本发明涉及三维生物打印
技术领域：
：，特别涉及一种用于三维生物打印的复合水凝胶。
背景技术：
：：三维生物打印利用生物墨水来打印支架，在时尚、工具、食品工业和建筑等多个不同领域发挥着重要作用。可目前最广泛使用的生物墨水材料是水凝胶材料，其主要分为两类：(1)合成的水凝胶材料，如聚己内酯(pcl)、聚乳酸(pla)、聚乙二醇(peg)、聚糖内酯(pga)；(2)天然的水凝胶，如明胶、纤维蛋白、胶原蛋白、壳聚糖和海藻酸盐等。合成的水凝胶打印出的支架通常具有良好的力学性能，这些水凝胶的分子量可控，并且是可降解的。然而，这些合成的水凝胶的一些降解产物是有毒的，且生物相容性较差。而天然水凝胶具有较好的生物相容性、无毒性和可生物降解性，可以提高细胞的粘附和迁移能力。然而，天然水凝胶打印的支架的力学性能较差，此外，由于提取和分离过程复杂，通常价格昂贵。如上所述，合成法获得的水凝胶和天然水凝胶具有各自的优势和劣势。因而仍存在对具有较好的力学性能和生物兼容性的水凝胶材料的需求。技术实现要素：针对以上不足，本发明的主要目的在于提供一种用于三维生物打印的复合水凝胶，由该复合水凝胶打印而成的支架，以及利用该支架培养细胞的方法。本发明的一方面提供一种用于三维生物打印的复合水凝胶，包括：纤维素纳米纤维，其在复合水凝胶中的含量小于10％w/v；海藻酸盐，其在复合水凝胶中的含量小于5.0％w/v；和豆类蛋白，其在复合水凝胶中的含量小于20％w/v。在一个实施例中，所述豆类蛋白衍生自大豆、绿豆、黑芸豆、红小豆、黑豌豆、绿扁豆。在一个实施例中，所述海藻酸盐为海藻酸钠。在一个实施例中，所述复合水凝胶包括在复合水凝胶中的含量为1.0％w/v-3.5％w/v的纤维素纳米纤维。在一个实施例中，所述豆类蛋白富含球蛋白。在一个实施例中，所述豆类蛋白为绿扁豆蛋白。在一个实施例中，所述复合水凝胶包括：在复合水凝胶中的含量为1.0％w/v-3.5％w/v的纤维素纳米纤维；在复合水凝胶中的含量为0.5％w/v-1.0％w/v的海藻酸钠；和在复合水凝胶中的含量为4％w/v至12％w/v的绿扁豆蛋白。在一个实施例中，所述复合水凝胶为食品级。本发明的另一方面提供一种由上述复合水凝胶制备的支架。本发明的再一方面提供一种用上述支架培养细胞的方法，所述方法包括将细胞接种到所述支架上进行培养。本申请的复合水凝胶由于其所使用的材料全部来源于植物，因此所打印的支架可用于食品行业，例如肉制品的3d打印。使用本申请的复合水凝胶作为生物墨水，与动物源的生物墨水相比，一方面降低了打印成本；另外一方面也避免了由于动物的批次不同而导致的不稳定性。此外，植物源生物墨水不含动物病菌，因此避免了在用3d支架培养时动物病菌的传播。此外，本申请的复合水凝胶材料所打印的支架具有良好的机械性能，并能够提高细胞的粘附性。该支架同时具有良好的生物相容性，且易于降解，更重要的是，用本申请的复合水凝胶材料制备的生物支架是可食用的，可以给人造肉的研发带来强有力的支架支撑。附图说明图1为显示各种冻干的植物蛋白在去离子水(ph7.20,1mnaoh)中的溶解度(高达20％，w/v)的图；其中mbp为绿豆蛋白，btbp为黑芸豆蛋白，abp为红小豆蛋白，bep为黑豌豆蛋白，glp为绿扁豆蛋白。图2为不同植物蛋白的sds-page结果。泳道1为蛋白质分子量标准品，泳道2为绿豆蛋白(mbp)，泳道3为黑芸豆蛋白(btbp)，泳道4为红小豆蛋白(abp)，泳道5为黑豌豆蛋白(bep)，泳道6为绿扁豆蛋白(glp)。图3为不同浓度的纤维素纳米纤维(cnf)水凝胶的粘度和ph值。图4显示海藻酸钠(sa)添加量对3.5％w/vcnf水凝胶流变性能的影响。