一种利用土著PAHs降解菌群落去除农田土壤中USEPAPAHs的方法与流程

本发明涉及环境工程微生物技术领域，具体是涉及一种利用土著pahs降解菌群落去除农田土壤中usepapahs的方法。

背景技术：

多环芳烃(pahs)是一种环境中广泛存在的一类难降解、高风险有机污染物。现发现已知的pahs多达几百种，由于其有致癌、致畸、致突变的“三致”效应，且在土壤中具有分布广、隐蔽性大、治理困难等特点。其中16种被美国环保署列为优先控制的pahs。由于污水灌溉、大气沉降、石化泄露等造成我国及全球土壤pahs污染日趋严重。根据全国土壤污染调查公报显示，全国土壤中pahs超标率达到1.4％。

目前常见的土壤中pahs去除方法，主要通过物理或化学方法将土壤中pahs固定或分解。但是由于农田土壤的特殊应用，常用的物理或化学方法并不能够适用于修复农田土壤pahs污染。因此利用微生物修复这一具有低能耗、高效和环境安全的生物技术修复农田土壤具有实际意义。然而，仅以某一种或某几种纯培养的微生物作用于污染土壤，尽管有一定的降解效果，但不仅微生物用量大，而且不利于天然土壤微生物种群的平衡。目前，尚未发现利用驯化、富集土著pahs降解菌同时去除农田土壤中美国环保署优先控制的多环芳烃(usepapahs)的方法。

技术实现要素：

本发明旨在填补利用土著pahs降解菌群落同时去除农田土壤中美国环保署优先控制的多环芳烃(usepapahs)的方法技术应用的空白，提供一种利用土著pahs降解菌群落去除农田土壤中usepapahs的方法。

本发明的技术方案是：

一种利用土著pahs降解菌群落去除农田土壤中usepapahs的方法，包括以下步骤：

步骤一、土著pahs降解菌群落的制备：

(1)将土壤悬浊液加入预先配制的含有pahs的土壤浸出液中，对土壤中的细菌通过以pahs为唯一碳源进行驯化；

(2)监测驯化过程中参与pahs降解的细菌rhdα基因的丰度以及细菌群落的变化，驯化过程中nida和nahac的含量满足要求的做为一级种子液；

所述nida引物的正向引物序列和反向引物序列如seqidno.1及seqidno.2所示，

seqidno.1：ttcccgagtacgagggatac

seqidno.2：tcacgttgatgaacgacaaa；

所述nahac引物的正向引物序列及反向引物序列如seqidno.3和seqidno.4所示，

seqidno.3：acttggttccggagttgatg

seqidno.4：caggtcagcatgctgttgtt；

所述土著pahs降解菌群落的组成为：无色菌属(achromobacter)、类诺卡氏菌属(nocardioides)、甲基菌属(methylobacillus)、假单胞菌属(pseudomonas)、假黄色单胞菌属(pseudoxanthomonas)、根瘤菌属(rhizobium)、嗜甲基菌属(methylophilus)和志贺氏杆菌(shinella)，该群落拥有广泛的降解谱，其在土壤浸出液中对于10种pahs都具有良好的降解效率；

(3)将所述一级种子液经扩大培养得到二级种子液；

步骤二、土壤接种：

将上述二级种子液接种于土壤，通过提高土壤中nida和nahac基因含量即可降低土壤pahs含量。

进一步地，在上述方案中，属水平上，所述土著pahs降解菌群落各降解菌的组成比例分别为：achromobacter(0.72–25.45％)、nocardioides(0.02％–19.88％)、methylobacillus(7.55–22.91％)、pseudomonas(6.18–30.03％)、pseudoxanthomonas(3.06–10.74％)rhizobium(0.37–8.56％)、methylophilus(2.35–14.34％)和shinella(0.97–10.56％)；

门水平上，所述土著pahs降解菌群落的各降解菌的组成比例分别为：proteobacteria(78.58–99.54％)，actinobacteria(0.14–19.96％)，bacteroidetes(0.23–1.80％)，verrucomicrobia(0.08–0.33％)；

