一种氨基和多肽修饰的AIE聚合物纳米粒子的制备方法与流程

本发明涉及一种表面修饰的聚集诱导发光(aie)聚合物纳米粒子的制备方法。

(二)

背景技术：

荧光纳米粒子是一类重要的功能纳米材料，其具有水分散性好、光稳定性高、细胞毒性低和表面可修饰等特点，在细胞成像、疾病诊断及生物传感等众多高端领域有重要的应用价值。但以传统聚集诱导淬灭(acq)型荧光分子为功能组分的纳米粒子，往往存在荧光量子产率低、荧光强度调控区间窄等缺陷，一定程度上限制了其应用。2001年，唐本忠院士课题组首先报道了一类具有aie效应的新型荧光分子,其在聚集状态下，由于分子内旋转受限，会发射强烈的荧光【chemsocrev2011,40,5361–5388.】。aie分子非常适合于制备高荧光强度和高фf的聚合物纳米粒子。因为，一方面aie分子浓度越高，分子聚集程度越大，荧光越亮；另一方面，以聚合物为基体的粒子内部，分子受限程度高，亦有利于增强aie分子的荧光。

目前，已发展了多种制备aie聚合物纳米粒子的方法，比如有学者开发了自组装与raft聚合、schiff碱缩合反应、mannich反应、点击反应和动态共价键相互作用等相结合的方法来制备不同的aie聚合物纳米粒子【colloidssurf,b2017,150,114–120.；jcolloidinterfacesci2018,519,137–144；polymchem2017,8,4746–4751.；dyepigm2018,151,123–129.】。但是自组装的方法一般需要预先合成嵌段共聚物，且组装过程往往需控制在较低的浓度下进行，因此其存在合成效率不高的问题。

细乳液聚合体系是以单体液滴为分散相，水为连续相的非均相聚合体系，在聚合过程中，聚合物粒子通过单体液滴成核形成【progpolymsci2002,27,1283–1346.advpolymsci2005,175,129–255.】。单体液滴既是单体的储存场所，也是聚合场所。通过预先向单体液滴引入不同的功能组分，能方便地通过细乳液聚合制备各种聚合物纳米粒子【angewcheminted2009,48,4488–4507.】。发明人课题组首先提出利用细乳液聚合来制备aie聚合物纳米粒子【polymchem2015,6,6378–6385.】。

但是迄今为止，细乳液聚合制备的aie聚合物纳米粒子表面并未进行特异性多肽的修饰，一定程度上限制了其在细胞选择性成像领域的应用。因此在现有研究的基础上，本发明提出以苯乙烯、丙烯酸酯和(或)甲基丙烯酸酯为单体，添加氨基功能单体，并以aie分子为荧光组分，经一步细乳液聚合制备表面氨基修饰的aie聚合物纳米粒子；再利用碳二亚胺缩合剂活化的ω-马来酰亚胺烷基酸与aie聚合物纳米粒子表面的氨基反应，实现纳米粒子表面的马来酰亚胺基团修饰；最后，利用多肽分子中半胱氨酸序列单元上的巯基与马来酰亚胺基团间的micheal加成反应，实现aie聚合物纳米粒子表面的氨基和多肽修饰。制得的氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子具有荧光亮度高、光稳定性好、储存稳定性佳和细胞成像能力强等优点。

(三)

技术实现要素：

本发明旨在提供一种基于细乳液聚合技术的制备氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子的新方法，所制的氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子具有荧光强度高、光稳定性好、储存稳定性佳和细胞成像能力强等特点。

本发明采用的技术方案是：

一种氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将乳化剂和氨基功能单体溶于去离子水中，得到水相溶液，其中乳化剂的质量用量为水质量用量的0.1％～10％；

所述乳化剂，选自下列至少一种：阴离子乳化剂、阳离子乳化剂、两性乳化剂和非离子乳化剂；

所述氨基功能单体为式(1)所示的氨基丙烯酸酯盐酸盐和氨基甲基丙烯酸酯盐酸盐以及式(2)所示的n-(氨烷基)丙烯酰胺盐酸盐和n-(氨烷基)甲基丙烯酰胺盐酸盐中的至少一种；

式(i)和式(ii)中，r1、r3为h或甲基；r2、r4为c1～c5的烷基；

(2)将aie分子、奥氏熟化效应抑制剂和油溶性引发剂溶于疏水单体中，得到油相溶液；以步骤(1)使用的氨基功能单体和疏水单体的总质量为单体总质量，其中氨基功能单体的质量用量为单体总质量用量的0.1％～20％，aie分子质量用量为单体总质量的0.1％～30％，奥氏熟化效应抑制剂的质量用量为单体总质量的1％～12％，油溶性引发剂的质量用量为单体总质量0.05％～10％；所述单体总质量为步骤(1)中去离子水质量用量的1％～50％；

