一株米曲霉菌株及其应用的制作方法

本发明属于微生物领域，具体涉及一株米曲霉菌株及其应用。

背景技术：

非淀粉多糖(non-starchpolysaccharides，nsp)是植物组织中由多种单糖和糖醛酸经糖苷键连接而成，大多为有分支的链状结构，常与无机离子和蛋白质结合在一起，是细胞壁的主要成分，一般难于被单胃动物分泌的消化酶所水解。常见饲料中的非淀粉多糖主要是阿拉伯木聚糖、β-葡聚糖和纤维素。玉米和高粱中含有少量的非淀粉多糖，燕麦和大麦中的水溶性非淀粉多糖主要是β-葡聚糖。谷物中含有少量果胶多糖，除大米外，其他植物中均未发现。谷物副产品含有大量的细胞壁成分，如米糠含有大约20％-25％的非淀粉多糖，主要是等量的阿拉伯木聚糖和纤维素。

非淀粉多糖酶则以多种糖苷酶为主体，通过消除饲料中的非淀粉多糖的抗营养作用，提高动物对饲料养分的利用率，当这些酶活性的适合比例与饲料中非淀粉多糖组成一致时，可获得最佳的使用效果。非淀粉多糖酶包括纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、β-甘露聚糖酶、果胶酶等。

木聚糖酶是木聚糖的专一降解酶，属于水解酶类，包括内切木聚糖酶、外切木聚糖酶和木糖苷酶三种。国内外关于木霉、曲霉、细菌产木聚糖酶能力的研究较多，现在商业化的产木聚糖酶的菌株主要是木霉和曲霉属。

β-葡聚糖酶能降解β-葡聚糖分子中的β-1，3和β-1，4糖苷链，使之降解为小分子，失去亲水性和粘性，改变单胃动物肠道内容物的特性、消化酶的活性、肠道微生物的作用环境等。分泌β-葡聚糖酶的微生物，一类是细菌，另一类是真菌，真菌以霉菌为主，主要有康氏木霉、里氏木霉、拟氏木霉、绿色木霉、米曲霉、冻土毛霉、黑曲霉等。

纤维素酶可破解富含纤维的细胞壁，使其包含的蛋白质、淀粉等营养物质释放出来并加以利用，同时又可将纤维降解为可被畜禽机体消化吸收的还原糖，从而提高饲料利用率。产生纤维素酶的微生物研究较多的是真菌，对细菌和放线菌研究很少。当前用来生产纤维素酶的微生物主要是木霉、黑曲霉、青霉和根霉，此外，漆斑霉、反当动物瘤胃菌、嗜纤维菌、产黄纤维单抱菌、侧抱菌、粘细菌、梭状芽抱杆菌等也能产生纤维素酶。

非淀粉多糖酶的生产主要通过生物发酵法，目前人们寻找的能产生各种非淀粉多糖酶的菌株有绿色木霉、红色木霉、黑曲霉和索状青霉等。其中针对产生纤维素酶的微生物研究较多的是真菌，对细菌和放线菌研究很少，当前用来生产纤维素酶的微生物主要是木霉、黑曲霉、青霉和根霉。国内外关于木霉、曲霉、细菌产木聚糖酶能力的研究较多，现在商业化的产木聚糖酶的菌株主要是木霉和曲霉属。分泌β-葡聚糖酶的微生物，一类是细菌，以芽孢杆菌为主，主要有枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等；另一类是真菌，以霉菌为主，主要有康氏木霉、里氏木霉、拟氏木霉、绿色木霉、米曲霉、冻土毛霉、黑曲霉等。

我国主要能量饲料资源短缺，而非淀粉多糖极大的限制了谷物及其副产品在饲料中的应用，因此急需针对不同饲粮背景开发高产的非淀粉多糖酶菌株，降低非淀粉多糖酶应用于饲料工业的成本，有效缓解资源短缺问题。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一株米曲霉菌株及其应用。本发明的米曲霉经过紫外诱变筛选再硫酸二乙脂(des)诱变的方法获得了一株具有高产非淀粉多糖酶的米曲霉突变菌，具有大幅度提高非淀粉多糖酶的表达量，可以广泛的应用于非淀粉多糖酶的生产，并且可应用在饲用饲料中。

