一种治疗白血病的CAR-T细胞制剂的制备方法与流程

本发明涉及免疫学和细胞生物学领域，具体而言，涉及一种制备car-t细胞的方法以及制得的car-t细胞及其应用。
背景技术：
：b细胞恶性肿瘤在恶性血液肿瘤中的发病率逐年上升，但b细胞恶性血液肿瘤的治疗手段仍然较局限，对于白血病，临床上常用的治疗方案虽然可以有很高的完全缓解率(cr)，但此类疾病易复发及后续治疗耐药性，导致长期预后较差。根据国家肿瘤中心2015年统计数据，我国每年新增白血病受试者7.5万人，死亡人数5.3万人。由于环境污染等原因，我国每年新发病人数仍以5％的速度增长。男性发病率、死亡率分别是女性的1.29倍/1.34倍。白血病是儿童时期好发肿瘤，占14岁以下儿童恶性肿瘤发病的1/3。我国以病情凶险的急性白血病发病率最高，治疗仍以化疗为主。急性白血病发病率约为慢性的5.5倍，其中急性淋巴细胞白血病(all)(占比约20％)。但是，20％左右患者为难治型或最终复发，难治复发急性淋巴细胞白血病预后差，生存期短。儿童难治复发all的5年生存率为(21.0±1.8％)，而成人难治复发all的5年生存率低于7％。随着肿瘤免疫学理论和技术的发展,免疫细胞在肿瘤治疗中的作用日益受到重视。过继性细胞免疫治疗是近年来备受关注的恶性肿瘤的治疗策略之一。其中,嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor，car)t细胞技术是近年来发展非常迅速的一种细胞治疗技术。通过基因改造技术,效应t细胞的靶向性、杀伤活性和持久性均较常规应用的免疫细胞高,并可克服肿瘤局部免疫抑制微环境和打破宿主免疫耐受状态。car由胞外区、跨膜区和胞内区三个部分组成，其本质上是由不同蛋白功能结构域串联形成的膜蛋白。胞外区通常是分离自抗原特异性单克隆抗体的scfv片段，胞内是t细胞活化的分子，如cd3ζ、fcrγ、cd28或者41bb。第一代car只有一个胞内信号组份，主要是cd3ζ或fcrγ，t细胞可以被活化但无法增殖。第二代car具有两个胞内信号组份，包括一个共刺激分子，如cd28、41bb等。第三代car具有三个胞内信号域，包括两个串联的共刺激域cd28、41bb或ox40和一个cd3ζ。第4代car(4scart)是在原有的car结构上加入自杀基因的可调控元件增加安全性与靶向性，或者加入调控il-12分泌的元件，以解除体内免疫抑制微环境。car-t细胞在肿瘤免疫治疗中具有诱人的前景，目前，car-t细胞临床试验的细胞来源大多数都是取自患者自身的外周血t细胞，这样会导致如下两个十分显著的问题：1)患者的外周血采集后需要10-14天才能完成car-t回输，这段时间可能错过病人治疗的最佳时机；2)患者由于进行过多种治疗(例如，放化疗)，会使其t细胞增殖性能不佳，无法保证回输car-t的量。这一短板严重制约着car-t细胞用于个体化治疗的应用和市场推广。综上可知，本领域迫切需要建立一种克服上述缺陷的制备car-t细胞的方法。有鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的第一目的在于提供一种制备car-t细胞的方法，该方法简单易行，易于工业化生产。本发明的第二目的在于提供含有上述car-t细胞的组合物。本发明的第三目的在于提供上述car-t细胞在制备治疗或预防癌症的药物中的应用。为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：一种制备car-t细胞的方法，是将包含car的病毒感染cd3阳性t细胞得到所述car-t细胞。本发明提供的制备car-t细胞的方法，将包含car的病毒感染cd3阳性t细胞得到car-t细胞，能够工业化生产制备用于个体化治疗的car-t细胞，该方法制备得到的car-t细胞的有效性更好、安全性更高。进一步地，所述cd3阳性t细胞采用以下方式制备：从外周血中制得外周血单核细胞，然后从所述外周血单核细胞中富集得到cd3阳性t细胞。其中，外周血是从静脉采集。进一步地，所述从外周血中制得外周血单核细胞的步骤具体为：所述外周血按体积比1:1-2加入pbs，得到稀释的外周血细胞；所述稀释的外周血细胞与淋巴细胞分离液混合，离心，吸取离心后的白膜层细胞；得到的白膜层细胞与无血清细胞培养基(包括但不限于corningkbm581培养基)混合后离心，沉淀即为所述外周血单核细胞。采用上述步骤将外周血通过逐步分离得到的外周血单核细胞纯度高。