所述的aie分子选自下列aie-1至aie-42分子中的至少一种：

1.具有典型基础结构的aie分子

2.氰基基团修饰的aie化合物

3.tpe修饰的花青染料衍生物

4.tpe修饰的bodipy衍生物类

5.tpe、tpa或蒽酮修饰的ddp衍生物类

6.二氰基亚甲基-4h-吡喃衍生物

7.苯并双(噻二唑)和tpa构成的aie化合物

8.tpe修饰的苯并噻二唑衍生物

所述奥氏熟化效应抑制剂选自下列至少一种：c14～c22的脂肪烃、c14～c22的脂肪醇；

所述油溶性引发剂选自下列至少一种：偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈、偶氮二异戊腈、偶氮二异丁酸二甲酯、过氧化二苯甲酰、过氧化叔戊酸叔丁酯、过氧化二碳酸二异丙酯、过氧化二月桂酰；

所述疏水单体选自下列至少一种：苯乙烯、式(iii)所示的丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯；

式(iii)中，r10为h或甲基；r11为c1～c5的烷基；

(3)将按步骤(1)所制的水相溶液加至步骤(2)所制的油相溶液中，经搅拌预乳化，得到粗乳液；将装有粗乳液的容器置于冰水浴中，在25w～950w的功率下超声处理0.5min～60min，制得单体细乳液；通氮除氧，在40℃～90℃的温度下，在氮气保护下反应1h～48h，制得表面氨基修饰的aie聚合物纳米粒子乳液，透析得到纯化的氨基修饰的aie聚合物纳米粒子乳液；用碱性ph缓冲液将氨基修饰的aie聚合物纳米粒子乳液的ph值调节至7.0～8.0之间，并将乳液的固含量控制在0.05％～5％范围内；所述碱性ph缓冲液选自下列一种：三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、磷酸缓冲盐(pbs)溶液；

(4)将ω-马来酰亚胺烷基酸和碳二亚胺缩合剂溶解于ph值在5.0～7.0范围内的酸性ph缓冲液中，其中ω-马来酰亚胺烷基酸的质量分数控制在0.01％～10％范围内，碳二亚胺缩合剂的质量用量为ω-马来酰亚胺烷基酸质量用量的50％～600％，活化1min～6h，制得活化中间体溶液；所述酸性ph缓冲液选自下列一种：磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、2-(n-吗啡啉)乙磺酸(mes)缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液；

所述ω-马来酰亚胺烷基酸选自式(iv)所示化合物中的一种：

式(iv)中，r12为c1～c10的烷基；

所述碳二亚胺缩合剂选自n,n’-二环己基碳二亚胺、n,n’-二异丙基碳二亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐中的一种；

(5)将步骤(4)制得的活化中间体溶液加至步骤(3)制得的氨基修饰的aie聚合物纳米粒子的乳液中，使ω-马来酰亚胺烷基酸的质量用量为氨基功能单体质量用量的10％～1000％，用ph调节剂将乳液的ph值调节至7.0～9.0之间，室温反应1h～72h，制得马来酰亚胺修饰的aie聚合物纳米粒子乳液，透析得到纯化的马来酰亚胺修饰的aie聚合物纳米粒子乳液；所述ph调节剂选自下列至少一种：柠檬酸钠、硼砂、氢氧化钠、碳酸盐及其水合物、碳酸氢盐、碳酸盐、氨水；

(6)将末端含半胱氨酸序列单元的多肽溶解于去离子水中，配制多肽水溶液，其中多肽的质量分数控制在0.01％～10％范围内，将多肽水溶液加至步骤(5)制得的马来酰亚胺修饰的aie聚合物纳米粒子乳液中，使多肽的质量用量为氨基功能单体质量用量的5％～100％，室温反应1h～72h，制得氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子，透析得到纯化的氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子乳液；

所述末端含半胱氨酸序列单元的多肽选自表1中的至少一种；

表1.末端含半胱氨酸序列单元的多肽

关于本发明，发明人经深入研究发现，在细乳液聚合制备氨基修饰的aie聚合物纳米粒子时，氨基功能单体的用量对体系的胶体稳定性、粒子的尺寸及其分布、多肽的修饰程度均有影响。一般而言，随氨基功能单体用量增加，aie聚合物纳米粒子表面氨基修饰密度增加，有利于后续的马来酰亚胺基团和多肽的修饰。在一定范围内，氨基功能单体用量的增加对体系的胶体稳定性、纳米粒子的粒径及其分布影响不大，但是过高的氨基单体用量会使得体系胶体稳定性变差，粒子尺寸变大，尺寸分布变宽。研究发现仲胺基和叔胺基参与酰胺缩合反应的能力弱，甚至无法参与酰胺缩合反应，因此需采用含伯胺基团的氨基功能单体。综上，应根据体系胶体稳定性、aie聚合物纳米粒子粒径以及后续氨基和多肽修饰程度的要求来确定合适的氨基功能单体的类型和用量。本发明步骤(1)中，考虑到纳米粒子表面修饰的氨基的反应能力，所述的氨基功能单体优选为甲基丙烯酸2-氨基乙基酯盐酸盐或n-(3-氨丙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐。考虑到为后续多肽修饰提供足够的反应位点，且保证粒子具有较好的胶体稳定性，氨基功能单体的用量优选为单体总质量用量的0.5％～15％。

