳定性能；超声波作为一种重要的物理手段和工具，被高效的用来把能量引入到反应过程或反应物中，这种处理不仅能够加快反应的速度，提高反应的产率，还能完成许多不能发生的化学反应，使得超声处理下的接枝共聚物比湿法条件下的接枝共聚物更加稳定，说明超声处理对样品的性能更有利；此外，温度对蛋白的稳定性有显著影响，当温度达到一定程度时a-coll会变性，而接枝改性后的a-coll-cmcs却没有明显的变性温度。(3)a-coll-cmcs吸水保湿性的测定a、吸水性实验取两个洁净的干燥器，一个里面倒入饱和氯化镁水溶液，即为相对湿度(rh)33％的干燥器环境；另一个倒入饱和硫酸铵水溶液，即为相对湿度(rh)81％的干燥器环境。将二者放入20±0.1℃的恒温培养箱内，分别准确称量1.0g的样品于干净培养皿中，将培养皿放入干燥器中，同时做若干平行样，在2、4、6、8、24h时间点取出，分别测得样品放置前质量(w0)和放置后的质量(w1)。吸水率(ra)＝(w1-w0)/w0×100％b、保湿性实验用蒸馏水将样品稀释至10％，各准确称取5.0g于洁净培养皿中，将培养皿置于两个干燥器中，放置时间为6、12、24、36、48、60、72h，分别测得样品放置前质量(h0)和放置后的质量(h1)。保湿率(rr)＝(h0-h1)/h0×100％经实验数据处理后，a-coll-cmcs和a-coll的样品经48h后的吸水率和保湿率列于表1。由表1可以看出，a-coll-cmcs与a-coll相比，吸水性和保湿性都有较大幅度的提高。表148h后a-coll-cmcs和a-coll的吸水率和保湿率：图4、图5是相对湿度为8l％和32％环境下各样品吸水率和保湿率随时间变化的结果。由图中可以看出，在相对湿度为81％和32％环境中，a-coll-cmcs的吸水率大于a-coll，尤其是在低rh下，a-coll-cmcs的吸水率是a-coll的4倍。这是由于亲水性基团糖基的引入使得共聚物a-coll-cmcs分子中的氢键作用被削弱，使得蛋白的有序结构发生改变，蛋白分子呈现出松散的状态，这种状态可以于水分子充分接近，使得蛋白分子内的亲水性基团-oh和-cooh等与水分子形成分子间氢键，因此共聚物a-coll-cmcs表现为较好的吸水性。还可以看出随着实验时间的延长，各样品的吸水率都会逐渐增加，在最初10h内样品的吸水率增加幅度相对较快，当实验24h后两者的吸水率基本可以达到相对饱和的状态，放置到48h后仍有一定的吸水能力。同时由图4、图5比较结果可以看出，实验环境的湿度越大，样品的吸水率也就越大；同时，当样品的吸水率越大时，其吸水率受到环境湿度的影响也就越大。图6是a-coll-cmcs和a-coll在硅胶干燥环境中的保湿率随时间变化的结果。从图中可以看出a-coll-cmcs和a-coll都具有良好的保湿性，其中a-coll-cmcs的保湿性略优于a-coll，在实验的开始阶段，样品的失水速度表现的都很快，但随着实验时间的延长，样品的失水速度开始减缓，并慢慢趋于稳定。综上可知，a-coll-cmc具有优异的吸水保湿性，经接枝改性后的a-coll-cmc的吸水性能和保湿性能均大大提高，所以a-coll-cmc更有利于应用在医药和化妆品等领域做补水保湿成分使用。(4)a-coll-cmcs乳化性的测定测定方法：准确称量一定量的a-coll-cmc溶解在浓度为0.1mol/l的磷酸缓冲溶液(ph8.0)中，1000-2000r·min-1搅拌20-30min配制成浓度为22mg·ml-1的样液。取10ml上述样液加入均质机中，再加入5ml大豆油，在转速6000-8000r·min-1的条件下均质3-5min后，在8000-10000r·min-1条件下离心10-30min。同样方法，取10ml上述样液加入均质机中，再加入5ml大豆油，在转速6000-8000r·min-1的条件下均质3-5min后，加热20-30min后在8000-10000r·min-1条件下离心10-30min。