进一步地，在上述方案中，所述土著pahs降解菌群落的监测方法为：每隔两天采样一次并进行细菌群落结构鉴定和rhdα基因含量检测。

进一步地，在上述方案中，所述土著pahs降解菌群落的制备方法具体为：

(1)土壤浸出液的制备：将未污染的土壤和水以1:10的比例混合并搅拌均匀，静置2h后将上清液5000rpm/min离心10min以去除不溶性杂质，121℃高温灭菌20min后室温保存；

(2)一级种子液：按照10％的接种量将污染土壤的悬浊液接种到土壤浸出液中，再加入终浓度为30mgl^-1的10种pahs经驯化、富集后，每隔两天将培养液5000rpm/min离心后一部分提取其基因组dna，另一部分加入终浓度为30％的甘油后冷冻保存为一级种子液；

(3)细菌群落的鉴定和rhdα基因含量的测定：经16srrna基因高通量测，测定该细菌群落16srrna基因v3-v4区；经qpcr鉴定其中nida和nahac和基因拷贝数；

(4)二级种子液：将所选的一级种子液经过lb培养基扩大培养后，8000rpm/min4℃离心5min，弃去上清液，加入蒸馏水，再次离心，该操作重复三次，以充分洗去菌体中残留的lb培养基；最后用蒸馏水调整菌悬液浓度od600，4℃保存备用为二级种子液。

优选地，在上述方案中，所述一级种子液od600值不小0.5。

优选地，在上述方案中，所述一级种子液中nida和nahac基因拷贝数分别达到至少3000和10000个每毫升。

优选地，在上述方案中，所述二级种子液浓度od600值为0.2-1.0。

进一步地，所述的pahs为以下10种pahs：萘、苊烯、苊、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并[a]蒽和浓度都为3mgl^-1。

进一步地，所述接种方式为按照每1kg土接种100ml，将二级种子液直接喷洒到土壤并搅拌均匀。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

(1)本发明能够有效的去除usepapahs，尤其对高环pahs去除率较高(2)本发明可以在去除usepapahs的同时并不引入任何化学试剂或者非土著的细菌。

附图说明

图1是一级种子液中rhdα基因丰度；其中，图a为nida的基因丰度，图b为nahac的基因丰度；

图2是加入不同含量的土著pahs降解菌群落对于土壤中pahs降解的影响结果图；

图3是第35天土壤中不同环数多环芳烃的降解效率；

图4是加入不同含量土著pahs降解菌群落的土壤中rhdα基因含量变化。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。

1、土著pahs降解菌群落的制备：

(1)土壤浸出液的制备：将未污染的土壤和水以1:10的比列混合并搅拌均匀，静置2h后将上清液5000rpm/min离心10min以去除不溶性杂质，121℃高温灭菌20min后室温保存。

(2)一级种子液：按照10％的接种量将污染土壤的悬浊液接种到土壤浸出液中，再加入终浓度为30mgl^-1的10种pahs经16天驯化、富集。每隔两天采样一次，将培养液5000rpm/min离心后一部分提取其基因组dna，另一部分加入终浓度为30％的甘油后冷冻保存为一级种子液。

(3)细菌群落的鉴定和rhdα基因含量的测定：经16srrna基因高通量测，测定该细菌群落16srrna基因v3-v4区。经qpcr鉴定其中nida和nahac基因拷贝数。

(4)二级种子液：合适的一级种子液经过lb培养基扩大培养后，8000rpm/min4℃离心5min，弃去上清液，加入蒸馏水，再次离心，该操作重复三次，以充分洗去菌体中残留的lb培养基制得od600值为0.0、0.2、0.5和1.0的土著pahs降解菌群落储备液，4℃保存备用为二级种子液。其中od600值为0.0的二级种子液仅含蒸馏水用于对照试验。

将上述二级种子液按照每千克土100ml为标准接种到受pahs污染的农田土中。每隔七天采样一次持续35天，并测定土壤中pahs及nida和nahac的含量。

2、一级种子液群落结构分析

(1)pcr扩增：以一级种子液基因组dna为模版，使用16srrnav3-v4区域的特异性引物、takara公司高保真酶进行pcr，确保产物特异性。

(2)pcr产物纯化：产物使用1.5％浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测，利用axygen公司的胶回收试剂盒回收目的条带。