本发明步骤(1)中，所述阴离子乳化剂，可选自下列至少一种：烷基磺酸盐乳化剂r13-so3m、烷基硫酸盐乳化剂r14-oso3m和烷基苯磺酸盐乳化剂r15-c6h4-so3m，其中r13和r14为c10～c20的脂肪链，r15为c10～c18的脂肪链，m为na⁺或k⁺。所述阳离子乳化剂，可选自下列至少一种：烷基三甲基卤化铵乳化剂r16n⁺(ch3)3x–，其中r16为c12～c20的脂肪链，x为cl或br。所述两性乳化剂，可选自下列至少一种：十二烷基氨基丙酸、十八烷基二羟乙基氧化胺、羧酸基甜菜碱r17n⁺(ch3)2ch2coo^–、磺酸基甜菜碱r18n⁺(ch3)2ch2ch2so3–或r19n⁺(ch3)2ch2ch2ch2so3–，其中r17、r18和r19为c12～c18的脂肪链。所述非离子型乳化剂，可选自下列至少一种：op-系列乳化剂、o系列乳化剂、moa系列乳化剂、吐温系列乳化剂和sg系列乳化剂。其中op-系列乳化剂可以是op-9、op-10和op-15中的至少一种。o系列乳化剂可以是o-10、o-20、o-30和o-50中的至少一种。moa系列乳化剂可以是moa-7、moa-9、moa-15和moa-23中的至少一种。吐温系列乳化剂可以是吐温-20、吐温-40、吐温-60、吐温-80和吐温-85中的至少一种。sg系列乳化剂可以是sg-40和/或sg-100。

本发明步骤(1)中，考虑到细乳液体系的稳定性以及aie聚合物纳米粒子的生物相容性，所述的乳化剂优选非离子型乳化剂，更优选o系列乳化剂、moa系列乳化剂、吐温系列乳化剂中的至少一种。

本发明步骤(2)中,考虑到本发明制备的aie聚合物纳米粒子主要应用于细胞成像领域，优选发射波长大于500nm的aie分子为荧光组分，aie分子的质量用量优选为单体总质量用量的0.1％～15％。

本发明步骤(2)中，考虑到细乳液液滴的稳定性，奥氏熟化效应抑制剂优选c16～c22烷烃。

本发明步骤(2)中，所述油溶性引发剂优选下列至少一种：偶氮二异丁腈、偶氮二异戊腈和偶氮二异庚腈。

本发明步骤(3)中，为防止超声过程中细乳液过热，将装粗乳液的容器置于冰水浴中进行超声处理，超声功率优选50w～600w，超声时间优选5min～30min。

本发明步骤(3)中，所述的透析优选按照如下操作：利用截留分子量5000g·mol^–1的透析袋渗析三天，换水频率为第一天隔2h换一次，第二天隔3h换一次，第三天隔6h换一次。

本发明步骤(4)中，为避免羧基的去质子化，碳二亚胺缩合剂活化ω-马来酰亚胺基烷基酸的反应在弱酸性介质中进行。为提高活化效率，ω-马来酰亚胺基烷基酸的活化反应优选ph值在6.0～6.5范围内的酸性ph缓冲液为反应介质。综合考虑ω-马来酰亚胺基烷基酸的活化效率和程度，活化反应时间优选为5min～3h。考虑到ω-马来酰亚胺基烷基酸与纳米粒子表面氨基的反应效率，ω-马来酰亚胺基烷基酸优选为6-马来酰亚胺基己酸或3-马来酰亚胺基丙酸。

本发明步骤(5)中，为避免氨基的质子化，提高酰胺缩合反应的效率，活化的ω-马来酰亚胺基烷基酸与氨基修饰的aie聚合物纳米粒子的反应在弱碱性反应介质中进行。需指出的是，马来酰亚胺基团在碱性条件下易水解，因此为保证马来酰亚胺基团的稳定性，反应体系的ph值不宜高于9。为提高酰胺缩合反应的效率，活化的ω-马来酰亚胺基烷基酸与纳米粒子表面氨基的酰胺缩合反应的反应介质的ph值优选为7.0～8.5。综合考虑ω-马来酰亚胺基烷基酸与氨基的反应效率和程度，反应时间优选为1h～36h。

本发明步骤(5)中，所述的透析优选按照如下操作：将制得的马来酰亚胺修饰的aie聚合物纳米粒子乳液用截留分子量5000g·mol^–1的透析袋渗析三天，换水频率为第一天隔2h换一次，第二天隔3h换一次，第三天隔6h换一次。

本发明步骤(6)中，通过半胱氨酸序列单元的巯基和马来酰亚胺的双键之间的micheal加成反应，将多肽连接到aie聚合物纳米粒子表面，为保证多肽与纳米粒子表面的马来酰亚胺基充分反应，反应时间优选为3h～48h。