乳化活性(eai)及乳化稳定性(esi)的计算公式如下：乳化活性(eai)＝离心管中乳化层的高度/离心管中液体的总高度×100％乳化稳定性(esi)＝加热后离心管中乳化层的高度/离心管中液体的总高度×100％a、接枝反应过程中改性蛋白乳化性的变化超声辅助条件下a-coll-cmcs接枝反应的接枝度dg值、蛋白溶解度nsi和乳化性能随反应时间变化的趋势如图7所示：随着接枝反应时间的延长，共聚物a-coll-cmcs的接枝度dg值呈现先增加后略有下降的趋势，其溶解度nsi值是先下降再增加后趋于平缓的规律，乳化活性eai和乳化稳定性esi都呈现出先增加后减少的变化趋势；共聚物a-coll-cmcs的乳化活性eai在接枝反应的dg值达到45％左右、蛋白溶解度nsi为80％左右时达到最大；随着反应时间的推移，蛋白与糖接枝后溶解性得到改善，多糖的引入使得分子间的空间位阻加大，同时接枝物中蛋白分子片段侧链具有一定的疏水性，使得接枝物能够快速且紧密的吸附在油水界面上，从而提高了共聚物a-coll-cmcs的eai，当过量的糖分子存在时就会阻碍a-coll在界面的吸收和内部的展开，所以a-coll-cmcs的eai也会有所影响；随着反应的进行，糖量的增加，a-coll所带的净电荷增多，蛋白空间位阻和静电排斥作用增加，使其不易聚集，乳化形成的保护层厚度增加，乳化稳定性esi也得到一定程度的改善，同时糖的引入也增加了界面膜的机械强度，改善了体系的粘弹性。b、不同ph下a-coll-cmcs乳化活性的分析各样品在不同ph下的乳化活性如图8所示：共聚物a-coll-cmcs与a-coll相比，乳化活性eai在ph6-7的范围内有明显的提高；a-coll在其等电点ph6.5-6.8的乳化活性很低，经过共价结合改性后的a-coll-cmcs的乳化活性在其等电点ph6.0-6.3降低的不明显，这是因为共聚物a-coll-cmcs的溶解性在其等电点ph6.0-6.3仍较高，研究表明蛋白溶解度较低时其乳化活性主要取决于其溶解度；超声辅助条件下得到的共聚物的乳化活性高于湿法条件下得到的共聚物，这与超声辅助下对a-coll-cmcs结构的影响有关，一定程度上增加了a-coll-cmcs的乳化活性。综上分析，共价接枝后的lwt-cmcs由于没有明显的等电点，溶解性得到改善，所以具有更加优越的乳化活性和乳化稳定性。综上分析，共聚物a-coll-cmcs的乳化性受接枝程度的影响很大，接枝程度越高a-coll-cmcs的乳化性越好，而且接枝反应共价结合后，a-coll-cmcs没有明显的等电点，溶解性得到改善，溶解范围变大，也使得a-coll-cmcs具有优越的乳化活性和乳化稳定性，所以其在医药和化妆品等领域具有更加广泛的使用前景。(5)a-coll-cmcs抑菌性的测定取临床分离菌株大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、白色念珠菌少许，分别接种于肉汤培养基中，于37℃下培养18h。(绿脓杆菌肉汤培养基中添加20％的小牛血清)取18h培养的各菌株营养肉汤培养物，将其制成菌悬液用于实验。分别取灭菌试管11支，第1支加入营养肉汤液体培养基9ml，第2-10支加入5ml营养肉汤液体培养基，第11支加入10ml营养肉汤液体培养基，分别取样品溶液1ml加入第1支试管，混合均匀后取5ml加入第2支，依次稀释至第10支，第11支不加样品做为对照。每管加入大肠杆菌悬液0.1ml，37℃的温度下培养24h，取出观察细菌生长情况。金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、白色念珠菌同上述实验观察生长情况。如试管变浑浊，即表示细菌生长，样品无抑菌作用；如试管清亮则表示细菌生长受到抑制。不同原液浓度抑菌实验结果如表2所示，本发明a-coll-cmcs对临床分离菌株大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、白色念珠菌均有较强的抑菌作用。