疏水化多糖及其制备方法和应用与流程

本发明涉及高分子材料和有机合成技术领域，具体地说，涉及一种疏水化多糖及其制备方法和应用。

背景技术：

没食子酸丙酯是具有抗菌活性的油溶性抗氧化剂，广泛用于食品抗氧化领域。其使用方法一般为，先将没食子酸丙酯溶于植物油，然后添加到食品中。而在一些需要水乳剂的抗菌、抗氧化领域，没食子酸丙酯未能得以应用。例如，没食子酸丙酯无毒，具有抗菌活性，但由于缺乏乳剂产品，无法在漱口水中配合使用。而食品、饲料、药品、中药材的抗菌、防霉和抗氧化，也缺乏无毒、使用方便的产品可供使用。

吲哚乙酸作为植物激素被广泛应用于农业生产领域，但吲哚乙酸难溶于水，使用时需将其溶于氢氧化钠水溶液中制备成钠盐后加水稀释使用。氢氧化钠的强氧化性易使吲哚乙酸失效，有产生浪费并污染土壤和水体的危害，急需解决农药剂型欠佳的问题。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种新型的疏水化多糖及其制备方法。

本发明的另一目的是提供所述疏水化多糖的应用，包括与吲哚乙酸组合使用，以及与没食子酸丙酯组合使用方面的用途。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种疏水化多糖，结构通式如下：g-p-o；其中，g为多糖或二糖(作为亲水性基团)，p为氨基酸或双肽(作为连接臂)，o为油酸(作为疏水性基团)；优选地，g为葡聚糖，p为甘氨酰甘氨酸。g和p之间通过酯键与多糖上的羟基连接，p和o之间通过酰胺键连接。

所述疏水化多糖是葡聚糖与油酸基甘氨酰甘氨酸通过缩合反应，制备以葡聚糖为亲水性基团，以油酸为疏水性基团，以甘氨酰甘氨酸为装载性基团的功能性多糖。

本发明中，所述多糖选自葡聚糖、海藻多糖、淀粉、支链淀粉、直链淀粉、普鲁兰多糖、羟乙基右旋糖酐、甘露聚糖、果聚糖、菊糖、甲壳素、壳聚糖、几丁质、木葡聚糖、水溶性纤维素等中的至少一种。

所述二糖为蔗糖或果糖。

所述氨基酸或双肽选自甘氨酰甘氨酸、谷氨酸、l-赖氨酸、l-半胱氨酸、dl-丙氨酸、dl-蛋氨酸、l-鸟氨酸、γ-氨基丁酸、l-天门冬氨酸、l-茶氨酸、l-精氨酸、β丙氨酸、l-瓜氨酸、l-组氨酸等中的至少一种。

优选地，通式g-p-o中，g为葡聚糖，p为甘氨酰甘氨酸，所述疏水化多糖的结构如式(i)所示：

其中，r1、r2或r3中的任两个为h，其余为n为大于2的任意整数。

所述疏水化多糖是葡聚糖的羟基与甘氨酰甘氨酸的羧基反应，先制备甘氨酰甘氨酸葡聚糖酯，再与油酸反应，使得甘氨酰甘氨酸的氨基与油酸酯化，得疏水化葡聚糖。

第二方面，本发明提供所述疏水化多糖的制备方法，包括以下步骤：

1)多糖或二糖的羟基与氨基酸或双肽的羧基进行酯化反应生成氨基酸或双肽酯化多糖；

2)氨基酸或双肽酯化糖与油酸发生缩合反应，生成疏水化多糖。

当所述疏水化多糖的结构如式(i)所示时，其制备方法如下：

①在有机溶剂中使葡聚糖与氨基保护的甘氨酰甘氨酸反应，加入适量催化剂和脱水剂，反应温度0～60℃，反应时间1～96h，得到甘氨酰甘氨酸葡聚糖酯；

②将甘氨酰甘氨酸葡聚糖酯的氨基保护脱除，具体方法为：将上述甘氨酰甘氨酸葡聚糖酯加入氢氧化钠水溶液中，甘氨酰甘氨酸的氨基迅速游离出，减压干燥除水后，复溶于有机溶剂，加入油酸、催化剂和适量脱水剂，于0～60℃反应1～96h，加水终止反应；