本发明步骤(6)中，所述的透析优选按照如下操作：将制得的氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子乳液用截留分子量5000g·mol^–1的透析袋渗析三天，换水频率为第一天隔2h换一次，第二天隔3h换一次，第三天隔6h换一次。

本发明制备的表面氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子应用于细胞成像，aie聚合物纳米粒子本身具有较高的荧光强度，还能被细胞高效地摄取，甚至能被选择性地高效摄取，故能获得较好的成像效果。根据成像细胞类型的差异，可选择不同的多肽修饰aie聚合物纳米粒子。比如，rgd肽含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列，是肿瘤细胞中过度表达的整合素αⅴβ3的特异性配体，因此，rgd肽修饰的aie聚合物纳米粒子可用于肿瘤细胞的检测。细胞穿膜肽hiv-1tat能促进细胞对纳米粒子的摄取率，可对细胞的生理活动进行荧光示踪，因此hiv-1tat修饰的aie聚合物纳米粒子能用于研究细胞凋亡等生理过程。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：提出了一种结合细乳液聚合技术和点击反应的高效制备氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子的新方法。通过氨基功能单体参与的细乳液共聚合反应，将aie分子包埋于聚合物基体内的同时，实现对纳米粒子表面的氨基化修饰。利用碳二亚胺缩合剂活化的ω-马来酰亚胺基烷基酸与aie聚合物粒子表面氨基的酰胺缩合反应，将马来酰亚胺基连接到粒子表面。最后，与含巯基的多肽，经一步micheal加成反应高效地实现对aie聚合物纳米粒子表面的多肽修饰，制得细胞成像效果好的氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子。该方法的优点是：(1)通过调节细乳液的合成参数能有效地调控aie聚合物纳米粒子的颗粒特征；(2)aie聚合物纳米粒子的发射波长和发射强度能通过aie分子的类型和装载量在较宽的范围内灵活调控；(3)aie聚合物纳米粒子表面的氨基修饰量以及多肽的修饰能力可以通过氨基功能单体的用量方便地调节；(4)马来酰亚胺与巯基的micheal加成反应具有点击反应的特点，能高效地将不同功能的多肽连接到aie聚合物纳米粒子表面。所制氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子发射波长和强度调控区间大、细胞摄取能力强，在细胞成像领域有重要的潜在应用价值。

(五)附图说明

图1为实施例1所制氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子的透射电镜图。

图2为实施例1所制氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子乳液荧光发射光谱及紫外灯激发的乳液照片。

(六)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不限于此：

本发明实施例使用的多肽来自上海吉尔生化有限公司。

实施例1：

称取0.2go-50乳化剂和0.1g甲基丙烯酸2-氨基乙基酯盐酸盐，溶于12.5g去离子水中，得到水相溶液。

称取0.01g的aie-6分子和0.02g偶氮二异丁腈溶于0.06g正十六烷和0.9g甲基丙烯酸甲酯的混合溶液中，得到油相溶液；将水相溶液加至油相溶液中，经搅拌预乳化后制得粗乳液；将装有粗乳液的容器置于冰水浴中，用功率为400w的超声波超声9min，制得稳定的单体细乳液；通氮除氧，温度升至65℃,在氮气保护下，反应6h，制得氨基修饰的aie聚合物纳米粒子乳液。用截留分子量5000g·mol^–1的透析袋渗析三天，换水频率为第一天每隔2h换一次，第二天每隔3h换一次，第三天每隔6h换一次，制得纯化的氨基修饰的aie聚合物纳米粒子乳液，测得乳液的固含量为2.6wt％；用0.1mpbs缓冲液将乳液的ph值调至中性，且将乳液稀释至固含量0.36wt％。

称取0.15g6-马来酰亚胺基己酸和0.19g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶解于200g的0.1mmes缓冲液(ph＝6)中，活化60min，制得活化的中间体溶液。

将制得的活化中间体溶液加至中性的氨基修饰的aie聚合物纳米粒子乳液中，用nahco3将体系的ph值调节至7.5，室温反应12小时，制得马来酰亚胺修饰的aie聚合物纳米粒子乳液；将制得的马来酰亚胺修饰的aie聚合物纳米粒子乳液用截留分子量5000g·mol^–1的透析袋渗析三天，换水频率为第一天隔2h换一次，第二天隔3h换一次，第三天隔6h换一次，得到纯化的马来酰亚胺修饰的aie聚合物纳米粒子乳液。

将0.015g末端含半胱氨酸序列单元的hiv-1tat肽溶于15g去离子水中，将多肽水溶液与纯化后的马来酰亚胺修饰的aie聚合物纳米粒子乳液均匀混合，在室温反应12小时，制得氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子；将制得的氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子乳液用截留分子量5000g·mol^–1的透析袋渗析三天，换水频率为第一天隔2h换一次，第二天隔3h换一次，第三天隔6h换一次，得到纯化的氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子乳液。