图5为：(a)显示不同sa添加量对3.5％w/vcnf水凝胶墨水打印压力的影响；(b)不同sa添加量对3.5％w/vcnf水凝胶墨水打印的小圆柱体支架直径的影响。图6为cnf、sa、glp、包含cnf和sa的水凝胶墨水，以及包含cnf、sa和glp的复合水凝胶墨水的红外光谱(kbr压片)。图7为含有cnf和sa的水凝胶墨水和含有不同配比的cnf、sa和glp的复合水凝胶墨水的流变性能。图8为包含cnf、sa和glp的复合水凝胶支架的质构分析。图9为包含不同比率的glp的复合水凝胶支架在10mmpbs缓冲液中的吸水溶胀性能。图10为cnf、sa和glp复合水凝胶支架的酶法降解，其中(a)酶降解8天后支架的形态；(b)酶处理8天过程中支架降解的动力学曲线。图11为以配方为3.5％w/vcnf+0.5％w/vsa(对照)和以配方为12％w/vglp的复合水凝胶墨水打印而成的支架形貌。图12a为含支架提取液培养的mc3t3-e1细胞的增殖情况。图12b为细胞在复合水凝胶支架上的增殖结果显示添加glp的复合水凝胶支架的活细胞数较高。具体实施方式以下将结合附图所示的具体实施方式对本申请进行详细描述。但这些实施方式并不限制本申请，本领域的普通技术人员根据这些实施方式所做出的结构、方法、或功能上的变换均包含在本申请的保护范围内。本发明提供一种用于三维生物打印的复合水凝胶，包括：在复合水凝胶中的含量小于10％w/v的纤维素纳米纤维；在复合水凝胶中的含量小于5.0％w/v的海藻酸盐；和在复合水凝胶中的含量小于20％w/v的豆类蛋白。所述豆类蛋白为由双子叶植物纲豆科植物衍生的蛋白，例如，可以衍生自大豆、绿豆、黑芸豆、红小豆、黑豌豆、绿扁豆。豆类蛋白具有较好的水溶性。并且，在一个优选的实施例中，所述豆类蛋白为富含球蛋白的豆类蛋白。特别地，在一个更优选的实施例中，所述豆类蛋白衍生自绿扁豆。所述海藻酸盐可以为从植物褐藻分离而得，并且在二价阳离子(ca2+，mg2+)存在的条件下具有较好的交联能力。优选地，所述海藻酸盐为海藻酸钠。优选地，所述海藻酸钠在复合水凝胶中的含量为0.5％w/v-1.0％w/v。所述复合水凝胶可以包括在复合水凝胶中的含量为1.0％w/v-3.5％w/v的纤维素纳米纤维。优选地，所述复合水凝胶包括：1.0％w/v-3.5％w/v的纤维素纳米纤维；0.5％w/v-1.0％w/v的海藻酸钠；和4％w/v至12％w/v的绿扁豆蛋白。在一个实施例中，所述复合水凝胶为食品级。更优选地，所述复合水凝胶包括12％w/v的绿扁豆蛋白。上述复合水凝胶可用于生物支架打印，从而应用于器官移植和组织工程领域。并且上述复合水凝胶所含的成分比如，纤维素纳米纤维、海藻酸盐和豆类蛋白可以是食品级的，从而可用于制备可食用的支架、例如用于肉制品打印。此外，由上述复合水凝胶制备的支架可用于培养细胞。实施例材料与试剂本申请中使用的豆子(绿豆mbp、黑芸豆btb、红小豆ab、黑豌豆be、绿扁豆gl)均为普通市售豆子。纤维素纳米纤维(cnf)购自奇宏科技(桂林，广西，中国)。海藻酸钠(sa)、考马斯亮蓝(coomassiebrilliantblueg)和2-巯基乙醇(2-me)购自新加坡sigma-aldrichchemicalco.。蛋白分子量标准品、缓冲液、凝胶均购自新加坡bio-radlaboratoriespte.ltd.。tris-缓冲液,细胞计数kit-8和memα-media购自thermofisherscientific(新加坡)。所使用的所有其他化学品均为分析级。植物种子蛋白提取将各种市售豆子用高速粉碎机粉碎，过筛(200目)得到细粉。细粉(100克)分散在1.5l去离子水中，然后调整混合液ph值(ph＝9，1mnaoh)，在室温下混合震荡20分钟，之后离心(10000×g)10分钟。