采血容器内壁覆盖抗凝剂，采集外周血时，边采集边摇晃使得外周血与抗凝剂充分混合，以防止得到的外周血凝固，从而保证从外周血中制得单核细胞的质量以及量。进一步地，从所述外周血单核细胞中富集得到cd3阳性t细胞采用偶联cd3/cd28抗体的磁珠进行。具体地，外周血单核细胞进行计数，按照数量为1:1的比例加入偶联cd3/cd28抗体的磁珠，轻轻震荡20min，利用磁力架，得到cd3阳性的t细胞。该方法分离得到的cd3阳性的t细胞纯度高，且不影响其自身的活性。进一步地，制备得到的cd3阳性t细胞还包括进一步培养的步骤；所述培养采用的培养基为corningkbm581培养基。corningkbm581培养基通过市售购买即可。通过将得到的cd3阳性t细胞进一步培养，得增加其数量，并且培养得到的cd3阳性t细胞活性高。另外，本发明中包含car的病毒感染cd3阳性t细胞是将包含car的病毒与cd3阳性t细胞共培养，使包含car的病毒侵入cd3阳性t细胞。侵染时，moi一般为0.1-4。另外，本发明中包含car的病毒使用cn109503717a公开的重组载体的慢病毒即可。本发明还提供了上述方法制得的car-t细胞。本发明还提供了含有上述car-t细胞的组合物。为了制得的组合物便于使用和保存，进一步地，所述组合物还包含细胞冻存液。进一步地，所述细胞冻存液为药用的稀释剂或赋形剂。本发明还提供了所述的car-t细胞在制备治疗或预防癌症的药物中的应用。与现有技术相比，本发明的有益效果为：(1)本发明提供了制备car-t细胞的方法，该方法简单易行，易于工业化生产。(2)本发明还提供了上述制备方法制得的car-t细胞。(3)本发明还提供了含有上述car-t细胞的组合物。(4)本发明还提供了所述的car-t细胞在制备治疗或预防癌症的药物中的应用。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1为本发明实施例2中培养cd3阳性t细胞的效果曲线图；图2为本发明实验例2中制得的car-t细胞中car表达率的结果图；图3为本发明实验例4中制得的car-t细胞体外杀伤图；图4为本发明实验例5中制得的car-t细胞在人体试验的细胞因子分泌图。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。实施例1外周血的采集使用真空采血技术。摘掉静脉穿刺镇上的保护套，进行静脉穿刺，穿刺成功后，用贴好条形码的负压真空采血管采集静脉血。边采集外周血边轻轻摇晃采血袋，使外周血与抗凝剂充分混和；采集的外周血于4℃冰箱中暂存，并在24小时内经由配备有恒温设备的转运车运至gmp实验室进行分离和培养。实施例2人外周血单核细胞的分离用含有抗凝剂的采血管采集外周血约10ml，室温(18-25℃)自然沉降约30min，收集上层血浆，将收集的上层血浆于5000r/min条件下离心10min，按体积比1:1加到淋巴细胞分离液(购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)上，梯度离心，3000r/min，离心30min，离心后，离心管由上之下分层：第一层为血浆层；第二层为淋巴细胞白膜层；第三层为透明分离液层；第四层红细胞层。吸取淋巴细胞白膜层，并用pbs洗涤2次，两次离心以1500r/min，离心10min，pbs重悬细胞，加入5％自体血浆+300iu/ml重组人il-2+kbm581完全培养基培养人外周血单核细胞。慢病毒感染t淋巴细胞及car-t细胞制备用含5％自体血浆+300iu/ml重组人il-2+kbm581完全培养基培养新制备的单个核细胞pbmc，il-2购自r&dsystems，kbm581购自corning，第0天加入cd3/cd28dynabeads免疫磁珠(购自invitrogen)活化t细胞，前3天进行慢病毒感染，加入0.25moi对应的慢病毒载体，未感染的t淋巴细胞作为空白对照，48h后将培养基更换为含有5％自体血浆+300iu/ml重组人il-2+kbm581完全培养基，继续培养7-9天。实施例3将制得的car-t细胞中衣原体、支原体、内毒素以及微生物进行检测，制得的car-t细胞中衣原体、支原体、内毒素以及微生物进行检测结果均为阴性；将制得的car-t细胞进行car表达率的检测，结果如图2所示。从图2可以看出，制得的car-t细胞中car的表达率在60％以上。