本发明属于dna提取技术领域，具体涉及一种利用二乙酰胺四乙酸钠对骨骼或牙齿进行dna提取的方法。
背景技术：
在骨骼、牙齿等生物样本中，含有大量的金属钙元素成分，由于大量钙化合物的存在，使得dna提取过程中，溶液很难进入到骨头、牙齿内部，从而阻止了对骨头、牙齿内部细胞的裂解消化。同时也是由于钙化合物的存在，使得其内部的细胞或dna更能耐受微生物的分解，因此，在法医dna领域或古生物领域，骨骼或牙齿经常成为唯一有可能用于dna提取的样本。
金属螯合剂(metalchelatingagent)可以通过螯合剂分子与金属离子的强结合作用，将金属离子包合到螯合剂内部，变成稳定的，分子量更大的化合物，从而阻止金属离子起作用。金属螯合剂种类繁多，作用能力各有差异，现有技术中，金属螯合剂edta在骨骼、牙齿等生物样本的dna提取中被广泛使用，本发明提供一种利用二乙酰胺四乙酸钠对骨骼或牙齿进行dna提取的方法，该发明方法使用了螯合能力更强的金属螯合剂乙二酰胺四乙酸钠。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供了一种利用二乙酰胺四乙酸钠对骨骼或牙齿进行dna提取的方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
利用二乙酰胺四乙酸钠对骨骼或牙齿进行dna提取的方法，包含以下操作步骤：
(1)将300mg骨骼粉末或牙齿粉末放入离心管中，往其中加入500ul裂解液，于50-60℃条件下加热裂解1-12小时；
(2)将步骤(1)中的离心管置于离心机中，以12000转每分钟的速度离心1-5分钟，将上清液转移至新的离心管中，加入750ul结合液并混合均匀；
(3)将步骤(2)新的离心管中的混合液转移至离心柱中，将离心柱置于离心机中，以12000转每分钟的速度离心0.5-2分钟；
(4)倒弃步骤(3)离心柱收集管中的液体，将离心柱放回离心柱收集管内，往离心柱中加入700ul漂洗液，于离心机中12000转每分离心0.5-2分钟；
(5)倒弃步骤(4)离心柱收集管中的液体，将离心柱放回离心柱收集管内，于离心机中12000转每分离心2-5分钟；
(6)将步骤(5)离心柱放入新的离心管内，往离心柱底部的硅胶膜中加入10-200ul洗脱液，静置3-10分钟，于离心机中以12000转每分钟的速度离心0.5-2分钟，丢弃离心柱，离心管内液体即为dna溶液。
进一步，步骤(1)所述裂解液包含:10-500mmol/l二乙酰胺四乙酸钠、0.1-2％(w/v)十二烷基硫酸钠、0.1-5mg/l蛋白酶k、0-0.1mol/l二硫苏糖醇、5-100mmol/l三羟甲基氨基甲烷,ph值7.0-8.5。
进一步，步骤(2)所述结合液包含：40％-60％(w/v)异硫氰酸胍、8-18％(w/v)曲拉通x-100、50-200mmol/l柠檬酸钠，ph值5.0-6.0。
进一步，步骤(3)所述离心柱为分子生物学实验中常用耗材，其底部装配有硅胶膜。
进一步，步骤(4)所述漂洗液为70-85％(v/v)乙醇。
进一步，步骤(6)所述洗脱液包含10mmol/l三羟甲基氨基甲烷、1mmol/l乙二胺四乙酸二钠，ph8.0。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种利用二乙酰胺四乙酸钠对骨骼或牙齿进行dna提取的方法，利用裂解液中的二乙酰胺四乙酸钠成分对骨骼或牙齿中的钙质成分的螯合作用，对骨骼或牙齿进行脱钙，然后利用裂解液中的表面活性剂及蛋白酶k成分对骨骼或牙齿中的细胞膜及蛋白质进行裂解消化，释放dna成分，最后经过一系列的分离、漂洗、洗脱步骤，提取得到dna；与现有技术方法相比，本发明提取方法裂解液中的乙二酰胺四乙酸钠成分对骨骼或牙齿中的钙成分具有更强的螯合作用，能更加高效快速地对骨骼或牙齿进行脱钙，提高了dna提取得率的同时还缩短了提取时间。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明为一种利用二乙酰胺四乙酸钠对骨骼或牙齿进行dna提取的方法，具体包括以下步骤：