表2各样品溶液对应抑菌试验中最后清亮的试管编号大肠杆菌金黄色葡萄球菌绿脓杆菌白色念珠菌0.01％原液----0.1％原液1--11.0％原液32242.0％原液43255.0％原液6547对照组----注：“-”表示未清亮。将按照一定比例稀释后的上述清亮的肉汤试管和对照组转种肉汤琼脂平板，观察24h，无细菌生长的最小浓度即为杀菌浓度，记为c，单位为mg/ml，结果如表3所示，说明本发明a-coll-cmcs对临床分离常见的皮肤致病菌株大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、白色念珠菌均有较强的杀菌作用，从而起到预防和调理皮肤不适的作用。表3各样品溶液杀菌情况c(大肠杆菌)c(金黄色葡萄球菌)c(绿脓杆菌)c(白色念珠菌)0.01％原液----0.1％原液8.26--9.101.0％原液1.633.114.201.122.0％原液1.131.902.550.905.0％原液0.230.410.660.12对照组----注：“-”表示无杀菌性。试验例2a-coll-cmcs的表征分析(1)氨基酸分析本实验通过柱前衍生对样品中的氨基酸进行了测定，该测定方法被称为反相高效液相色谱(rp—hplc)法。检测器：紫外-可见光检测器；色谱柱：4.6×250mm，5μm；流动相a：0.1mol/l醋酸钠溶液(ph6.5)：乙腈＝93：7；流动相b：水-乙腈＝20：80；检测波长：254nm；柱温：43℃；流速：1.0ml/min；进样量：10μl。样液：准确称量1.0g样品(由本实验方法所得)，超纯水定容25ml，超声处理30min。衍生化试剂：1.0mol/l三乙胺乙腈溶液；0.1mol/l异硫氰酸苯酯乙腈溶液。衍生化过程：准确量取200μl样液，依次分别加入100μl浓度为0.1mol/l异硫氰酸苯酯乙腈溶液、100μl浓度为1.0mol/l三乙胺乙腈溶液，摇匀，静置处理1.5h，再分别加入400μl正己烷，摇匀，静置处理15min，吸取下层溶液，用0.45微孔滤膜过滤，进样10μl，a-coll与a-coll-cmcs中氨基酸含量变化如表4所示。结果与分析：a-coll-cmcs的接枝反应主要发生在蛋白分子中的自由氨基与糖分子的羰基之间，随着反应的进行这两种基团逐渐减少。研究发现，蛋白与糖进行接枝反应后，反应物中赖氨酸和精氨酸的含量会发生明显的降低，若蛋白质发生了共聚反应，反应物的颜色会发生明显得变化。表4样品中氨基酸的含量氨基酸a-coll(％)a-coll-cmcs(％)天冬氨酸6.217.14谷氨酸14.8715.60丝氨酸5.235.57甘氨酸11.0811.20组氨酸2.402.80精氨酸5.934.11苏氨酸3.876.20丙氨酸6.456.45脯氨酸4.714.50半胱氨酸2.151.95缬氨酸2.592.23蛋氨酸1.971.84异亮氨酸4.073.65亮氨酸7.588.12酪氨酸2.872.91苯丙氨酸3.702.81赖氨酸8.526.12样品a-coll-cmcs和a-coll经过rp-hplc确定的氨基酸含量如表4所示：通过氨基酸分析，并对其相对含量进行计算，发现共聚物a-coll-cmcs中赖氨酸、精氨酸的含量明显减少，这是由于赖氨酸与精氨酸的侧链上存在自由氨基，能够与糖链上的羰基发生反应，所以相对含量减少，也说明了a-coll改性的发生。(2)sds–page分析聚丙烯酰氨凝胶电泳(sds–page)可用于对蛋白分子量以及亚基含量进行分析等。本研究中，a-coll与糖进行反应后，分子量发生了变化，使用考马斯亮蓝染液对蛋白进行染色，可以直观的看到蛋白分子量的分布和变化；再根据pas能够与a-coll-cmcs中的多糖分子发生颜色反应，从而可以检测出共聚物中多糖分子的存在。样品缓冲液是由3.0ml10％sds、1.5ml1％溴酚蓝溶液、2.0ml0.2％dtt、1.5ml80％甘油、1.0mltris-hcl缓冲溶液(ph6.7)、1.0ml超纯水一起组成的。