用透射电子显微镜观察氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子的形貌，结果显示氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子为球形颗粒，数均粒径约为80nm。氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子乳液的荧光光谱显示，其最大荧光发射波长为590nm，乳液在紫外光激发下发射明显的橙色荧光。双辛可宁酸(bca)法多肽测定实验结果显示，hiv-1tat肽已成功修饰到aie聚合物纳米粒子表面。

对比例1：

称取0.2go-50乳化剂和0.3g甲基丙烯酸2-氨基乙基酯盐酸盐，溶于12.5g去离子水中，得到水相溶液。

称取0.01g的aie-6分子和0.02g偶氮二异丁腈溶于0.06g正十六烷和0.7g甲基丙烯酸甲酯的混合溶液中，得到油相溶液；将水相溶液加至油相溶液中，经搅拌预乳化后制得粗乳液；将装有粗乳液的容器置于冰水浴中，用功率为400w的超声波超声9min，制得稳定的单体细乳液；通氮除氧，温度升至65℃,在氮气保护下反应，聚合过程中体系失去稳定性，出现大量的固体产物。

对比例2：

采用与实施例1相同的配方和制备条件，制得氨基修饰的aie聚合物纳米粒子乳液。用截留分子量5000g·mol^–1的透析袋渗析三天，换水频率为第一天每隔2h换一次，第二天每隔3h换一次，第三天每隔6h换一次，制得纯化的氨基修饰的aie聚合物纳米粒子乳液，测得乳液的固含量为2.6wt％；用0.1mpbs缓冲液将乳液的ph值调至中性，且将乳液稀释至固含量0.36wt％。

称取0.15g6-马来酰亚胺基己酸和0.19g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶解于200g的0.1mmes缓冲液(ph＝6)中，活化60min，制得活化的中间体溶液。

将制得的活化中间体溶液加至中性的氨基修饰的aie聚合物纳米粒子乳液中，用naoh将体系的ph值调节至10，室温反应12小时，制得马来酰亚胺修饰的aie聚合物纳米粒子乳液；将制得的马来酰亚胺修饰的aie聚合物纳米粒子乳液用截留分子量5000g·mol^–1的透析袋渗析三天，换水频率为第一天隔2h换一次，第二天隔3h换一次，第三天隔6h换一次，得到纯化的马来酰亚胺修饰的aie聚合物纳米粒子乳液。由于体系ph过高，马来酰亚胺基团发生水解副反应，产物的¹hnmr谱图中观察不到马来酰亚胺基团的特征峰，粒子表面的马来酰亚胺修饰失败。

对比例3：

采用与实施例1相同的配方和制备条件，制得氨基修饰的aie聚合物纳米粒子乳液。用截留分子量5000g·mol^–1的透析袋渗析三天，换水频率为第一天每隔2h换一次，第二天每隔3h换一次，第三天每隔6h换一次，制得纯化的氨基修饰的aie聚合物纳米粒子乳液，测得乳液的固含量为2.6wt％；用0.1mpbs缓冲液将乳液的ph值调至中性，且将乳液稀释至固含量0.36wt％。

称取0.15g6-马来酰亚胺基己酸和0.19g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶解于200g的0.1mmes缓冲液(ph＝6)中，活化60min，制得活化的中间体溶液。

将制得的活化中间体溶液加至中性的氨基修饰的aie聚合物纳米粒子乳液中，用hcl水溶液将体系的ph值调节至2，室温反应12小时。将制得的产物用截留分子量5000g·mol^–1的透析袋渗析三天纯化，换水频率为第一天隔2h换一次，第二天隔3h换一次，第三天隔6h换一次。由于酸性反应条件下，氨基的质子化，显著降低了其参与酰胺缩合反应的能力，因此纯化产物的¹hnmr谱图中观察不到马来酰亚胺基团的特征峰，粒子表面的马来酰亚胺修饰失败。

实施例2：

称取0.5g吐温20和0.15g甲基丙烯酸2-氨基乙基酯盐酸盐，溶于15g去离子中，得到水相溶液。

称取0.0075g的aie-12分子和0.015g偶氮二异庚腈溶于0.08g正十六烷和1.35g苯乙烯的混合溶液中，得到油相溶液；将水相溶液加至油相溶液中，经搅拌预乳化后制得粗乳液；将装有粗乳液的容器置于冰水浴中，用功率为200w的超声波超声20min，制得稳定的单体细乳液；通氮除氧，温度升至60℃,在氮气保护下，反应12h，制得氨基修饰的aie聚合物纳米粒子乳液。用截留分子量5000g·mol^–1的透析袋渗析三天，换水频率为第一天每隔2h换一次，第二天每隔3h换一次，第三天每隔6h换一次，制得纯化的氨基修饰的aie聚合物纳米粒子乳液，测得乳液的固含量为3.1wt％；用0.05m三羟甲基氨基甲烷(tris)-盐酸缓冲液将乳液的ph值调至中性，且将乳液稀释至固含量0.43wt％。

称取0.45g3-马来酰亚胺基丙酸和0.9g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶解于200g的0.2m磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(ph＝6.2)中，活化120min，制得活化的中间体溶液。

