一种突变型草甘膦降解酶及其克隆、表达与应用的制作方法

本发明属于分子生物学
技术领域：
，具体涉及一种通过定点突变技术获得的对草甘膦催化活性和底物特异性提高的草甘膦降解酶突变体，并进一步公开了该突变体及其编码基因在新型耐草甘膦作物的培育以及草甘膦污染生物降解领域中的应用。
背景技术：
：草甘膦(商品名为roundup)又名n-磷酸亚甲基甘氨酸(n-(phosphonomethyl)glycine，glp)，其分子式为c3h8no5p，相对分子量为169.1，草甘膦与甘氨酸结构类似，属于甘氨酸的衍生物。草甘膦是白色固体，无挥发性，其熔点高(200℃)、稳定性好、在水中溶解度低(1.2％，25℃)。草甘膦是一种非选择性、高效除草剂，在全球应用广泛，也是目前全球使用量最大的农药。草甘膦除草剂通常采用草甘膦的各种盐制剂(如草甘膦异丙胺盐、草甘膦钾盐等)应用，从而提供更加强烈的除草效果。此外，加入一些表面活性剂和增效剂成分可以使草甘膦对植物的渗透性增强。在植物体内，由于芳香族氨基酸会参与维生素、生物碱和吲哚衍生物等多种物质的合成，并在蛋白质合成、细胞分裂等过程中发挥重要的生物功能。因此，生物体内芳香族氨基酸的减少会严重干扰植物的正常代谢，并进而影响植物的生长发育(向文胜,张文吉etal.2000)。研究表明，莽草酸途径对于植物芳香族氨基酸的生物合成具有极其重要的地位，而这一途径的关键酶是5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthase，epsps)，该酶以pep和3-磷酸莽草酸(shikimate-3-phosphate，s3p)为底物，催化合成5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸(epsp)；随后分支酸合成酶催化epsp形成芳香族氨基酸的前体物分支酸。草甘膦作为pep的结构类似物，其在进入植物体内后会竞争性结合epsps，进而影响了epsps与pep之间的正常结合，从而抑制epsps的活性，阻断莽草酸途径，导致次生产物代谢失调，使得植物的生长发育因此受到抑制甚至死亡，最终达到去除杂草的效果。草甘膦作为一种非选择性、高效除草剂，其在农业应用中发挥着重要的作用，但随之带来的确是不得不面对的安全隐患，其一即是如何解决植物中草甘膦降解的问题，其二即是由于草甘膦的非选择性除草作用导致的农作物损失。对于植物中草甘膦的降解问题，目前尚未发现存在于植物中的草甘膦降解基因，而已有研究也表明，草甘膦在土壤中进行降解主要是由微生物进行催化，并报道了相关基因(duke2011)。目前已知的微生物降解草甘膦的途径主要分为两种：其一是通过裂解草甘膦分子中的c-p键，将其降解为磷酸盐(pi)和肌氨酸(sarcosine)；其而则是通过裂解草甘膦分子c-n生成ampa和乙醛酸(duke2011)。自二十世纪八十年代，monsanto公司即发现并阐明属于黄素氧化还原蛋白家族的草甘膦氧化还原酶(glyphosateoxidoreductase，gox)作用机制(barryandkishore1995)，在o2作为协同底物条件下，催化氧化草甘膦断裂c-n键，生成ampa和中间物质希夫碱(shiffbase)，随后希夫碱水解产生乙醛酸和胺甲基磷酸；同时还原态的fad被氧气再氧化，同时氧络黄素环作为中间体催化另一分子草甘膦生成乙醛酸和胺甲基磷酸。此外，早期发现的野生型gox对草甘膦的活性很低，因此barry等人通过体外定向进化的策略来提高gox对草甘膦的氧化活性。借助易错pcr构建随机突变文库，从中筛选获得一株活性提高10倍的突变体(us5776760，us5463175)。而对于抗草甘膦植物的培育问题，由于草甘膦是甘氨酸的衍生物，分子结构具有极大的相似性。研究表明，草甘膦降解酶(glycineoxidase，go)作为一种四聚体黄素氧化酶，与辅因子fad非共价性地结合(job,marconeetal.2002,job,mollaetal.2002)，同样表现出断裂c-n键降解草甘膦的能力。而与gox不同的是，go的催化活性依赖质子转移机制，催化氧化草甘膦生成氨甲基磷酸和乙醛酸，同时产生h2o2。2009年，根据报道的枯草芽孢杆菌草甘膦降解酶(bsugo)的晶体结构，pedotti等人对该酶与草甘膦进行分子对接，利用蛋白质工程手段对该酶进行理性设计。