收集上层清液，加入1mhcl，将ph值调整为4.6，达到蛋白质等电点。通过离心(10000×g，10min)分离获得蛋白质沉淀。获取的蛋白质沉淀用去离子水冲洗两次。之后将蛋白质固体分散于去离子水中，加入1mnaoh将混合液ph值调整至7.2，使蛋白质完全溶解。如图1所示，各种冻干的植物蛋白在去离子水(ph7.20,1mnaoh)中具有良好的溶解度(高达20％，w/v)。蛋白溶液在冻干机内冻干5天，蛋白质产率分别为19％(mb)、12％(btb)、15％(ab)、13％(bep)和12.3％(glp)。根据元素分析，这些蛋白质的纯度约为80％。将冻干蛋白质溶解在5％sds(w/w)的溶液中，获得4mg/ml蛋白质溶液样品，样品在85℃水浴锅中加热50分钟。之后，蛋白质溶液样品和缓冲液以1：1(v/v)混合并煮沸5分钟。冷却到室温后，将10μl各蛋白质样品和蛋白质分子量标准品分别加入到凝胶板中，恒压120v电泳50min。图2中的sds-page结果显示，不同的植物蛋白具有不同的蛋白质组分，大部分蛋白质的分子量介于15-100kda之间。其中，在绿扁豆蛋白的sds-page图条上发现分子量为50kda左右时有三条条带，而其它的种子蛋白只显示一条或两条条带。这些分子量为50kda的蛋白被认为是绿扁豆中的球蛋白(48kda)。此外，分子量在25kda以下的条带，可能是白蛋白多肽的混合物，也可能是存储蛋白裂解产生的多肽。由此可知，绿扁豆中的主要蛋白质是球蛋白，碱溶液提取后采用等电点沉降法会产生富含球蛋白组分的分离蛋白。水凝胶基质的筛选纤维素纳米纤维(cnf)在室温下保持流动性。此外，随着cnf浓度的增加，cnf水凝胶的粘度和ph值也随之增加(图3中的左侧)，而cnf溶液的ph值在7-8之间(图3中的右侧)，适合于蛋白质的溶解。为了适合于3d打印，水凝胶在打印过程中必须具有足够的粘度以保持其形状，并且必须具有较好的交联能力，使其在打印后能够保持三维结构。因此，寻找合适的交联剂是非常重要的。交联可以通过温度变化、紫外光聚合和离子交联来实现[1]。从褐藻中分离得到的海藻酸钠(sa)在二价阳离子(如ca2+、mg2+)存在条件下，具有较强的交联能力。更重要的是，它也是一种植物源材料，这确保了我们墨水基质的所有材料均来自于植物。cnf、sa和glp复合水凝胶墨水的制备配方一：将0.5％w/v海藻酸钠(sa)溶解在去离子水中(60℃，1h)，得到sa溶液。冷却至室温后，将3.5％w/vcnf添加到sa溶液中，在20000转/分钟条件下均质4分钟。混合物在10000×g条件下离心5分钟，以去除高速均质过程中产生的气泡。配方二：将1.0％w/v海藻酸钠(sa)溶解在去离子水中(60℃，1h)，得到sa溶液。冷却至室温后，将3.5％w/vcnf添加到sa溶液中，在20000转/分钟条件下均质4分钟。混合物在10000×g条件下离心5分钟，以去除高速均质过程中产生的气泡。配方三：将1.5％w/v海藻酸钠(sa)溶解在去离子水中(60℃，1h)，得到sa溶液。冷却至室温后，将3.5％w/vcnf添加到sa溶液中，在20000转/分钟条件下均质4分钟。混合物在10000×g条件下离心5分钟，以去除高速均质过程中产生的气泡。配方四：将0.5％w/v海藻酸钠(sa)溶解在去离子水中(60℃，1h)，得到sa溶液。冷却至室温后，将3.5％w/vcnf和4.0％w/vglp添加到sa溶液中，在20000转/分钟条件下均质4分钟。混合物在10000×g条件下离心5分钟，以去除高速均质过程中产生的气泡。配方五：将0.5％w/v海藻酸钠(sa)溶解在去离子水中(60℃，1h)，得到sa溶液。冷却至室温后，将3.5％w/vcnf和8.0％w/vglp添加到sa溶液中，在20000转/分钟条件下均质4分钟。