本发明的一株米曲霉，命名为米曲霉(aspergillusoryzae)xms01，cctccno：m2018425；保藏地点为：中国，武汉，武汉大学；中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2018年07月02日。

得到的米曲霉，该菌株在pda培养基生长良好；菌落生长较快，质地疏松，初白色、黄色，后变为褐色至淡绿色；分生孢子头放射状，也有少数为疏松柱状，在ph4-6.5、20℃-30℃的环境下都能够生长。

本发明还提供了所述米曲霉的应用，所述米曲霉(aspergillusoryzae)xms01在发酵高产非淀粉多糖酶的生产中的应用。

如上所述的米曲霉的应用，所述非淀粉多糖酶为木聚糖酶、β-葡聚糖和纤维素酶中的一种或一种以上的混合物。

本发明还提供了一种生产非淀粉多糖酶的发酵方法，以如权利要求1所述的米曲霉为发酵菌株。

如上所述的发酵方法，所述发酵方法包括摇瓶发酵和发酵罐发酵；

所述发酵方法的米曲霉(aspergillusoryzae)xms01发酵产酶的培养基配方为：葡萄糖15-20g/l或甘油5-10g/l、酵母膏1-10g/l、蛋白胨1-10g/l、(nh4)2so41-10g/l、k2hpo48-12g/l、kh2po44.5-5g/l、nacl0.1-0.5g/l、feso4·7h2o0.05-0.10g/l、mgso4·7h202-5g/l、mnso40.02-0.05g/l、znso4·7h2o0.02-0.05g/l、cocl20.02g/l。

优选地，所述发酵罐发酵的过程中在进入诱导期以恒溶氧条件下流加甘油方式控制发酵罐内溶氧量为40％。

优选地，所述发酵方法的米曲霉(aspergillusoryzae)xms01在发酵罐发酵产酶的培养基的培养条件为：发酵培养基初始ph＝5.5，培养温度为28℃，液体种子种龄为24h，接种量为10％，生长期溶氧量控制为25％、诱导期溶氧量控制为40％。

有益效果：

出发菌株是本实验室保存的一株米曲霉菌，出发菌株米曲霉发酵上清液中木聚糖酶酶活40.2u/ml，β-葡聚糖酶活12.4u/ml，纤维素酶酶活16.3u/ml。本发明的米曲霉(aspergillusoryzae)xms01经过摇瓶发酵的上清液中木聚糖酶酶活200u/ml，比出发菌株提高了397.5％，β-葡聚糖酶活46u/ml，比出发菌株提高了271.1％，纤维素酶酶活59.3u/ml，比出发菌株提高了263.8％，

本发明的米曲霉(aspergillusoryzae)xms01经过发酵罐发酵的上清液中木聚糖酶酶活250.6u/ml，比出发菌株提高了523.3％，β-葡聚糖酶活67.0u/ml，比出发菌株提高了440.3％，纤维素酶酶活67.9u/ml，比出发菌株提高了316.5％。

附图说明

图1为菌株米曲霉(aspergillusoryzae)xms01的菌落形态图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

实施例

1.菌株获得及命名：

本发明是对实验室保存的一米曲霉的出发菌株进行诱变后得到一株米曲霉突变菌株，现已经经过微生物分类学鉴定并已经经过保藏：命名为米曲霉(aspergillusoryzae)xms01，cctccno：m2018425；保藏地点为：中国，武汉，武汉大学；中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2018年07月02日。

本实验室的米曲霉的来源：出发菌株是本实验室保存的一株米曲霉菌，出发菌株米曲霉发酵上清液中木聚糖酶酶活40.2u/ml，β-葡聚糖酶活12.4u/ml，纤维素酶酶活16.3u/ml。

本发明的具有高产非淀粉多糖酶的米曲霉(aspergillusoryzae)xms01的形态特征为：如图1所示，菌落生长较快,质地疏松,初白色、黄色，后变为褐色至淡绿色。分生孢子头放射状，也有少数为疏松柱状。