以草甘膦为底物进行活性筛，从所选11个氨基酸的饱和突变中获得三个活性明显提高的突变体。随后将其组合叠加在一个突变体g51s/a54r/h244a中，其草甘膦亲和性(km＝0.5mm)提高175倍、催化效率((kcat/km)提高210倍(pedotti,rosinietal.2009)。这一突变体基因转入紫花苜蓿(medicagosativa)，成功赋予其草甘膦抗性(pollegioni,schonbrunnetal.2011)。目前，抗草甘膦植物培育的方法主要有两种：一种为向植物中导入对草甘膦不敏感的、来源于微生物的epsps编码基因，来源于agrobacteriumtumefacienscp4的epsps(cp4-epeps)对草甘膦抑制不敏感，其编码基因在大豆、玉米、油菜、棉花、苜蓿、甜菜等植物中表达后，能赋予草甘膦较高的抗性，已成功应用于抗草甘膦作物的培育(wo1992/004449a1，us5633435a)；另一种策略为在植物中表达草甘膦乙酰化酶基因，来源于芽孢杆菌的草甘膦乙酰化酶基因gat，经改造后能效率特异性地对草甘膦进行乙酰化修饰，使草甘膦失去活性，已广泛应用于耐草甘膦作物的培育，并成功实现了商业化应用(us7405074b2，ep2535414b1)。但是，诸如以上两种作物耐草甘膦实现策略，均无法分解植物中的草甘膦，而草甘膦在植物中的残留，会给生态环境带来不利影响，而转移到种子中的草甘膦更是给食品造成威胁。而go能够催化降解草甘膦，但其天然底物为甘氨酸，对草甘膦的活性降低，理论上导入植物后会影响植物甘氨酸的代谢，这限制了go的应用开发。因此，在植物中表达草甘膦降解酶编码基因，赋予作物耐受草甘膦的同时消除草甘膦的残留，是解决这一问题的理想途径。因此，草甘膦降解酶及其编码基因在新型抗除草剂作物培育领域，具有极大的应用潜力。技术实现要素：为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种草甘膦降解酶突变体b4s7-f63x，并进一步公开其克隆、表达及应用。为解决上述技术问题，本发明所述的一种草甘膦降解酶突变体b4s7-f63x，所述突变体是在草甘膦降解酶b4s7的基础上，将第63位的苯丙氨酸进行突变为丙氨酸(记为b4s7-f63a)或组氨酸(记为b4s7-f63h)，所述突变体b4s7-f63x包含如seqidno：1或seqidno：3所示的氨基酸序列。具体的，所述的草甘膦降解酶突变体b4s7-f63x，其氨基酸序列如seqidno：1或seqidno：3所示。本发明还公开了一种编码所述草甘膦降解酶突变体b4s7-f63x的基因，包含如seqidno：2或seqidno：4所示的核苷酸序列。具体的，所述的编码所述草甘膦降解酶突变体b4s7-f63x的基因，其核苷酸序列如seqidno：2或seqidno：4所示。本发明还公开了一种含有所述草甘膦降解酶突变体b4s7-f63x编码基因的表达载体，所述表达载体为重组质粒pgex-6p-f63x。本发明还公开了一种含有所述草甘膦降解酶突变体b4s7-f63x编码基因的基因细胞系。本发明还公开了一种含有所述草甘膦降解酶突变体b4s7-f63x编码基因的重组菌。本发明还公开了所述的草甘膦降解酶突变体b4s7-f63x在培育抗草甘膦转基因植物或者培育能够降解草甘膦转基因植物领域中的应用。本发明还公开了一种培育抗草甘膦转基因植物和/或降解草甘膦转基因植物的方法，即包括将所述的草甘膦降解酶突变体b4s7-f63x转化入目的植物的步骤。具体的，所述目的植物包括大豆、玉米、油菜、棉花、苜蓿、甜菜。本发明所述的草甘膦降解酶突变体b4s7-f63x，是在现有草甘膦降解酶b4s7的基础上进行突变改造，改造后的草甘膦降解酶在其第63位的苯丙氨酸进行突变为丙氨酸或组氨酸。相比于亲本b4s7，改造后的突变体b4s7-f63a对草甘膦降解效率提高了6.86倍；改造后的突变体b4s7-f63h对草甘膦的底物特异性提高了4.6倍。对比现有的文献报道和专利数据，b4s7-f63a对草甘膦具有最高的催化效率，b4s7-f63h对草甘膦具有最高的底物特异性。本发明所述草甘膦降解酶突变体是目前人工改造或自然发现的性能最好的草甘膦降解酶，是对草甘膦催化效率和底物特异性最高的突变体，这两个性能改良的草甘膦降解酶编码基因导入植物后，有望赋予植物抗草甘膦的同时，实现草甘膦的高效分解，解决草甘膦在植物中的残留问题，在培育新型耐草甘膦作物及培育能够降解草甘膦的新型抗除草剂植物领域具有极大的应用潜力。