将各样品配制成一定浓度后超声处理30min，在4000r/min条件下离心10min，再取其上清液，与样品缓冲溶液按照4:1的比例混匀，备用。考马斯亮蓝染色(如图9所示)、pas反应染色(如图10所示)。如图9所示，共聚物a-coll-cmcs与a-coll相比，电泳图谱上基本看不到亚基的谱带，这是因为考马斯亮蓝通常在酸性条件下能够与蛋白分子上的自由氨基等非共价结合，呈现颜色反应。当接枝反应发生时，a-coll-cmcs中的自由氨基减少，减少了考马斯亮蓝与蛋白的非共价结合，使得凝胶电泳用考马斯亮蓝染色时显色反应减弱，这也间接证明了a-coll与cmcs是以共价结合的方式进行接枝反应的，而这种共价结合的方式可以显著增加改性蛋白的稳定性。图10所示，共聚物a-coll-cmcs与a-coll相比，糖基红色谱带更明显，而且位于分离胶与浓缩胶交界处向下延伸。研究发现这是由于cmcs为多糖，分子量较大，a-coll与cmcs共价结合后，其分子量显著增大，导致在电泳图上高分子量区出现谱带。由此证明，a-coll-cmcs是以共价结合的方式在a-coll分子中引入大分子cmcs，实现蛋白的改性，从而提高共聚物的稳定性并赋予其更多的优异性能。(3)高效液相色谱检测本实验采用hplc对a-coll-cmcs和a-coll样品进行检测。色谱条件如下：检测器：紫外-可见光检测器；色谱柱：c18，250×4.6；流动相：乙腈：水：三氟乙酸＝20：80：0.1；波长：220nm；流速：1ml/min；柱温：30℃；浓度：1mg/ml；进样量：15-30μl。将制备出的a-coll-cmcs和a-coll样品分别用双蒸水溶解，配制成1mg/ml的样液，经过0.45微孔滤膜过滤后即可进样，得到样液的hplc图谱，并对其进行分析。a-coll(a)的hplc色谱图(如图11所示)、超声条件下的a-coll-cmcs(b)的hplc色谱图(如图12所示)。由图11可以看出，a-coll样品的保留时间跨度在1min左右，峰形较好，表明a-coll中相近分子量肽段较为集中，且分子量差别不大；由图12可以看出经接枝反应后样品的保留时间跨度超过1min，共聚物a-coll-cmcs的分子量增加，这是因为引入了糖链，而且共聚物a-coll-cmcs中cmcs为多糖，分子量比较大，与a-coll发生接枝反应后，a-coll亚基分子量显著增加，在hplc色谱图上出现峰形，这与上述sds–page所得结果一致。(4)红外光谱检测用傅立叶红外光谱仪对a-coll-cmcs和a-coll粉末进行红外测试，采用kbr压片法，扫描范围4000cm-1-500cm-1。将干燥的a-coll(a)、湿法条件下的a-coll-cmcs(b)和超声处理下的a-coll-cmcs(c)样品分别与溴化钾混合，在玛瑙研钵中研磨均匀并压成薄片，在4000～500cm-1波长范围内进行红外光谱扫描，观察谱峰情况。a-coll(a)、湿法条件下的a-coll-cmcs(b)和超声条件下的a-coll-cmcs(c)的红外光谱图(如图13所示)。红外图谱解析如下：当蛋白以共价方式结合糖分子后，一个十分典型的特征是蛋白分子中的羟基数会显著增加，在红外图谱上的具体体现是在3700cm-1-3200cm-1处出现峰及在1500cm-1-1000cm-1处出现吸收。图为a-coll与其接枝共聚物a-coll-cmcs的ftir图谱，从中可以看出共聚物在3700cm-1-3200cm-1及1500cm-1-1000cm-1处的吸收均较强于a-coll，尤其是超声辅助处理的a-coll-cmcs共聚物，在1500cm-1-1000cm-1处有很强的吸收。由此可确定，a-coll-cmcs是以共价结合的方式在a-coll分子中引入大分子cmcs，实现蛋白的改性，从而提高共聚物的稳定性并赋予其更多的优异性能。