混合物在10000×g条件下离心5分钟，以去除高速均质过程中产生的气泡。配方六：将0.5％w/v海藻酸钠(sa)溶解在去离子水中(60℃，1h)，得到sa溶液。冷却至室温后，将3.5％w/vcnf和12.0％w/vglp添加到sa溶液中，在20000转/分钟条件下均质4分钟。混合物在10000×g条件下离心5分钟，以去除高速均质过程中产生的气泡。为了研究sa对cnf水凝胶流变学和理化性质的影响，根据上述过程制备多种不同的水凝胶墨水和复合水凝胶墨水，即，作为对照组的含有3.5％w/v的cnf和不同配比的sa(0％w/v、0.5％w/v、1.5％w/v和2.0％w/v)的水凝胶墨水；以及含有3.5％w/vcnf、0.5％w/vsa和不同glp添加量(0％w/v、4％w/v、8％w/v和12％w/v)的复合水凝胶墨水。如图4所示，比较和确定了cnf和sa在流变性能和打印性能方面的最佳配比。图4中的a显示流变学分析结果：所有的水凝胶墨水均为剪切变薄。值得注意的是，在低剪切速率下，sa的加入显著降低了水凝胶墨水的初始粘度值，而在高剪切速率下，sa的加入使水凝胶墨水的粘度略有提高(图4中的a)，这说明水凝胶墨水的粘度取决于sa的加入量。此外，sa的加入降低了低频下的存储模量g'(图4中的b)和损耗模量g”(图4中的c)。然而，值得注意的是随着频率的增加，sa添加量越多，g'和g”的增长率也就越高。存储模量(g')和损耗模量(g”)的比值tanδ，用于评估水凝胶的成胶性能，当tanδ值低于1时，胶状性能好；当tanδ值高于1时，液态状性能好。结果显示(图4中的d)，制备的含有3.5％w/v的cnf和0％w/v、0.5％w/v、1.5％w/v或2.0％w/vsa的水凝胶墨水均成胶状。对于打印性能，随着sa添加量的增加，打印压力也随之增大(图5a)。此外，还评估了sa添加量对交联前后小圆柱体支架形状和尺寸变化的影响。试验中，所有的小圆柱体支架采用相同的打印条件。纯3.5％cnf支架和0.5％sa添加量的支架交联前尺寸相近，而1.0％和1.5％(w/v)sa添加量的支架尺寸增大(从8.3mm增大到9.5mm)(图5b)。然而，交联后发现，在形状上有很大的变化，加入sa的支架直径比3.5％的cnf对照组支架直径几乎减少了1mm(图5b)。综合以上结果，3.5％cnf+0.5％sa的复合水凝胶是较合适与蛋白质结合的水凝胶基质。傅立叶变换红外光谱(ftir)将各种水凝胶墨水和复合水凝胶墨水冷冻干燥，进行ftir分析。在2mg冷冻干燥的样品中以1:50(w/w)的比例加入溴化钾(kbr)，进行研磨，并压制成kbr薄片。采用傅里叶变换红外光谱仪分析(perkinelmer,ma,usa)记录500～4000cm-1的红外光谱。测量的分辨率为4cm-1，在基线校正前进行32次扫描叠加。cnf、sa、glp、包含cnf和sa的水凝胶墨水，以及包含cnf、sa和glp的复合水凝胶墨水的红外光谱如图6所示。所有样品中3800-3000cm-1的宽峰归属于分子间氢键的羟基伸缩振动。2996-2880cm-1峰属于亚甲基和甲基纤维素基团的ch-键和ch2-键的伸缩振动。吸收峰在1418cm-1和1159cm-1处分别是cnf结构中的δ(ch2)对称弯曲和c-o-c不对称伸展振动。位于1651cm-1和1541cm-1处的特征峰分别归属于-co-nh基团中的n-h平面弯曲、n-c的伸缩振动和β-sheet绿扁豆蛋白质。