(3)测序及生物信息学分析：将pcr产物建库后用miseqpe350进行测序，并进一步分析其群落结构。

3、待测土壤pahs含量的测定：

将土壤经真空冷冻干燥后充分研磨，-80℃保存待测。

取上述制备好的土壤样品于20ml玻璃离心管中，分别加入10ml二氯甲烷，水浴超声处理30min，静置30min，将所有上清液过层析柱(上层2g无水硫酸钠，下层2g硅胶)净化并用10ml体积比为1:1的二氯甲烷和正己烷溶液洗脱；洗脱液40℃恒温下浓缩至干，用甲醇定容到2ml，过0.22μm孔径有机相滤膜后，hplc/uv-fld分析。

4、待测样品nida和nahac含量的测定：

(1)一级种子液中，nida和nahac基因含量的测定

以一级种子液基因组dna为模版，分别使用nida和nahac基因特异性引物、诺唯赞公司aceqqpcrsybrgreenmastermix进行qpcr实验，测定一级种子液中上述两个基因的含量。

其中nida引物序列为：

正向引物：ttcccgagtacgagggatac

反向引物：tcacgttgatgaacgacaaa；

nahac引物序列为：

正向引物：acttggttccggagttgatg

反向引物：caggtcagcatgctgttgtt。

(2)待测土壤中nida和nahac含量的测定

取0.25g新鲜的土壤，按照强力土壤dna提取试剂盒说明书提取土壤总dna，-20℃保存。土壤中nida和nahac测定方法同(1)中一级种子液中方法。

表1不同天的数细菌群落组成。

由表1和图1可知，在16天的驯化过程中第10天的群落结构以及nida和nahac的含量满足要求被选为合适的一级种子液。该一级种子液achromobacter、nocardioides、methylobacillus、pseudomonas、pseudoxanthomonas、rhizobium、methylophilus和shinella的含量分别为25.45％、13.26％、10.68％、10.36％、6.02％、3.07％、4.73％和2.10％；nida和nahac的基因丰度为6083和11770。

由图2和图3可知，加入od600值为0.2、0.5和1.0的二级种子液均可以明显降低污染土壤中的pahs含量，其pahs含量从95.23mgkg^-1分别降低到了29.85、28.09和23.41mgkg^-1。其中，2-3和4-5环pahs的降解效率并不与加入的菌量成正相关，但6环pahs降解效率与加入的菌量成正相关。因此，在降解含2-5环pahs较多的土壤时，二级种子液浓度为0.2即可；而降解6环pahs较多的土壤时，二级种子液的浓度可设置为1.0。

由图4可知，加入od600值为0.2、0.5和1.0的二级种子液可以明显提高参与pahs降解、具有编码双加氧酶α亚基功能的nida和nahac基因丰度。上述两个基因丰度的提高加快土壤中pahs降解的效率。

可见，本发明的一种利用驯化、富集的土著pahs降解菌群落去除农田土壤中usepapahs的方法，能够有效的去除土壤中usepapahs，总去除率高达68％以上，且对土壤理化性质无不良影响，具有环保、高效的特点。

根据以上描述，本领域技术人员可以容易地确定本发明的必要特性，并且在不背离其精神和范围的情况下，可以做出本发明的多种变化和修改以使其适应多种用途和情况。因此，其他实施方案也在权利要求的范围内。

序列表

<110>南京农业大学

<120>一种利用土著pahs降解菌群落去除农田土壤中usepapahs的方法

<130>无

<170>patentinversion3.5

<210>1

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<213>人工序列

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<222>(1)..(20)

<223>根据实验要求而设计，作为nida正向引物

<400>1

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<212>dna

<213>人工序列

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<212>dna

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<223>根据实验要求而设计，作为nahac的正向引物

<400>3

acttggttccggagttgatg20

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<212>dna

<213>abramisbrama

<221>misc_feature

<222>(1)..(20)

<223>根据实验要求而设计，作为nahac的反向引物

<400>4

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