附图说明为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，图1为重组质粒pgex-6p-b4s7的质粒图谱；图2为表达载体pgex-6p-1的质粒图谱；图3为本发明构建的重组质粒pgex-6p-f63x的图谱；图4为草甘膦降解酶b4s7-f63h的酶学性质图；其中，a为最适ph曲线，横坐标为不同ph的缓冲液，纵坐标为相对活性；b为b4s7-f63h对ph耐受性，横坐标为不同ph缓冲液，纵坐标为相对活性；c为草甘膦降解酶b4s7-f63h最适温度曲线图，横坐标为不同温度梯度，纵坐标为相对活性；d为草甘膦降解酶b4s7-f63h对温度耐受性图，横坐标为不同的处理温度，纵坐标为相对活性。具体实施方式前期研究中，我们通过体外定向进化技术，获得了一个草甘膦降解酶b4s7(详见中国专利cn104450750a)，该酶能够氧化分解草甘膦和甘氨酸，形成甲基磷酸/乙醛酸和h2o2。已有研究表明，草甘膦降解酶b4s7对草甘膦的km＝0.1mm，kcat＝3.62min-1，kcat/km＝36.2mm-1.min-1，对甘氨酸的km＝50.34mm，kcat＝2.18min-1，kcat/km＝0.04mm-1.min-1，草甘膦降解酶b4s7对草甘膦的特异性常数(kcat/km，草甘膦与kcat/km,甘氨酸之比)为836(intjbiolmacromol79:965-970.)。本发明下述实施例方案中，通过半理性设计策略，继续对草甘膦降解酶b4s7进行结构改造，以提高其对草甘膦的催化效率和特异性常数，进而提高b4s7的应用性能。本发明通过半理性设计策略，对草甘膦降解酶b4s7的第63位的苯丙氨酸(f63)进行突变，进而获得草甘膦降解酶突变体b4s7-f63x，其中，将苯丙氨酸突变为中性氨基酸丙氨酸(a)的突变体记为b4s7-f63a，将苯丙氨酸突变为碱性氨基酸丙氨酸(h)的突变体记为b4s7-f63h，以此类推，x分别突变为分子量较小的氨基酸甘氨酸(g)、碱性氨基酸赖氨酸(k)、碱性氨基酸精氨酸(r)、含羟基的氨基酸丝氨酸(s)和酸性氨基酸天冬氨酸(d)。实施例1草甘膦降解酶第63位氨基酸定点突变研究以重组质粒pgex-6p-b4s7(质粒图谱见附图1所示)为模板(实验室前期构建，参考文献intjbiolmacromol，2015，79：965-970)，利用所设计的扩环引物(见下表1所示)，寡核苷酸介导的pcr定点突变方法(根据stratagene公司的quikchangesite-directedmutagenesiskit试剂盒指导)在草甘膦降解酶的第63位氨基酸残基位点位点引入突变，将其编码基因通过pgex-6p-1(购自美国gehealthcare公司，其质粒图谱见附图2所示)质粒载体上重组为pgex-6p-f63x质粒。具体pcr反应条件为：97℃预变性2min；95℃变性20sec；54℃退火30sec；72℃延伸2min40sec，20个循环；72℃延伸10min。用1％的琼脂糖凝胶检测扩增产物的大小，将大小正确的质粒，通过dpni对其37℃条件下处理1h，以消化模板。利用pcr产物回收试剂盒(杭州爱思进生物技术有限公司)回收经上述处理的产物。吸取1ul回收产物，加入到制备好的dmt大肠杆菌感受态细胞中混匀，电击转化，加入150μl的复苏液sob(每1l培养基：胰蛋白胨20g，酵母粉5g，0.186gkcl、0.952gmgcl2，双蒸水溶解并调节ph至7.0)，于37℃条件下复苏培养1h后涂布在含amp的lb平板上，37℃倒置过夜培养。随机挑取平板上的转化子至lb液体培养基(含amp)，37℃培养过夜。抽提菌体质粒并进行琼脂糖凝胶检测，选择阳性克隆质粒，送武汉擎科伟业生物有限公司测序验证，将含有目标突变的正确质粒用于表达纯化分析。