cnf、sa和glp复合水凝胶墨水的流变学特性制备了四种不同的水凝胶墨水分别为：包含3.5％w/vcnf和0.5％w/vsa(即，3.5％cnf+0.5％sa)、包含3.5％w/vcnf、0.5％w/vsa、和4％w/vglp(即，3.5％cnf+0.5％sa+4％glp)、包含3.5％w/vcnf、0.5％w/vsa、和8％w/vglp(即，3.5％cnf+0.5％sa+8％glp)、以及包含3.5％w/vcnf、0.5％w/vsa、和12％w/vglp(即，3.5％cnf+0.5％sa+12％glp)的复合水凝胶墨水。将制备的水凝胶墨水和复合水凝胶墨水用antonpaarmcr102stress-controlled流变仪(antonpaar,graz,austria)测定其流变学性质。所用的不锈钢平板直径为25mm，角度为1°。将适量水凝胶墨水和复合水凝胶墨水放置于流变仪底部托盘，两个平行平板的间隙设置为0.5mm。在测量过程中使用葵花籽油覆盖，防止水分蒸发，所有测量在25℃条件下进行。本实验中对制备的复合水凝胶墨水进行了三种不同的流变特性测试，分别为：(a)剪切粘度(η)，即在控制旋转方式下测量剪切速率(0.1-150-1s)与粘度的对数关系。(b)线性粘弹性区域(lvr)，定义为在1hz频率下，进行扫描获得0.1-100pa的振荡幅值。根据lvr的结果，选取10pa的应力条件进行频率范围为0.01-10hz的振荡频率测量。根据复合水凝胶墨水在1hz频率下，获取的范围为0.01-10％的张力扫描振荡幅值可知，当张力振荡幅值为0.1％时，所有复合水凝胶墨水的振荡幅值在lvr范围内。(c)复合水凝胶墨水在0.1％应变和1hz频率条件下扫描30分钟时的储能模量(g')和损耗模量(g”)。水凝胶墨水的缠结网络结构可以表现出墨水的力学性能、粘弹性能和胶凝性能。图7所示为水凝胶墨水和复合水凝胶墨水的流变学特性。所有制备的复合水凝胶墨水的粘度均随剪切速率的增加而显著降低，即剪切变薄(图7中的a)。这些水凝胶墨水的剪切变薄可以归结为纯机械破坏。因此，这些复合水凝胶墨水可视为伪塑性材料。此外，值得注意的是，glp的加入在低剪切速率下增加了墨水粘度值，但在高剪切速率下却不影响墨水粘度值(图7中的a)。这表明，glp的加入可以改善cnf纤维间的相互作用和缠结网络，从而导致起始剪切速率下粘度的增加。随着剪切速率的增加，这些相互作用逐渐被破坏，导致粘度不断下降(图7中的a)。在所有配制的复合水凝胶墨水中，储存模量(g')和损耗模量(g”)相对独立于角频率。可见，所有复合水凝胶墨水均表现出g'>g”的胶状行为(图7中的b和c)。与3.5％cnf+0.5％sa对照组水凝胶墨水相比，添加了glp的复合水凝胶增加了g'和g”的值。此外，与cnf对照组水凝胶墨水相比，cnf、sa与glp通过形成更复杂的网络结构并相互作用，可能会导致更高的g'和g”值。另一个值得注意的现象是，在所有配制的复合水凝胶墨水中，存储模量g'大约是损耗模量g”的10倍，这也表明复合水凝胶形成了一个较为复杂的的网络结构。在实验所用的测量频率范围内，所有水凝胶墨水和复合水凝胶墨水的tanδ值低于1，这进一步表明，复合水凝胶墨水主要是弹性胶状。此外，所有复合水凝胶墨水的tanδ值首先显示略有降低，然后随着频率的增加而增加，表明弹性降低，即为弱凝胶。在10hz的频率时，添加glp的复合水凝胶的tanδ值从0.75(3.5％cnf+0.5％sa对照组)下降到0.44(glp添加量为12％w/v时)，表明glp的添加能提高水凝胶墨水的凝胶性能(图7中的d)。cnf、sa和glp复合水凝胶墨水小圆柱体支架的质构分析将3.5％cnf+0.5％sa水凝胶墨水(200μl)和本发明的复合水凝胶墨水(200μl)制作的小圆柱体支架(即，水凝胶支架和复合水凝胶支架，直径8mm，高度4mm)在90mm的氯化钙溶液中交联2h，之后用ta-xt2i质构仪(stablemicrosystemltd.,godalming,surrey,uk)对支架进行质构分析。