③将②所得反应体系进行过滤，向滤液中加入醇类溶剂，收集沉淀，干燥即得疏水化多糖。

前述的方法，步骤①所述有机溶剂选自二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或二氯甲烷等中的至少一种。

前述的方法，步骤①、②所述催化剂为dmap(4-二甲氨基吡啶)和dcc(二环己基碳二亚胺)，脱水剂为dcc，它们的用量为适量。此外，催化剂也可选择吡啶、浓硫酸；脱水剂可选择分子筛、氯化钙、氯化锌、硫酸镁等无机盐类。

前述的方法，步骤③所述醇类溶剂为无水乙醇或甲醇，所述醇类溶剂的用量为适量。

前述的方法，所述葡聚糖、甘氨酰甘氨酸和油酸的摩尔比为1:1-2:1-2，其中甘氨酰甘氨酸和油酸为摩尔比混合。优选1:1:1或1:2:2。

前述的方法，步骤③中反应体系经过滤，收集滤渣，干燥后，可回收利用dmap及副产物二环己基脲(dcu)。

第三方面，本发明提供所述疏水化多糖，或按照上述方法制备的疏水化多糖的以下任一应用：

a.作为活性成分载体；

b.用于制药或抗菌剂；

其中，所述活性成分包括药物、植物生长激素。

本发明提供的疏水化多糖载体药物可与其他药物复配使用。

第四方面，本发明提供含有所述疏水化多糖，或按照上述方法制备的疏水化多糖以及至少一种活性成分的药物或组合物。

优选地，所述活性成分为没食子酸及其衍生物，更优选没食子酸丙酯。

所述疏水化多糖与没食子酸丙酯的重量比为10:1-10:100，优选10:4-10:50。

更优选地，所述药物或组合物的剂型为水乳剂，平均粒径大小为0～1000nm，优选500nm以下。优选地，所述活性成分为吲哚乙酸及其衍生物，更优选吲哚乙酸。

所述疏水化多糖与吲哚乙酸的重量比为10:1-10:100，优选10:4-10:50。

更优选地，所述药物或组合物的剂型为水溶液。

第五方面，本发明提供所述药物或组合物的制备方法，所述方法包括：将疏水化多糖溶于水中，然后加入没食子酸丙酯或吲哚乙酸，完全溶解后使用探头乳化器或超声波处理直至形成所需粒径的水乳剂或溶液，即得。

图1为疏水化葡聚糖加载没食子酸丙酯后在水溶液中形成的载药粒子直径及其分布状态。疏水化葡聚糖加载没食子酸丙酯后在水溶液中形成的粒子，大多在500纳米以下，较之传统的大于1微米粒径的乳液，具有明显的优势。

图2为疏水化葡聚糖在水溶液中形成的粒子直径及其分布状态。疏水化葡聚糖自组装粒子粒径小于200纳米，多分散，与载药后的粒径明显不同。

第六方面，本发明提供上述由所述疏水化多糖和没食子酸丙酯制备的水乳剂(没食子酸丙酯乳液)在抗菌、抗氧化领域中的应用。

第七方面，发明提供上述由所述疏水化多糖和吲哚乙酸制备的水溶液在植物生长调节中的应用。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)本发明提供的疏水化多糖具有装载性能，可通过氢键与疏水化作用，将没食子酸丙酯装载并分散于水相之中，制备出水溶性没食子酸丙酯载药粒子，可以很好地解决没食子酸丙酯生物相容性差的问题。

(二)本发明提供的疏水化多糖，不仅具有亲水性的多糖链段、疏水的油酸基，还带有氨基酸或双肽的连接臂，没食子酸(或者吲哚乙酸)及其衍生物不仅产生疏水样作用，还有氢键的键合作用，因此，所制备的乳液(或溶液)稳定，低浓度下也不破乳。

(三)本发明疏水化多糖合成所用原料，皆安全、无毒，可用于食品、药品领域。疏水化多糖无毒，可在自然界全分解，无急性毒性，亦无远期毒性。没食子酸丙酯乳液可起抗菌、抗氧化作用。