实施例4病毒感染靶向cd19car-t细胞体外杀伤效果评估(1)靶向cd19抗原杀伤：培养靶细胞293t-cd19(cd19阳性)、293t(cd19阴性)和效应细胞cd19car-1、cd19car-2、cd19car-3、cd19car-4的car-t；(2)收集靶细胞和效应细胞，1500rpm/min，离心5min，弃上清(3)用10％fbs+1640完全培养基重悬靶细胞和效应细胞(4)利用实时细胞分析系统(rtca)，在e-plate16的空中加入50μl1640培养基(5)利用rtca检测基线，确定所选孔接触正常(6)设置效靶比为0:1、1:1、5:1、10:1(7)取出e-plate16，按照效靶比，在每孔中加入混合均匀的靶细胞悬液100μl，使每孔种细胞数目为104cells/100μl。(8)将e-plate16置于培养箱中，以37℃，5％co2条件下，过夜放置(9)第二天，将e-plate16取出，加入50μl相应的效应细胞，计算加入效应细胞8h后的杀伤率。(10)检测结果如图3所示。cd19car-t对cd19抗原阳性细胞杀伤作用显著，明显高于ntd组。体外杀伤实验结果表明制备的car-t细胞能够靶向cd19抗原具备很强的抗肿瘤活性。实施例5cd19car-1修饰的自体t细胞对cd19阳性的急性b淋巴细胞白血病患者的临床试验治疗效果采集急性b淋巴细胞白血病患者100ml外周血，分离纯化获得t细胞(实施例2)，添加5％自体血浆、300iu/ml重组人il-2和cd3/cd28磁珠体外激活1天后转导cd19car慢病毒载体。以0.8～1.5×106/ml的培养密度每天进行扩大培养9～12天。将cd19car分别转导至来自5例不同急性b淋巴细胞白血病患者的t细胞中，转导后的细胞命名为cd19car-t1、cd19car-t2、cd19car-t3、cd19car-t4、cd19car-t5。以下以cd19car-t1急性b淋巴细胞白血病患者的治疗为例。cd19car-t1患者：(1)粒系：增生活跃，中性中幼粒细胞比例增高。中性晚幼粒细胞比例正常。成熟阶段比例减低。(2)红系：增生活跃，早幼红细胞比例正常。中幼红细胞比例减低。晚幼红细胞比例增高。幼红细胞可见到巨幼样变红细胞、核分叶红细胞，比例＞10％。成熟红细胞形态正常，染色良好。(3)淋巴细胞：比例明显增多。可见到原始淋巴细胞，占26.5％。(4)巨核细胞：全片见巨核细胞8个；分类8个巨核细胞；原始细胞为0个；幼稚巨核细胞为0个；颗粒性巨核细胞为7个；产血小板型巨核细胞为0个；裸核巨核细胞为1个。血小板可见(5)血片：白细胞数正常，粒细胞分类中少见，淋巴细胞比例明显增高，单核细胞比例减少，血小板可见。(6)印象：急性淋巴细胞白血病复发经医院推荐，通过伦理审查，病人签署知情同意书，然后进行cd19car-1细胞治疗的临床试验研究。cd19car-1修饰的自体t细胞治疗过程为：采集患者外周血，体外分选获得t细胞，t细胞体外激活与扩增，制备cd19car-t1细胞制剂，制剂质量控制与放行，分两个时间点分两次通过静脉回输至病人体内，共计输注约2.5×108car-t细胞。cd19car-t1病人回输cd19car-1细胞后，出现温和的发热反应，体温在最后一次回输后3天开始升高，细胞因子检测结果显示白介素6(il-6)分泌水平较基线期提高100倍，如图4所示，患者持续发烧3天均未超过39℃，随后体温逐渐下降并达到正常体温。国外报道的cd19car-t治疗急性b淋巴细胞白血病患者副反应严重时在3天内发生持续高热。本临床试验结果表明本发明所涉及的新型嵌合抗原受体修饰的t细胞在治疗性b淋巴细胞白血病中有着更温和的反应，对患者副作用更小。在回输后的14天后对患者的外周血和骨髓进行检测。如表1结果所示，外周血中cd19阳性(cd19+)细胞所占的百分比由治疗前16％降低为0％，骨髓中cd19阳性(cd19+)细胞所占的百分比由治疗前26.5％降低为＜1％。结合血液学检测结果表明：该病人经过本发明提供的cd19car-1细胞治疗后，外周血和骨髓中cd19阳性的白血病细胞被完全清除，达到临床完全缓解。表1急性b淋巴细胞白血病患者治疗前后b淋巴细胞的变化检测项目外周血(治疗前)外周血(治疗后)骨髓(治疗前)骨髓(治疗后)cd19+细胞16％0％26.5％＜1％上述结果可以看出，本发明提供的car-t细胞可以显著抑制模型动物中的肿瘤生长，具备抗肿瘤的功能。尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权力要求书所限定的范围。当前第1页12