表1分子模拟定点突变引物序列目标突变体引物sequence(5'-3')f63a-fcgtatagcccgctagctgaacttgctf63a-rgctagcgggctatacgcatcccattf63h-fgcgtatagcccgctacatgaacttgctaf63h-rtgtagcgggctatacgcatcccattctf63k-fcgtatagcccgctaaaagaacttgctagaf63k-rttttagcgggctatacgcatcccattcf63s-fgcgtatagcccgctatctgaacttgctaf63s-rgatagcgggctatacgcatcccattcf63r-fgtatagcccgctacgtgaacttgctaf63r-rcgtagcgggctatacgcatcccattcf63d-fgcgtatagcccgctagatgaacttgctaf63d-rtctagcgggctatacgcatcccattcf63g-fgcgtatagcccgctaggtgaacttgctaf63g-rcctagcgggctatacgcatcccattc实施例2草甘膦降解酶突变体蛋白表达与纯化将含突变体f63x基因的重组质粒pgex-6p-f63x(其质粒图谱见附图3所示)与e.colibl21(de3)感受态细胞混合，电击转化，涂布于氨苄青霉素抗性平板(氨苄青霉素浓度100μg/ml)，37℃培养过夜至长出肉眼可见的单克隆。挑取单克隆接种至20ml液体lb培养基(含氨苄青霉素100μg/ml)，37℃、200rpm振荡培养过夜。按1％的量转接菌液至2l新鲜液体lb培养基(含氨苄青霉素100μg/ml)，37℃、200rpm振荡培养至od600为0.6，加入终浓度为0.1mm的诱导剂iptg，22℃、160rpm诱导培养12h使蛋白表达。离心收集菌体，并用50mm焦磷酸钠缓冲液(ph7.0)洗涤两次，然后将菌体重悬于40ml预冷的50mm焦磷酸钠缓冲液(灭菌双蒸水溶解22.3025gna4p2o7·10h2o，并调节ph7.0)。利用高压细胞破碎仪在低温条件下(4-6℃)进行细胞破碎，随后利用高速冷冻离心机于4℃、12000rpm离心30min，收集上清液用于目标蛋白质纯化。取1ml含gst融合蛋白亲和配基的sepharose4b(购自美国gehealthcare公司)，加入到清洗干净的纯化柱中，用50mm预冷的焦磷酸钠缓冲液(ph7.0)洗涤柱材料平衡柱床。将平衡后的柱材料加入到细胞破碎离心后的上清(粗酶液)中混合，在冰上轻轻振荡30min使其与含有gst标签的蛋白(购自美国gehealthcare公司)充分结合。随后，在4℃条件下将柱材料与粗酶液混合物倒入纯化柱，流出的粗酶液重新加入纯化柱，反复两次促使gst融合蛋白与柱材料充分结合。用预冷的50mm焦磷酸钠缓冲液(ph7.0，由十水焦磷酸钠溶于灭菌双蒸水配置而成)洗涤柱材料以除去杂蛋白及未结合的蛋白，缓冲液流速控制在约1ml/min。洗涤完成后，加入600μl含有prescission蛋白酶(150u)的50mm焦磷酸钠缓冲液(ph7.0)，放置过夜，使prescission蛋白酶充分切割gst标签，释放无标签的目标蛋白。加入50mm焦磷酸钠缓冲液(ph8.5)洗脱目标蛋白。利用12％sds-page电泳检测纯化后蛋白的纯度，并用bradford试剂(上海生工生物工程股份有限公司)检测纯化后蛋白的浓度。可见，草甘膦降解酶b4s7及其突变体b4s7-f63x的基因全长均为1110bp，编码369个氨基酸。将其编码基因通过pgex-6p-1质粒载体上重组为pgex-6p-f63x质粒，并克隆到至大肠杆菌(e.coli)bl21(de3)感受态细胞(购自美国invitrogen公司)，通过gst亲和层析系统纯化获得突变体蛋白：b4s7-f63g、b4s7-f63a、b4s7-f63h、b4s7-f63k、b4s7-f63r、b4s7-f63s、b4s7-f63d。实施例3草甘膦降解酶突变体酶学动力学测定本实施例中，草甘膦降解酶及其突变体的酶活测定采用辣根过氧化物酶偶联法(job，marconeetal.2002)，通过测定反应所释放的h2o2量反映酶活性。以邻联茴香胺作为显色底物，草甘膦被草甘膦降解酶氧化分解，产生的h2o2被辣根过氧化物酶氧化释放氧气将邻联茴香胺氧化显示橙红色，在450nm处具有吸收峰，测定od450值入标准曲线从而计算酶活性。(1)酶活测定方法将25℃、最适ph条件下转化1μmol底物(含甘氨酸或氧气)或生成1μmol产物h2o2所需的草甘膦降解酶的酶量定义为一个酶活力单位(unit)。