附图说明

图1为本发明疏水化葡聚糖加载没食子酸丙酯后在水溶液中形成的载药粒子直径及其分布状态。

图2为本发明疏水化葡聚糖在水溶液中形成的粒子直径及其分布状态。

图3为本发明实施例7中没食子酸丙酯水溶液(2.5mg/ml)粒径及其分布状态。

图4为本发明实施例7中没食子酸丙酯水溶液(1.25mg/ml)粒径及其分布状态。

图5为本发明实施例7中没食子酸丙酯水溶液(0.62mg/ml)粒径及其分布状态。

图6为本发明实施例7中没食子酸丙酯水溶液(0.31mg/ml)粒径及其分布状态。

图7为本发明实施例7中没食子酸丙酯水溶液(0.15mg/ml)粒径及其分布状态。

图8为本发明实施例7中没食子酸丙酯水溶液(0.08mg/ml)粒径及其分布状态。

图9为本发明实施例7中没食子酸丙酯水溶液(0.01mg/ml)粒径及其分布状态。

图10为本发明实施例7中没食子酸丙酯载药粒子(2.5mg/ml)粒径及其分布状态。

图11为本发明实施例7中没食子酸丙酯载药粒子(1.25mg/ml)粒径及其分布状态。

图12为本发明实施例7中没食子酸丙酯载药粒子(0.62mg/ml)粒径及其分布状态。

图13为本发明实施例7中没食子酸丙酯载药粒子(0.31mg/ml)粒径及其分布状态。

图14为本发明实施例8中苤蓝丝褐变实验结果。其中，上面两个样品为实验初始时拍摄的照片，a为苤蓝丝上喷洒浓度为0.1％没食子酸丙酯载药粒子样品，b为未喷药的苤蓝丝样品；下面两个样品为实验24h时拍摄的照片，a为苤蓝丝上喷洒浓度为0.1％没食子酸丙酯载药粒子样品，b为未喷药的苤蓝丝样品。

图15为本发明实施例8中苤蓝丝24h褐变实验结果。其中，a为苤蓝丝上喷洒浓度为0.1％没食子酸丙酯载药粒子样品，b为未喷药的苤蓝丝样品。

图16为本发明实施例12中吲哚乙酸载体药物的粒径及其分布状态。

图17为本发明实施例12中小麦浸种第3天图像。

图18为本发明实施例12中小麦浸种第4天图像。

图19为本发明实施例12中小麦浸种第5天图像。

图20为本发明实施例12中小麦浸种第6天图像。

图21为本发明实施例12中小麦浸种第7天图像。

图22为本发明实施例12中小麦浸种第8天图像。

图23为本发明实施例12中小麦浸种第9天图像。

图24为本发明实施例12中小麦浸种第10天图像。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

以下实施例中所用葡聚糖的分子量为10000g/mol。

实施例1疏水化多糖及其制备方法

本实施例制备的疏水化多糖是葡聚糖的羟基与甘氨酰甘氨酸反应，先制备甘氨酰甘氨酸葡聚糖酯，再与油酸反应，使得甘氨酰甘氨酸的羧基被油酸酯化，得疏水化葡聚糖。具体制备方法如下：

1、将100g(0.01mol)葡聚糖溶于2l的n,n二甲基甲酰胺(dmf)中，加1.6g(0.01mol)氨基保护的甘氨酰甘氨酸，加催化剂dmap1g和脱水剂dcc10g，于室温反应48h，过滤去除副产物二环己基脲，滤液加水少量终止反应，加入无水乙醇2l，得到白色沉淀物即为甘氨酰甘氨酸葡聚糖酯。

2、将甘氨酰甘氨酸葡聚糖酯100g加入1n的naoh水溶液1l，脱除保护基，使甘氨酰甘氨酸的氨基游离出来，将反应体系减压蒸馏去除水分。

3、将上述脱保护的甘氨酰甘氨酸葡聚糖酯100g复溶于适量2ldmf中，加入2.8g(0.01mol)油酸，加催化剂dmap1g和脱水剂dcc10g，于室温反应48h，过滤去除副产物二环己基脲，滤液加水少量终止反应，加入无水乙醇2l，得到白色沉淀物即为疏水化葡聚糖。