将制得的活化中间体溶液加至中性的氨基修饰的aie聚合物纳米粒子乳液中，用0.1mnaoh水溶液将体系的ph值调节至8.0，室温反应18小时，制得马来酰亚胺修饰的aie聚合物纳米粒子乳液；将制得的马来酰亚胺修饰的aie聚合物纳米粒子乳液用截留分子量5000g·mol^–1的透析袋渗析三天，换水频率为第一天隔2h换一次，第二天隔3h换一次，第三天隔6h换一次，得到纯化的马来酰亚胺修饰的aie聚合物纳米粒子乳液。

将0.075g末端含半胱氨酸序列单元的rgd肽溶于18.8g去离子水中，将多肽水溶液与纯化后的马来酰亚胺修饰的aie聚合物纳米粒子乳液均匀混合，在室温反应24小时，制得氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子；将制得的氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子乳液用截留分子量5000g·mol^–1的透析袋渗析三天，换水频率为第一天隔2h换一次，第二天隔3h换一次，第三天隔6h换一次，得到纯化的氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子乳液。

用透射电子显微镜观察氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子的形貌，结果显示氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子为球形颗粒，数均粒径约为100nm。氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子乳液的荧光光谱显示，其最大荧光发射波长为637nm，乳液在紫外光激发下发射明显的红色荧光。bca法多肽测定实验结果显示，rgd肽已成功修饰到aie聚合物纳米粒子表面。

实施例3：

称取0.3gmoa-9和0.05g甲基丙烯酸2-氨基乙基酯盐酸盐，溶于15g去离子中，得到水相溶液。

称取0.05g的aie-15分子和0.05g偶氮二异丁腈溶于0.08g正十六烷、0.45g苯乙烯和0.5g甲基丙烯酸甲酯的混合溶液中，得到油相溶液；将水相溶液加至油相溶液中，经搅拌预乳化后制得粗乳液；将装有粗乳液的容器置于冰水浴中，用功率为600w的超声波超声5min，制得稳定的单体细乳液；通氮除氧，温度升至60℃,在氮气保护下，反应24h，制得氨基修饰的aie聚合物纳米粒子乳液。用截留分子量5000g·mol^–1的透析袋渗析三天，换水频率为第一天每隔2h换一次，第二天每隔3h换一次，第三天每隔6h换一次，制得纯化的氨基修饰的aie聚合物纳米粒子乳液，测得乳液的固含量为2.3wt％；用0.2m硼酸-硼砂缓冲液将乳液的ph值调至中性，且将乳液稀释至固含量0.35wt％。

称取0.25g3-马来酰亚胺基丙酸和0.75g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶解于200g的0.1m柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(ph＝5.8)中，活化30min，制得活化中间体溶液。

将制得的活化中间体溶液加至中性的氨基修饰的aie聚合物纳米粒子乳液中，用0.1mna2co3水溶液将体系的ph值调节至7.6，室温反应8小时，制得马来酰亚胺修饰的aie聚合物纳米粒子乳液；将制得的马来酰亚胺修饰的aie聚合物纳米粒子乳液用截留分子量5000g·mol^–1的透析袋渗析三天，换水频率为第一天隔2h换一次，第二天隔3h换一次，第三天隔6h换一次，得到纯化的马来酰亚胺修饰的aie聚合物纳米粒子乳液。

将0.04g末端含半胱氨酸序列单元的ngr肽溶于10g去离子水中，将多肽水溶液与纯化后的马来酰亚胺修饰的aie聚合物纳米粒子乳液均匀混合，在室温反应10小时，制得氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子；将制得的氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子乳液用截留分子量5000g·mol^–1的透析袋渗析三天，换水频率为第一天隔2h换一次，第二天隔3h换一次，第三天隔6h换一次，得到纯化的氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子乳液。

用透射电子显微镜观察氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子的形貌，结果显示氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子为球形颗粒，数均粒径约为75nm。氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子乳液的荧光光谱显示，其最大荧光发射波长为643nm，乳液在紫外光激发下发射明显的红色荧光。bca法多肽测定实验结果显示，ngr肽已成功修饰到aie聚合物纳米粒子表面。

实施例4：

称取3go-50和0.54gn-(3-氨丙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐，溶于50g去离子水中，得到水相溶液。

称取0.9gaie-21分子和0.09g偶氮二异丁腈溶于0.40g正十六烷、1.00g丙烯酸丁酯和4.46g甲基丙烯酸甲酯的混合溶液中，得到油相溶液；将水相溶液加至油相溶液中，经搅拌预乳化后制得粗乳液；将装有粗乳液的容器置于冰水浴中，用功率为500w的超声波超声10min，制得稳定的单体细乳液；通氮除氧，温度升至65℃,在氮气保护下，反应24h，制得氨基修饰的aie聚合物纳米粒子乳液。用截留分子量5000g·mol^–1的透析袋渗析三天，换水频率为第一天每隔2h换一次，第二天每隔3h换一次，第三天每隔6h换一次，制得纯化的氨基修饰的aie聚合物纳米粒子乳液，测得乳液的固含量为4.0wt％；用0.1mpbs缓冲液将乳液的ph值调至中性，且将乳液稀释至固含量1.0wt％。