(5)数据处理试验重复3～5次，所有数据使用excel软件和designexpert软件进行处理。试验例3上述的胶原蛋白与改性壳聚糖接枝共聚物的应用实施例1a-coll-cmcs原液(重量比例)a-coll-cmcs0.01％，加去离子水至100％。实施例2a-coll-cmcs精华(重量比例)a-coll-cmcs5.0％、甘油4.0％、丁二醇3.0％、烟酰胺3.0％、蔗糖2.0％、泛醇1.5％、水杨酸1.0％、透明质酸1.0％、辛酰羟肟酸0.7％、1,2-己二醇0.3％、3-o-乙基抗坏血酸0.3％、生育酚0.5％、红没药醇0.1％、羟乙基纤维素0.2％、纤维素胶0.4％、甘草酸二钾0.05％、edta二钠0.05％、solubilisantlri5.0％，加去离子水至100％。实施例3a-coll-cmcs面膜(重量比例)a-coll-cmcs1.0％、甘油5.0％、丁二醇3.0％、戊二醇1.5％、透明质酸1.0％、聚乙二醇-4001.0％、甘油聚醚-261.0％、山梨糖醇0.2％、卡波姆0.15％、羟乙基纤维素0.08％、硫辛酸0.01％、甘草酸二钾0.1％、氢化橄榄油0.1％、对羟基苯乙酮0.3％、1,2-己二醇0.3％、peg-40氢化蓖麻油0.1％、三乙醇胺0.14％、edta-二钠0.05％、香精0.01％，加去离子水至100％。实施例4a-coll-cmcs乳液(重量比例)a-coll-cmcs3.0％、甘油5.0％、丁二醇3.0％、异壬酸异壬酯4.0％、角鲨烷2.0％、甘油聚醚-261.0％、聚二甲基硅氧烷1.0％、透明质酸1.0％、montanovl0.6％、simulgeleg0.5％、烟酰胺0.5％、生育酚0.1％、红没药醇0.2％、卡波0.18％、三乙醇胺0.14％、乙酰壳糖胺0.1％、对羟基苯乙酮0.3％、1,2-己二醇0.3％、edta-二钠0.05％、香精0.02％，加去离子水至100％。实施例5a-coll-cmcs洗面乳(重量比例)a-coll-cmcs0.1％、甘油25.0％、肉豆蔻酸17.0％、棕榈酸7.5％、硬脂酸7.3％、氢氧化钾7.2％、lc3.0％、月桂酸2.0％、透明质酸1.0％、羟苯甲酯0.2％、香精0.5％、聚乙二醇-14m0.1％、edta二钠0.1％、瓜儿胶羟丙基三甲基氯化铵0.07％，加去离子水至100％。实施例6a-coll-cmcs沐浴露(重量比例)a-coll-cmcs0.5％、甲基椰油酰基牛磺酸钠6.0％、月桂酰两性基乙酸钠6.0％、月桂酰肌氨酸钠5.0％、椰油酰胺甲基mea3.0％、癸基单油酸甘油酯2.0％、聚甘油-10油酸酯2.0％、辛酸/癸酸甘油酯类聚甘油-10酯类2.0％、peg-120甲基葡糖二油酸酯1.5％、椰油酰羟乙磺酸酯钠1.0％、月桂基葡糖苷1.0％、ms6211.0％、透明质酸1.0％、聚季铵盐-100.4％、柠檬酸钠0.1％、edta二钠0.1％、甘油月桂酸酯0.3％、柠檬酸0.3％、泛醇0.5％、脱氢乙酸0.5％、苯甲醇0.3％、香精0.25％，加去离子水至100％。实施例7a-coll-cmcs沐浴泡腾片(重量比例)a-coll-cmcs1.5％、柠檬酸20.0％、碳酸氢钠20.0％、氯化钠8.5.％、山梨醇8.0％、薄荷5.0％、聚乙二醇40002.0％、透明质酸1.0％、氨基酸起泡剂5.0％、苯甲酸钠0.5％、乙醇0.5％、香精0.5％。实施例8a-coll-cmcs口服液(重量比例)a-coll-cmcs2.0％、甜橙汁5.0％、蓝莓汁2.0％、葡萄汁2.0％、维生素c1.0％、透明质酸1.0％、乳糖0.2％、麦芽糊精0.2％、氨基酸0.1％、氯化钠0.1％，加去离子水至100％。以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利保护范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的
技术领域：
，均同理包括在本发明的专利保护范围内。当前第1页12