步骤2、3中反应体系经过滤收集的滤渣为副产物二环己基脲(dcu)，干燥后，可回收利用。

实施例2疏水化多糖及其制备方法

具体制备方法如下：

1、将100g(0.01mol)葡聚糖溶于4l的n,n二甲基甲酰胺(dmf)中，加3.2g(0.02mol)氨基保护的甘氨酰甘氨酸，加催化剂dmap2g和脱水剂dcc20g，于40℃反应24h，过滤去除副产物二环己基脲，滤液加水少量终止反应，加入无水甲醇4l，得到白色沉淀物即为甘氨酰甘氨酸葡聚糖酯。

2、将甘氨酰甘氨酸葡聚糖酯100g加入1n的naoh水溶液2l，脱除保护基，使甘氨酰甘氨酸的氨基游离出来，将反应体系减压蒸馏去除水分。

3、将上述脱保护的甘氨酰甘氨酸葡聚糖酯100g复溶于4ldmf中，加入5.6g(0.02mol)油酸，加催化剂dmap2g和脱水剂dcc20g，于40℃反应24h，过滤去除副产物二环己基脲，滤液加水少量终止反应，加入无水甲醇4l，得到白色沉淀物即为疏水化葡聚糖。

实施例3疏水化多糖及其制备方法

具体制备方法如下：

1、将100g(0.01mol)葡聚糖溶于1l的n,n二甲基甲酰胺(dmf)中，加2.4g(0.015mol)氨基保护的甘氨酰甘氨酸，加催化剂dmap0.5g和脱水剂dcc5g，于50℃反应12h，过滤去除副产物二环己基脲，滤液加水少量终止反应，加入无水乙醇1l，得到白色沉淀物即为甘氨酰甘氨酸葡聚糖酯。

2、将甘氨酰甘氨酸葡聚糖酯100g加入1n的naoh水溶液500ml，脱除保护基，使甘氨酰甘氨酸的氨基游离出来，将反应体系减压蒸馏去除水分。

3、将上述脱保护的甘氨酰甘氨酸葡聚糖酯100g复溶于1ldmf中，加入4.2g(0.015mol)油酸，加催化剂dmap0.5g和脱水剂dcc5g，于50℃反应12h，过滤去除副产物二环己基脲，滤液加水少量终止反应，加入无水乙醇1l，得到白色沉淀物即为疏水化葡聚糖。

实施例4没食子酸丙酯乳液及其制备方法

将实施例1制备的疏水化多糖30g溶于水1l中，然后加入没食子酸丙酯10g，完全溶解后在室温条件下加水3l，使用探头乳化器或超声波处理直至形成平均粒径大小为615.1nm，多分散的水乳剂，即为没食子酸丙酯乳液。

实施例5没食子酸丙酯乳液及其制备方法

将实施例2制备的疏水化多糖30g溶于水500ml中，然后加入没食子酸丙酯20g，完全溶解后在室温条件下加水500ml，使用探头乳化器或超声波处理直至形成粒径小于1μm，多分散的水乳剂，即为没食子酸丙酯乳液。

实施例6没食子酸丙酯乳液及其制备方法

将实施例3制备的疏水化多糖30g溶于水2l中，然后加入没食子酸丙酯5g，完全溶解后在室温条件下加水2l，使用探头乳化器或超声波处理直至形成平均粒径大小为240.1nm(79.3％)和3.1(20.7％)nm，多分散的水乳剂，即为没食子酸丙酯乳液。

实施例7没食子酸丙酯乳液的稳定性与疏水化葡聚糖的增溶性考察

实施例4-6制备的没食子酸丙酯乳液的稳定性与疏水化葡聚糖的增溶性考察。

没食子酸为带有疏水性基团(丙基)的三羟基酚，在水溶液中，以聚集体形式存在，因而难溶于水。图3～图9为不同浓度下的没食子酸丙酯在水溶液中形成的粒子径及其分布，即使稀释至0.01mg/ml的浓度，没食子酸也是以微米级和纳米级的多分散的聚集体形式存在，在水溶液中，不能形成单分子溶液。