酶活反应体系(200μl)包含：20μl50mm底物(分别为甘氨酸和草甘膦)，20μl0.32mg/ml邻联茴香胺溶液，1μl5u/ml辣根过氧化物酶，一定量的纯化的草甘膦降解酶，用50mm焦磷酸钠缓冲液(ph8.5)补充至体积为200μl。在25℃恒温条件下反应1h，测定od450nm吸光值，计算酶活力。(2)酶学动力学性质测定反应体系同草甘膦降解酶酶活测定方法，底物设为一系列浓度梯度，反应结束后，将酶标仪测得的450nm吸光度值输入软件graphpadprism6.0(为共享软件)，通过标准曲线换算得到km和vmax再代入蛋白浓度计算出催化常数kcat，结果如表2所示。表2突变体酶学动力学常数由表2结果可知，采用邻联茴香胺-h2o2-辣根过氧化物酶伏安酶联免疫分析测定其对草甘膦的氧化活性。七个突变体中，b4s7-f63a对草甘膦的km为0.038mm，kcat为9.454min-1，催化效率kcat/km为248.328mm-1.min-1，相对于亲本b4s7(对草甘膦催化效率kcat/km为36.20mm-1.min-1)，b4s7-f63a对草甘膦的催化活性提高了6.86倍；而另外一个改良的突变体b4s7-f63h，其对草甘膦的km为0.103mm，kcat为4.012min-1，催化效率kcat/km＝38.800mm-1.min-1；亲本b4s7对草甘膦的催化效率kcat/km为36.20mm-1.min-1。相对于亲本，b4s7-f63h对草甘膦的催化效率提高幅度较小，但对草甘膦的底物特异性常数(对草甘膦kcat/km与对甘氨酸kcat/km比值)为3880，与b4s7相比(特异性常数为836)提高了4.6倍。下表3给出了本发明的突变体与已报到的草甘膦降解酶性能比较结果。表3本发明的突变体与已报到的草甘膦降解酶性能比较可见，与已报道的草甘膦降解酶相比，改良后的草甘膦降解酶b4s7-f63h和b4s7-f63a对草甘膦的亲和力、催化效率和底物特异性具有极大的提高。如表2所示，突变体b4s7-f63a为目前已知的对草甘膦催化效率kcat/km最高的酶，其催化效率是b3s1的13倍，是b4s7的4.6倍，是g51s/a54r/h244a的2倍；而突变体b4s7-f63h是已知的对草甘膦特异性最高的酶，其特异性常数是b3s1的25倍，是b4s7的5倍，是g51s/a54r/h244a的30倍。综上，与亲本b4s7相比，本发明所述草甘膦降解酶突变体f63a和f63g均对草甘膦的亲和力有了明显的提高，而f63h对于草甘膦的亲和力与亲本相同，催化效率有所提高，然而f63h对于天然底物甘氨酸的亲和力及催化效率剧烈下降，更好地改变了草甘膦降解酶的的底物特异性，从而获得活性良好的草甘膦降解酶。实施例4草甘膦降解酶f63h酶学性质测定所述草甘膦降解酶b4s7-f63h的酶学性质图见附图4所示。1、最适温度与最适ph的测定最适ph(见图4中的a图)：将酶活反应体系分别用0.2mmna2hpo4-0.1mm柠檬酸缓冲液(ph4.0-8.0)和50mm焦磷酸钠缓冲液(ph8.0-11.0)补充至200μl体系，最适条件下反应1h后，测定od450nm吸光值，将最大酶活性定义为100％，计算不同ph条件下的相对活性，确定酶的最适ph(zhan,zhangetal.2013)。最适温度(见图4中的c图)：在最适的条件下，将酶活反应体系置于不同温度条件(0-70℃)下反应1h，测定od450nm吸光值，将最大酶活性定义为100％，计算不同温度条件下的相对活性，确定草甘膦降解酶的最适温度(zhan,zhangetal.2013)。2、ph耐受性和温度耐受性的测定ph耐受性(见图4中的b图)：0℃条件下，在ph4.0-8.0的0.2mmna2hpo4-0.1mm柠檬酸缓冲液和ph8.0-11.0的50mm焦磷酸钠缓冲液中将酶液处理6h，最适条件反应1h，测定od450nm吸光值，将最大酶活性定义为100％测定酶活性，计算相对酶活，研究草甘膦降解酶对ph的耐受性(zhan,zhangetal.2013)。温度耐受性(见图4中的d图)：将酶液在不同温度梯度(0-70℃，每10℃一个间隔)下处理1h，再置于最适条件下反应1h测定酶活，将最大酶活性定义为100％，计算相对酶活，研究草甘膦降解酶对温度的耐受性(zhan,zhangetal.2013)。