以一株实验室保存的米曲霉为出发菌株,经过平板活化后,将平面上的米曲霉孢子用适量的生理盐水洗脱，制作成孢子悬浮液，然后将孢子悬液接入基础产酶培养基，30℃摇瓶培养5天，酶液经6000转/分离心5min，取上清液。取稀释10倍的酶液200ul，分别加入到装有37℃预热的0.5％的木聚糖溶液、0.5％β-葡聚糖溶液、0.5％羧甲基纤维素钠溶液的试管中，摇混匀，37℃水浴酶解反应30分钟，然后加入dns溶液3ml，沸水浴灭活5min，流动水冷却，加入5ml蒸馏水，震荡摇匀。空白对照是将相应酶液用缓冲液代替。在波长540nm处测吸光度。根据木聚糖酶、葡聚糖酶、纤维素酶的计算公式，计算出酶活力。得出，木聚糖酶酶活40.2u/ml，β-葡聚糖酶活12.4u/ml，纤维素酶酶活16.3u/ml。

从以上的测试结果可知：在基础产酶培养基上，测出了3种酶的酶活，降低了米曲霉产木聚糖酶和β-葡聚糖酶、纤维素酶的能力。因此，本申请人经过无数的设计后发现通过菌株的纯化和诱变来提高木聚糖酶和β-葡聚糖酶的酶活力。具体操作如下：

1.1菌种的平板初筛

将出发菌株经过平板活化后，挑取12个单菌落分别点植于鉴别培养基为木聚糖和β-葡聚糖上，置于30℃培养箱，培养6天，通过计算hc值(透明圈直径与菌落直径之比)，选出1#、3#、6#、8#、12#。

1#、3#、6#、8#、12#五只斜面菌株转接于斜面培养基进行30℃、35℃、40℃、45℃温度梯度驯化培养，通过比较hc值和摇瓶培养测酶活，得出在30℃下，12#斜面菌株无论是在hc值和酶活都优于其它的菌株。因此将12#菌株进行下一步紫外诱变与筛选。

1.2菌种的紫外诱变与筛选

单孢子悬浮液的制备：将12#斜面菌株用无菌水洗脱孢子。经玻璃珠打散后，脱脂棉过滤，得单孢子悬浮液。

诱变处理：38w波长为2240nm的紫外灯预热10min。吸取5ml单孢子悬浮液于直径9cm的培养皿中，置于紫外灯30cm处，开盖振荡照射不同时间。盖上皿盖，在暗室梯度稀释。

突变株的分离：将诱变后的孢子悬浮液分别涂布在鉴别培养基上，置于30℃培养箱，培养6天，生长出的菌落并且hc值比较大的即为突变菌株，编号为yy01。

摇瓶初筛：将yy01突变菌株转接至摇瓶(1000ml摇瓶装培养基100ml)，30℃下300r/min振荡培养3d。取上清液检测酶活。

摇瓶复筛：取初筛活性比出发菌株提高20％以上的菌株进行二级摇瓶发酵复筛，得出两株比出发菌株提高26％的菌株，编号分别为yy01-1、yy01-2。.

1.3菌株的硫酸二乙脂(des)诱变与筛选

分别取yy01-1、yy01-2菌株的24h培养液4ml、硫酸二乙脂(des)0.3ml及0.1mol/l乙酸缓冲液(ph5.5)16ml混合，振荡一定时间，加入终止试剂25％硫代硫酸钠0.8ml，终止诱变。将上述经诱变处理的菌悬浮液稀释后，涂布培养皿，每个样加0.1ml，涂匀，30℃培养箱，培养6天，挑取突变菌株(菌落直径大、表面湿润、颜色白)的单个菌落转接至摇瓶(1000ml摇瓶瓶装培养基100ml)，30℃下300r/min振荡培养3d。取上清液检测酶活，木聚糖酶和β-葡聚糖酶的酶活分别比出发菌株提高400％、283％以上，纤维素酶的酶活比出发菌株降低100％的菌株即为目标菌株，编号为xms01(该菌株的木聚糖酶和β-葡聚糖酶的酶活比大约为4:1，为了便于简述该菌株的酶活)。结果见表1。