称取1.35g3-马来酰亚胺基丙酸和3.38g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶解于50g的0.2m乙酸-乙酸钠缓冲液(ph＝5.6)中，活化2h，制得活化中间体溶液。

将制得的活化中间体溶液加至中性的氨基修饰的aie聚合物纳米粒子乳液中，用0.1mnaoh水溶液将体系的ph值调节至7.5，室温反应36小时，制得马来酰亚胺修饰的aie聚合物纳米粒子乳液；将制得的马来酰亚胺修饰的aie聚合物纳米粒子乳液用截留分子量5000g·mol^–1的透析袋渗析三天，换水频率为第一天隔2h换一次，第二天隔3h换一次，第三天隔6h换一次，得到纯化的马来酰亚胺修饰的aie聚合物纳米粒子乳液。

将0.16g末端含半胱氨酸序列单元的t7肽溶于20g去离子水中，将多肽水溶液与纯化后的马来酰亚胺修饰的aie聚合物纳米粒子乳液均匀混合，在室温反应24小时，制得氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子；将制得的氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子乳液用截留分子量5000g·mol^–1的透析袋渗析三天，换水频率为第一天隔2h换一次，第二天隔3h换一次，第三天隔6h换一次，得到纯化的氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子乳液。

用透射电子显微镜观察氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子的形貌，结果显示氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子为球形颗粒，数均粒径约为70nm。氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子乳液的荧光光谱显示，其最大荧光发射波长为592nm，乳液在紫外光激发下发射明显的红色荧光。bca法多肽测定实验结果显示，t7肽已成功修饰到aie聚合物纳米粒子表面。

实施例5：

分别称取1.5g吐温-20和3.0g吐温80，0.9gn-(3-氨丙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐，溶于90g去离子水中，得到水相溶液。

称取0.12gaie-28分子和0.225g偶氮二异戊腈溶于0.675g正十六烷、1.25g丙烯酸甲酯和10g甲基丙烯酸甲酯的混合溶液中，得到油相溶液；将水相溶液加至油相溶液中，经搅拌预乳化后制得粗乳液；将装有粗乳液的容器置于冰水浴中，用功率为400w的超声波超声10min，制得稳定的单体细乳液；通氮除氧，温度升至60℃,在氮气保护下，反应24h，制得氨基修饰的aie聚合物纳米粒子乳液。用截留分子量5000g·mol^–1的透析袋渗析三天，换水频率为第一天每隔2h换一次，第二天每隔3h换一次，第三天每隔6h换一次，制得纯化的氨基修饰的aie聚合物纳米粒子乳液，测得乳液的固含量为4.5wt％；用0.1mpbs缓冲液将乳液的ph值调至中性，且将乳液稀释至固含量1.0wt％。

称取1.8g6-马来酰亚胺基己酸和2.7g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶解于100g的0.05m磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液(ph＝6.4)中，活化3h，制得活化中间体溶液。

将制得的活化中间体溶液加至中性的氨基修饰的aie聚合物纳米粒子乳液中，用0.1mnaoh水溶液将体系的ph值调节至7.5，室温反应36小时，制得马来酰亚胺修饰的aie聚合物纳米粒子乳液；将制得的马来酰亚胺修饰的aie聚合物纳米粒子乳液用截留分子量5000g·mol^–1的透析袋渗析三天，换水频率为第一天隔2h换一次，第二天隔3h换一次，第三天隔6h换一次，得到纯化的马来酰亚胺修饰的aie聚合物纳米粒子乳液。

将0.225g末端含半胱氨酸序列单元的rgd肽溶于10g去离子水中，将多肽水溶液与纯化后的马来酰亚胺修饰的aie聚合物纳米粒子乳液均匀混合，在室温反应30小时，制得氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子；将制得的氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子乳液用截留分子量5000g·mol^–1的透析袋渗析三天，换水频率为第一天隔2h换一次，第二天隔3h换一次，第三天隔6h换一次，得到纯化的氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子乳液。

用透射电子显微镜观察氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子的形貌，结果显示氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子为球形颗粒，数均粒径约为68nm。氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子乳液的荧光光谱显示，其最大荧光发射波长为600nm，乳液在紫外光激发下发射明显的橙色荧光。bca法多肽测定实验结果显示，rgd肽已成功修饰到aie聚合物纳米粒子表面。

实施例6：

称取0.2go-50乳化剂和0.1g甲基丙烯酸2-氨基乙基酯盐酸盐，溶于12.5g去离子水中，得到水相溶液。

称取0.01g的aie-33分子和0.02g偶氮二异丁腈溶于0.06g正十六烷和0.9g甲基丙烯酸甲酯的混合溶液中，得到油相溶液；将水相溶液加至油相溶液中，经搅拌预乳化后制得粗乳液；将装有粗乳液的容器置于冰水浴中，用功率为400w的超声波超声9min，制得稳定的单体细乳液；通氮除氧，温度升至65℃,在氮气保护下，反应6h，制得氨基修饰的aie聚合物纳米粒子乳液。用截留分子量5000g·mol^–1的透析袋渗析三天，换水频率为第一天每隔2h换一次，第二天每隔3h换一次，第三天每隔6h换一次，制得纯化的氨基修饰的aie聚合物纳米粒子乳液，测得乳液的固含量为2.7wt％；用0.1mpbs缓冲液将乳液的ph值调至中性，且将乳液稀释至固含量0.40wt％。