(1)将骨骼或牙齿粉碎成粉末，取300mg放入离心管内，往其中加入500ul裂解液，于56℃条件下加热裂解6小时；
所述的裂解液为：100mmol/l二乙酰胺四乙酸钠、1％(w/v)十二烷基硫酸钠、0.5mg/l蛋白酶k、0.01mol/l二硫苏糖醇、20mmol/l三羟甲基氨基甲烷、ph值7.5；
(2)将步骤(1)中的离心管置于离心机中，以12000转每分钟的速度离心5分钟，将上清液转移至新的离心管中，加入750ul结合液并混合均匀；
所述的结合液为：55％(w/v)异硫氰酸胍、10％(w/v)曲拉通x-100、100mmol/l柠檬酸钠、ph值5.5；
(3)将步骤(2)新的离心管中的混合液转移至离心柱中，将离心柱置于离心机中，以12000转每分钟的速度离心0.5-2分钟；
所述离心柱为分子生物学实验中常用耗材，其底部装配了硅胶膜；
(4)倒弃步骤(3)离心柱收集管中的液体，将离心柱放回离心柱收集管内，往离心柱中加入700ul漂洗液，置于离心机中以12000转每分的速度离心0.5-2分钟；
所述的漂洗液为：80％(v/v)乙醇；
(5)倒弃步骤(4)离心柱收集管中的液体，将离心柱放回离心柱收集管内，于离心机中12000转每分离心2-5分钟；
(6)将步骤(5)离心柱放入新的离心管内，往离心柱底部的硅胶膜中加入20ul洗脱液，静置3-10分钟，于离心机中12000转每分离心0.5-2分钟，丢弃离心柱，离心管内液体即为dna溶液。
洗脱液：10mmol/l三羟甲基氨基甲烷、1mmol/l乙二胺四乙酸二钠，ph8.0；
用invitrogenqubit4型荧光定量仪(thermofisher公司)以及qubitdsdnabr检测试剂盒(thermofisher公司)，对上述方法提取所得的骨骼dna及牙齿dna进行浓度测定，并计算获取的dna总量，如表一所示。
对比例1
现有方法提供的实际配方，
裂解液：ph8.5tris-hcl，10mm；
edta，15mm；
sds，1.5％；
nacl，150mm；
蛋白酶k，0.5mg/ml。
其余试剂及耗材：异丙醇，dna离心柱，去蛋白液，dna漂洗液，无水乙醇等。
操作步骤：
(操作前，预先在漂洗液中加入3倍体积的无水乙醇)
(1)将骨骼或牙齿粉碎，并称取300mg放入离心管中，加入300ul的裂解液，55℃孵育12-16h；
(2)12000rpm离心10min，取250ul上清液入新ep管，加入250ul异丙醇(1:1)，轻轻混匀后4℃静置10min；
(3)轻轻吹打混合液，并将混合液转移至离心柱，12000rpm离心1min，弃收集管内的液体；
(4)加入500ul去蛋白液，12000rpm离心1min，弃收集管内废液；
(5)加入600ul的漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液，并重复一次操作；
(6)打开盖子，室温风干10–15min；
(7)加入75℃预热的去离子水50ul洗脱dna；
(8)将收集的dna液加入离心柱内，再次洗脱,即得到dna溶液；
用invitrogenqubit4型荧光定量仪(thermofisher公司)以及qubitdsdnabr检测试剂盒(thermofisher公司)，对上述方法提取所得的骨骼dna及牙齿dna进行浓度测定，并计算获取的dna总量，如表一所示。
表1.dna浓度测定表
通过对比本发明方法与现有方法，针对相同样本所提取的dna总量以及提取所需时间，由表一可知，本发明方法提取的dna总量更多，且提取所需要的时间更短。
以上内容仅仅是对本发明的构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。