表1纯化前后摇瓶酶活的对比

1.4xms01突变菌株的稳定性

将xms01突变菌株，连续传代和发酵5代，结果如表2所示。发酵液颜色白，吸光值od70.0-70.6，最终ph值稳定在5.0-5.2，木聚糖酶的酶活为190-200u/ml。由此可见突变菌株xms01是稳定的。

表2突变菌株xms01发酵性能稳定性

1.5高产率饲用非淀粉多糖酶生产工艺的优化

1.5.1培养基的优化

1.5.1.1碳源种类及浓度的优化

以蛋白胨为氮源，分别以不同浓度的玉米芯、麸皮、葡萄糖、甘油、蔗糖作为培养基中的碳源，进行摇瓶发酵培养，测定酶活力，结果见表3。

表3碳源对xms01菌株产酶活力的影响

由表3数据可见，15g/l的葡萄糖或5g/l的甘油为碳源发酵效果较好。

1.5.1.2氮源种类及浓度的优化

发酵培养基以葡萄糖为碳源，分别以尿素、酵母膏、蛋白胨、(nh4)2so4、nh4no3为唯一氮源，进行摇瓶发酵培养，测定酶活力，结果见表4。

表4氮源对xms01菌株产酶活力的影响

实验结果表明，以酵母膏、蛋白胨为氮源，xms01菌株产酶较高；而无机氮源中以(nh4)2so4的效果较好。在前期实验的基础上，进一步考察了酵母膏、蛋白胨和无机氮源(nh4)2so4复合氮源对产酶活力的影响，结果见表5。

表5复合氮源对xms01菌株产酶活力的影响

从实验结果确定发酵氮源为：酵母膏1g/l，蛋白胨5g/l，(nh4)2so410g/l，这时产酶最高。1.5.1.3无机盐种类及浓度的优化

实验中重点考查了kh2po4、k2hpo4、nacl、feso4·7h2o、mgso4·7h2o、mnso4、znso4·7h2o、cocl2对xms01菌株产酶的影响，结果如表6所示。

表6无机盐对xms01菌株产酶的影响

初步确定产酶培养基无机盐的组成为(g/l):k2hpo412、kh2po45、nacl0.1、feso4·7h2o0.05、mgso4·7h20.5、mnso40.02、znso4·7h2o0.02、cocl20.02。

1.5.1.4培养基优化前后xms01菌株摇瓶酶活的比较

将xms01菌株分别接入优化前后的发酵培养基中进行摇瓶发酵，结果如表7所示，通过培养基优化产酶菌株xms01发酵酶活力从200u/ml提高到6000u/ml。

表7培养基优化前后xms01菌株摇瓶酶活的比较

5.2培养条件的优化

在100l的发酵罐以优化后的培养基作为发酵培养基进行发酵，研究最适的培养条件。

具体的试验对发酵起始ph，培养温度，液体种子种龄、接种量、溶氧等方面作了考察，设立的组别和酶活的检测具体见下表：

表8

由上表可以确定：发酵培养基初始ph：5.5，培养温度：28℃，液体种子种龄：24h，接种量：10％，溶氧：25％(生长期)、40％(诱导期)这时产酶水平比较高。

1.5.2.2诱导期甘油流加方式的优化

在优化的培养条件下，进行100l的发酵罐发酵，当进入诱导期，研究恒速和恒do流加甘油方式对产酶的影响。由表9可知，以恒do流加甘油方式产酶水平最高。

表9诱导期甘油流加方式的对比

1.5.3xms01菌株在生产工艺优化前后生长及产酶比较

由表10可知，优化后的生产工艺比优化前的生产工艺在细胞干重和酶活分别提高了56.3％、55％。

表10xms01菌株在生产工艺优化前后生长及产酶比较

虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然其并非用以限制本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许的修改和完善，因此本发明的保护范围当以权利要求书所界定的为准。