称取0.15g6-马来酰亚胺基己酸和0.19g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶解于200g的0.1mmes缓冲液(ph＝6)中，活化60min，制得活化的中间体溶液。

将制得的活化中间体溶液加至中性的氨基修饰的aie聚合物纳米粒子乳液中，用0.1mnaoh水溶液将体系的ph值调节至7.5，室温反应12小时，制得马来酰亚胺修饰的aie聚合物纳米粒子乳液；将制得的马来酰亚胺修饰的aie聚合物纳米粒子乳液用截留分子量5000g·mol^–1的透析袋渗析三天，换水频率为第一天隔2h换一次，第二天隔3h换一次，第三天隔6h换一次，得到纯化的马来酰亚胺修饰的aie聚合物纳米粒子乳液。

将0.03g末端含半胱氨酸序列单元的hiv-1tat肽溶于15g去离子水中，将多肽水溶液与纯化后的马来酰亚胺修饰的aie聚合物纳米粒子乳液均匀混合，在室温反应12小时，制得氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子；将制得的氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子乳液用截留分子量5000g·mol^–1的透析袋渗析三天，换水频率为第一天隔2h换一次，第二天隔3h换一次，第三天隔6h换一次，得到纯化的氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子乳液。

用透射电子显微镜观察氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子的形貌，结果显示氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子为球形颗粒，数均粒径约为82nm。氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子乳液的荧光光谱显示，其最大荧光发射波长为602nm，乳液在紫外光激发下发射明显的橙色荧光。bca法多肽测定实验结果显示，hiv-1tat肽已成功修饰到aie聚合物纳米粒子表面。

实施例7：

称取0.2go-50乳化剂和0.1g甲基丙烯酸2-氨基乙基酯盐酸盐，溶于12.5g去离子水中，得到水相溶液。

称取0.01g的aie-37分子和0.02g偶氮二异丁腈溶于0.06g正十六烷和0.9g甲基丙烯酸甲酯的混合溶液中，得到油相溶液；将水相溶液加至油相溶液中，经搅拌预乳化后制得粗乳液；将装有粗乳液的容器置于冰水浴中，用功率为400w的超声波超声9min，制得稳定的单体细乳液；通氮除氧，温度升至65℃,在氮气保护下，反应6h，制得氨基修饰的aie聚合物纳米粒子乳液。用截留分子量5000g·mol^–1的透析袋渗析三天，换水频率为第一天每隔2h换一次，第二天每隔3h换一次，第三天每隔6h换一次，制得纯化的氨基修饰的aie聚合物纳米粒子乳液，测得乳液的固含量为2.5wt％；用0.1mpbs缓冲液将乳液的ph值调至中性，且将乳液稀释至固含量0.40wt％。

称取0.15g6-马来酰亚胺基己酸和0.19g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶解于200g的0.1mmes缓冲液(ph＝6)中，活化60min，制得活化的中间体溶液。

将制得的活化中间体溶液加至中性的氨基修饰的aie聚合物纳米粒子乳液中，用0.1mnaoh水溶液将体系的ph值调节至7.5，室温反应12小时，制得马来酰亚胺修饰的aie聚合物纳米粒子乳液；将制得的马来酰亚胺修饰的aie聚合物纳米粒子乳液用截留分子量5000g·mol^–1的透析袋渗析三天，换水频率为第一天隔2h换一次，第二天隔3h换一次，第三天隔6h换一次，得到纯化的马来酰亚胺修饰的aie聚合物纳米粒子乳液。

将0.03g末端含半胱氨酸序列单元的hiv-1tat肽溶于15g去离子水中，将多肽水溶液与纯化后的马来酰亚胺修饰的aie聚合物纳米粒子乳液均匀混合，在室温反应12小时，制得氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子；将制得的氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子乳液用截留分子量5000g·mol^–1的透析袋渗析三天，换水频率为第一天隔2h换一次，第二天隔3h换一次，第三天隔6h换一次，得到纯化的氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子乳液。

用透射电子显微镜观察氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子的形貌，结果显示氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子为球形颗粒，数均粒径约为78nm。氨基和多肽修饰的aie聚合物纳米粒子乳液的荧光光谱显示，其最大荧光发射波长为598nm，乳液在紫外光激发下发射明显的橙色荧光。bca法多肽测定实验结果显示，hiv-1tat肽已成功修饰到aie聚合物纳米粒子表面。

本发明的上述实施例是对本发明的说明而不能限制本发明，在于本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何变化，都应认为是包括在权利要求书的范围内。