交联后的支架直径及高度由游标卡尺测定。在室温条件下，用直径为20mm的圆柱形探针对湿态圆柱体支架进行质构分析(tpa)。ta-xt2i质构仪的参数设置如下：试验时探针移动速度为1.0mm/s，试验后探针移动速度为3.0mm/s，应变为40％。湿态圆柱体支架的硬度、粘附性、弹性、回弹性均由质构分析的受力-时间曲线得到(n＝4)。复合水凝胶支架的质构结果显示，与3.5％cnf+0.5％sa对照组相比，添加glp的支架硬度随其添加量的增加而逐渐降低。cnf、sa和glp复合水凝胶墨水小圆柱体支架吸水溶胀性如7所述，将制备的交联后的圆柱体支架置于37℃的真空干燥箱中干燥至恒重并记录初始重量(wi)。将干燥后的支架分置于24孔板中并浸泡在2mlpbs缓冲液(10mm)中，将平板放于37℃的恒温箱中吸水溶胀，定时记录支架吸水溶胀后的重量(ws)。支架的吸水溶胀比(esr)计算公式如下：通过分析复合水凝胶支架在10mmpbs缓冲液中的重量随时间的变化情况，对支架的溶胀能力进行了研究。结果表明，所有配比的支架都显示了较好的吸水能力，浸泡8小时后，支架质量达到平衡(图9)。值得注意的是，与3.5％cnf+0.5％sa对照组支架相比(2116.25±279.90％)，添加了glp的支架的吸水能力随其添加量的增加而显著降低，且glp添加量为12％w/v的支架的溶胀率仅为601.98±19.36％。这可能是由于cnf、sa和glp复合水凝胶支架和3.5％cnf+0.5％sa对照组支架的孔隙率不同造成的。cnf、sa和glp复合水凝胶支架的体外酶法降解如7所述，将制备的一系列复合水凝胶支架，冷冻干燥至恒重(wi)，经无菌处理后分别置于37℃的10mm无菌缓冲液中或0.25％的无菌胰蛋白酶溶液中。定期从37℃的恒温箱中取出样品并干燥至恒重(wd)。复合水凝胶支架的降解率(wlr)可采用以下公式计算：生物酶法降解是评价工程支架性能的重要指标之一。本文在模拟生物条件下对水凝胶支架和复合水凝胶支架进行体外降解研究。将冻干并无菌处理的复合水凝胶支架置于10mmpbs溶液和0.25％w/v胰蛋白酶溶液中，在10天测试期内，测定不同时间点支架的减重情况，从而评估其降解程度。由图10a(右边三列)可知，所有支架在不含酶的pbs缓冲液中均保持较为完整的形态，降解率相似且均小于20％，说明sa与ca2+交联能阻止水溶性蛋白(glp)溶解于pbs缓冲液中。另一方面，在含酶的pbs缓冲液，随着glp添加量的增加，胰蛋白酶作用于缓冲液中的支架的降解率也随之增加(图10中的b)，尤其是glp添加量为12％w/v的复合水凝胶支架，其形态发生了瓦解(图10中的a)。第8天时，与glp蛋白质在相应支架中的干重质量配比(40％、53.4％和60％，w/w)对应，glp添加量为4％、8％和12％(w/v)的复合水凝胶支架的降解率分别为37.6％、55.4％和61.6％(图10中的b)。cnf、sa和glp复合水凝胶墨水的3d打印将3.5％cnf+0.5％sa水凝胶墨水和本发明的复合水凝胶墨水用cellink3d生物打印机(cellink,gothenburg,sweden)打印。打印机头由压力制动技术精确控制400μm(22g)直径喷嘴吐墨。打印机参数设置为：吐墨速率5-10毫米/秒流量、制动压力范围为20-100kpa，喷头移动速率为0.8-2.0毫米/秒。通过调整上述参数来控制打印线条的粗细精度。两种由cad软件设计的支架模型直接打印到塑料培养皿中：一种为2层网格支架模型(20×20mm2，行间距1.0mm)；另一种为6层小圆柱体支架模型(直径8mm，高度3mm，行间距0.5mm)，并测量了小圆柱体支架交联前后的尺寸。