与亲本b4s7相比，草甘膦降解酶f63h的最适反应ph由8.5变为8.0，即在ph8.0时具有最高活性；不同ph梯度处理该酶6小时后，ph5.5-11.0条件下f63h均维持了最大活性的70％以上，在ph5.0以下表现为急剧下降，在ph4.0是直接丧失了活性。因此，f63h能很好地适应中性及碱性条件，这也更适合于其在植物体内表达。通过测定温度对酶活性的影响发现：草甘膦降解酶f63h的最适反应温度从60℃变为50℃，在0-30℃之间，f63h的酶活性可以保持90％以上；当温度大于30℃时，f63h的酶活性开始下降；温度高于50℃时，酶活性急剧下降。因此，f63h在低温及中温条件下能保持较高活性，这也进一步接近了植物正常生长的温度范围。因而，该草甘膦降解酶f63h在草甘膦抗性作物培育方面具有潜在应用价值。显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。序列表<110><120>一种突变型草甘膦降解酶及其克隆、表达与应用<130>pi19b0203cn<160>4<170>patentinversion3.5<210>1<211>369<212>prt<213>b4s7-f63a<400>1metcyslyslystyraspvalalaileileglyglyglyvalilegly151015serservalalahispheleualagluargglyhislysvalalaile202530valglulysglnserilealaserglualaserlysalaalaalagly354045leuleuargvalglnalaglutrpaspalatyrserproleualaglu505560leualaarggluserargalailepheproglnleualaalavalleu65707580argglulysthrglyvalaspileglytyrgluglulysglyiletyr859095argilealaglnasngluaspglulysgluargileleuhisilemet100105110asptrpglnglnlysalaglygluaspsertyrpheleuthrglyasp115120125hisvalarggluarggluprotyrleusergluserileileglyala130135140valtyrtyrprolysaspglyhisvalilealaprogluleuthrlys145150155160alaphealahisseralaalaileserglyalaaspiletyrglugln165170175thrgluvalpheaspileargilegluasnasnlysvalthrglyval180185190ilethrsergluglyilevalthrcysglulysvalvalileaalgly195200205glysertrpserthrlysleuleusertyrphehisargasptrpgly210215220thrtyrprovallysglygluvalvalalavalargserarglysgln225230235240leuleulysalaproileserglngluargphetyrilethrprolys245250255argglyglyargtyrileileglyalathrmetlysprohisthrphe260265270asnlysthrvalglnprogluserilethrserleuleugluargala275280285tyrthrileleuproalaleulysglualaglutrpgluserthrtrp290295300alaglyleuargproglnserasnhisglualaprotyrmetglyglu305310315320hisglugluilelysglyleutyrthrcysthrglyhistyrargasn325330335glyileleuleuserproileserglyglntyrmetalaaspleuile340345350gluglylysglngluasnhisleuleuaspserleuleuserlysthr355360365val369<210>2<211>369<212>prt<213>b4s7-f63h<400>2metcyslyslystyraspvalalaileileglyglyglyvalilegly151015serservalalahispheleualagluargglyhislysvalalaile202530valglulysglnserilealaserglualaserlysalaalaalagly354045leuleuargvalglnalaglutrpaspalatyrserproleuhisglu505560leualaarggluserargalailepheproglnleualaalavalleu65707580argglulysthrglyvalaspileglytyrgluglulysglyiletyr859095argilealaglnasngluaspglulysgluargileleuhisilemet100105110asptrpglnglnlysalaglygluaspsertyrpheleuthrglyasp115120125hisvalarggluarggluprotyrleusergluserileileglyala130135140valtyrtyrprolysaspglyhisvalilealaprogluleuthrlys145150155160alaphealahisseralaalaileserglyalaaspiletyrglugln165170175thrgluvalpheaspileargilegluasnasnlysvalthrglyval180185190ilethrsergluglyilevalthrcysglulysvalvalileaalgly195200205glysertrpserthrlysleuleusertyrphehisargasptrpgly210215220thrtyrprovallysglygluvalvalalavalargserarglysgln225230235240leuleulysalaproileserglngluargphetyrilethrprolys245250255argglyglyargtyrileileglyalathrmetlysprohisthrphe260265270asnlysthrvalglnprogluserilethrserleuleugluargala275280285tyrthrileleuproalaleulysglualaglutrpgluserthrtrp290295300alaglyleuargproglnserasnhisglualaprotyrmetglyglu305310315320hisglugluilelysglyleutyrthrcysthrglyhistyrargasn325330335glyileleuleuserproileserglyglntyrmetalaaspleuile340345350gluglylysglngluasnhisleuleuaspserleuleuserlysthr355360365val369<210>3<211>1110<212>dna<213>b4s7-f63a<400>3atgtgtaagaagtatgatgtagcgataattggtggtggtgtaattggtagttcagttgcg60cattttctagcagaaagaggacataaggtagcgattgtggagaagcaaagtattgcatcg120gaagcttcaaaagcagctgctggtttacttcgtgttcaggcagaatgggatgcgtatagc180ccgctagctgaacttgctagagagagccgagctatatttccgcaacttgcagcagtttta240cgtgaaaagacgggtgttgatattggatatgaagaaaaaggaatttatcgtattgctcaa300aatgaagatgagaaggaaagaattcttcacatcatggattggcagcagaaagcaggtgaa360gattcttattttctaacgggagaccacgtgcgggaaagagagccatatctatccgaatct420attataggagcagtatattatccgaaagacggtcatgttattgcgccagagcttacgaaa480gcattcgcacattctgcagcgatttccggtgctgatatatatgaacagacagaagtattt540gatatccgtattgaaaataataaagtgactggagttatcacaagtgaaggtattgtcaca600tgtgagaaagtcgttattgcaggaggttcatggagcacgaagttactcagttattttcac660cgcgattggggtacatatccagttaaaggagaagtggttgcggtaagaagtagaaaacaa720cttttaaaagcacctatctctcaagaaagattttacattactccaaagcgcggtggacgt780tacataattggggcaacaatgaagccacatacgttcaataaaactgtgcagccagaaagt840ataacttctttattagagcgtgcttatacaatattgccagctttaaaagaagcagaatgg900gaaagcacgtgggcaggactaagaccacaatcgaatcatgaagctccttatatgggagag960catgaagaaataaaaggtttatatacttgcacgggccattatcgaaacggtattttatta1020agtcctatttctggccaatatatggctgatttaatagaaggaaagcaagagaatcatttg1080ctagattcattgctttctaagaccgtttag1110<210>4<211>1110<212>dna<213>b4s7-f63h<400>4atgtgtaagaagtatgatgtagcgataattggtggtggtgtaattggtagttcagttgcg60cattttctagcagaaagaggacataaggtagcgattgtggagaagcaaagtattgcatcg120gaagcttcaaaagcagctgctggtttacttcgtgttcaggcagaatgggatgcgtatagc180ccgctacatgaacttgctagagagagccgagctatatttccgcaacttgcagcagtttta240cgtgaaaagacgggtgttgatattggatatgaagaaaaaggaatttatcgtattgctcaa300aatgaagatgagaaggaaagaattcttcacatcatggattggcagcagaaagcaggtgaa360gattcttattttctaacgggagaccacgtgcgggaaagagagccatatctatccgaatct420attataggagcagtatattatccgaaagacggtcatgttattgcgccagagcttacgaaa480gcattcgcacattctgcagcgatttccggtgctgatatatatgaacagacagaagtattt540gatatccgtattgaaaataataaagtgactggagttatcacaagtgaaggtattgtcaca600tgtgagaaagtcgttattgcaggaggttcatggagcacgaagttactcagttattttcac660cgcgattggggtacatatccagttaaaggagaagtggttgcggtaagaagtagaaaacaa720cttttaaaagcacctatctctcaagaaagattttacattactccaaagcgcggtggacgt780tacataattggggcaacaatgaagccacatacgttcaataaaactgtgcagccagaaagt840ataacttctttattagagcgtgcttatacaatattgccagctttaaaagaagcagaatgg900gaaagcacgtgggcaggactaagaccacaatcgaatcatgaagctccttatatgggagag960catgaagaaataaaaggtttatatacttgcacgggccattatcgaaacggtattttatta1020agtcctatttctggccaatatatggctgatttaatagaaggaaagcaagagaatcatttg1080ctagattcattgctttctaagaccgtttag1110当前第1页12