将10g没食子酸丙酯与30g疏水化葡聚糖溶于4l水中，乳化，制备成没食子酸丙酯浓度为2.5mg/ml的载药粒子水乳液，稀释，经粒度分布仪检测，其粒径及其分布如图10～图13所示。没食子酸丙酯浓度为2.5mg/ml的载药粒子粒径均小于700nm,多分散，载药粒子以聚集体形式存在，其粒径与分布与没食子酸丙酯水溶液明显不同。而没食子酸丙酯浓度为2.5mg/ml的载药粒子粒径均小于500nm,多分散，载药粒子以聚集体形式存在，其粒径与分布与没食子酸丙酯水溶液明显不同。而没食子酸丙酯载药粒子浓度小于0.62mg/ml以后，乳液中无粒子检测而出。说明，载药粒子在高浓度时以聚集体形式存在，稀释后，聚集体可均匀分布于水溶液中。没食子酸丙酯载药粒子浓度小于0.62mg/ml以后，未见有没食子酸丙酯自聚集体出现。疏水化葡聚糖载体增溶作用明显。

实施例8没食子酸丙酯乳液的应用

实施例4-6制备的没食子酸丙酯乳液的具体应用如下：为考察没食子酸丙酯乳液的抗氧化活性，进行了没食子酸丙酯载药粒子对苤蓝丝褐变影响实验。结果如图14、图15所示。图14a为苤蓝丝上喷洒浓度为0.1％没食子酸丙酯载药粒子样品，图14b为对照苤蓝丝样品。上两个样品为最初开始实验的照片，下两个样品为24h后样品的照片。24h后，对照组苤蓝丝褐变并开始腐烂，喷药组状态良好。图15为图14放大的照片。

实施例9吲哚乙酸水溶液及其制备方法

将实施例1制备的疏水化多糖30g溶于水1l中，然后加入吲哚乙酸10g，完全溶解后在室温条件下加水3l，使用探头乳化器或超声波处理直至形成水溶液。

实施例10吲哚乙酸水溶液及其制备方法

将实施例1制备的疏水化多糖30g溶于水0.5l中，然后加入吲哚乙酸20g，完全溶解后在室温条件下加水0.5l，使用探头乳化器或超声波处理直至形成水溶液。

实施例11吲哚乙酸水溶液及其制备方法

将实施例1制备的疏水化多糖30g溶于水2l中，然后加入吲哚乙酸5g，完全溶解后在室温条件下加水3l，使用探头乳化器或超声波处理直至形成水溶液。

实施例12疏水化葡聚糖的载药性与释药性考察

以实施例9-12制备的吲哚乙酸/疏水化葡聚糖水溶液考察疏水化葡聚糖的载药性与释药性。

为了考察疏水化葡聚糖的载药性与释药性，将难溶性吲哚乙酸10mg,疏水化葡聚糖50mg同溶于2ml水中，超声，制备吲哚乙酸载体药物。稀释成0.5mg/ml的载体药物溶液，经粒度分布仪检测，未见有粒子检出，说明，吲哚乙酸均匀分布于水中。检测结果见图16。

考察吲哚乙酸载药粒子的释药性，采用小麦育苗实验进行。选择颗粒饱满的小麦种子，分别置于槽中，加水浸泡同时用吲哚乙酸载药粒子药液干预。设置高浓度药液组(吲哚乙酸浓度16mg/ml)、中浓度药液组(吲哚乙酸浓度4mg/ml))、低浓度药液组(吲哚乙酸浓度1mg/ml))和对照组。小麦生长状态如图17～图24所示。高浓度药液组明显抑制小麦的生长，低浓度用药组和对照组无差别，说明吲哚乙酸载药粒子可以发挥药效作用。

目前解决没食子酸丙酯以及吲哚乙酸这类难溶性药物，主要采用常规乳化剂进行增溶并与其它药物复配使用。如cn201710812180.7公开了一种复配抗氧化剂，由自由基淬灭剂、过氧化物分解剂、增效剂、乳化剂、助乳化剂和水制备得到，并以微乳液形式存在。所述的乳化剂为司盘-20、吐温-60、吐温-80、甘油脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯、山梨醇酐脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯乳化能力有限中的一种或多种。所述助乳化剂为乙醇、乙二醇、丙二醇、甘油中的一种或多种。这些乳化剂虽均为食品药品乳化剂，但增溶作用有限，毒性偏大。相比而言，本发明的疏水化多糖，载药性、释药性和安全性良好，性能更优越。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。