与对照组(3.5％w/vcnf+0.5％w/vsa)相比，12％w/vglp添加量的复合水凝胶墨水显著提高了支架打印的分辨率(图11)。在37℃真空干燥箱干燥后，支架萎缩了20％。将干燥后的支架置于pbs缓冲液或去离子水中浸泡1小时，支架可以恢复到初始形状。mc3t3-e1细胞在复合水凝胶支架提取液及支架上的增殖以mc3t3-e1成骨细胞为细胞系，采用细胞计数kit-8法评价对照组3.5％cnf+0.5％sa水凝胶支架和glp添加组复合水凝胶支架的细胞存活率。首先称取冻干的复合水凝胶支架并粉碎，添加适量dmem细胞培养基(6mg支架/mldmem溶液)，混合液置于37℃条件下，磁力搅拌12小时，之后离心(10000xg，5min)过滤(0.22μm)后备用。将处于对数生长期的mc3t3-e1细胞接种于96孔板中(细胞密度为5×103/孔)进行预贴壁处理12小时，之后将dmem培养基替换为支架提取液(第0天)进行培养并在孵育的第1、4、7天取样测定。所有细胞培养实验均在37℃，5％的二氧化碳条件下进行。测定时，将96孔板中的支架提取液取出，用pbs轻轻润洗三次，之后添加含10％cck-8的dmem，在37℃，5％的二氧化碳条件下孵育4h，用酶标仪测定450nm时的光密度值(od)，结果如图12中的a所示。对照组3.5％cnf+0.5％sa水凝胶支架及3组不同glp添加量的复合水凝胶支架(小圆柱体支架直径6mm，厚度4mm)分别用75％乙醇浸泡5小时以达到灭菌目的,之后用10mmpbs缓冲液浸泡3次，每次1小时，消毒后转移至24孔低黏附板。之后将1mldmem细胞生长培养基加入各孔中，平衡支架体系中的缓冲液。之后，将处于对数生长期的mc3t3细胞接种到含支架的24孔低黏附板中，细胞密度为10×104/毫升。所有细胞培养实验均在37℃，5％的二氧化碳条件下进行。培养基每2天更换一次。在孵育的第1、4、7天进行取样。测定时，将24孔板中的dmem细胞培养液取出，用pbs轻轻润洗三次，之后添加1ml含10％cck-8的dmem，在37℃，5％的二氧化碳条件下孵育4h，之后取出细胞培养液离心，取100μl样品用酶标仪测定450nm时的光密度值(od)，结果如图12中的a所示。为了研究配制的复合水凝胶支架对细胞活力的影响，我们将mc3t3-e1健康细胞暴露于复合水凝胶支架的提取液中。支架提取液培养的mc3t3-e1细胞的增殖情况如图12所示，结果显示，添加有glp的支架提取液对细胞毒性极小(图12a)。细胞在复合水凝胶支架上的增殖结果显示，在前4天的培养中，添加glp的复合水凝胶支架的活细胞数较高(图12b)，这应该是因为添加glp的复合水凝胶支架比由包含3.5％w/vcnf和0.5％w/vsa的水凝胶墨水打印而成的对照组(3.5％cnf+0.5％sa)支架的表面粗糙，从而帮助细胞附着在支架上。第4天后，部分细胞似乎死亡，可能是由于支架表面积有限导致细胞竞争，或者支架降解，glp释放到培养液中，导致细胞死亡。统计分析实验中所有数据采用graphpadprismv5.01软件(lajolla,ca,usa)进行单因素方差分析(anova)和tukey检验(p<0.05)。应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本申请的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本申请的保护范围，凡未脱离本申请技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本申请的保护范围之内。当前第1页12当前第1页12