人工靶向修饰的CAR-T细胞及其制备方法与应用与流程

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及人工代谢修饰的car-t细胞及其制备方法与应用。

背景技术：

过继细胞疗法(act)是一种有效的抗癌策略。工程化表达嵌合抗原受体(chimericantigenreceptors，cars)的t细胞，被称为“活的药物”，在癌症免疫治疗中表现出显著的疗效，特别是在治疗血癌方面取得了巨大成功。然而，作为一种单一疗法，car-t细胞免疫治疗在有效性与安全性方面仍然面临着巨大挑战。“脱靶效应”引发的毒性并导致正常的b细胞发育不良是car-t细胞疗法的重要潜在副作用。另一个主要障碍是肿瘤免疫逃逸已成为car-t细胞治疗实体恶性肿瘤成功的主要障碍。肿瘤细胞通过选择性突变改变或隐藏肿瘤抗原，从而逃避免疫细胞的识别与捕获。因此，针对上述技术瓶颈的成功治愈肿瘤可能需要一种“超级car-t细胞”，其已被设计为克服许多晚期实体瘤的免疫抑制环境。

为了克服这些挑战，用基因工程和化学改造、修饰car-t细胞是一种提高抗癌治疗效果和提高生物安全性的新策略。有研究表明，可以通过基因工程的办法将构建多靶点的car靶向识别，提高细胞治疗的安全性与有效性；据报道，免疫细胞和肿瘤细胞之间的紧密接触对细胞间免疫识别、通讯、活化和最终细胞毒性至关重要。在自然界中，接触相互作用通常通过一系列表面粘附分子和连接来实现，并且人工化学修饰是细胞-细胞靶向和连接的重要策略之一。这些技术通过添加特殊的人工靶向，增强car-t细胞与肿瘤之间的相互作用，为car-t细胞修饰提供了全新思路。

目前增强car-t细胞功能活性的改造技术主要有基因工程与纳米技术修饰。一些传统的基因改造技术，通常在设计与操作上非常繁琐，如car-t细胞中插入多靶点的car基因或者黏附分子均存在各自的优缺点。多靶点的car-t细胞可以增强t细胞的靶向治疗效果，但插入过多的外源基因会存在影响t细胞活性的潜在风险；通过直接修饰黏附分子或化学基团可以增强car-t细胞对肿瘤组织的趋向与识别。然而，直接对car-t细胞进行化学靶向修饰，通常会导致细胞活性降低，运动与迁移能力受损。现阶段这些car-t细胞工程改造技术主要存在的问题是降低细胞的生物功能活性，不能很好的解决肿瘤脱靶效应的难题，同时也存在一定对机体的潜在毒副作用。针对这些技术瓶颈，现急需开发出一种安全，有效的car-t肿瘤靶向治疗技术，克服细胞治疗过程中的脱靶现象与肿瘤免疫抑制。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供代谢修饰的car-t细胞及其制备方法与应用；经修饰的car-t细胞能够增强对实体瘤的杀伤能力。

本发明提供的代谢修饰的car-t细胞，所述car-t细胞的细胞膜表面标记偶联有修饰物的生物活性分子；

其中，所述修饰物为叠氮、-bcn或炔基；所述生物活性分子为单糖，脂类或氨基酸。

本发明提供的经代谢修饰的car-t细胞，是一种携带化学报告基团(-n3/-bcn/-tz/-炔基)的糖/脂/氨基酸衍生物。采用化学合成将化学报告基团引入单糖、胆碱与甲硫氨酸等代谢物质中，形成可以进行细胞代谢的糖/脂/氨基酸衍生物。car-t细胞与肿瘤细胞可通过细胞代谢工程将上述配对的化学基团嵌入到各自的细胞膜表面，通过特异的生物正交反应car-t细胞可特异识别靶向肿瘤，拉近car-t细胞与肿瘤细胞的空间距离，增强细胞间的相互作用，从而激活car-t细胞杀伤肿瘤。

本发明实施例中，所述修饰物为叠氮；所述单糖为甘露糖、葡萄糖，半乳糖或唾液酸；所述氨基酸为甲硫氨酸、丙氨酸或苯丙氨酸；所述脂类为胆碱、胆固醇或脂肪酸。

一些实施例中，偶联有修饰物的生物活性分子为ac4galnaz、ac4glcnaz、ac4mannaz、ac4mannbcn、ac4galnal、ac4glcnal、ac4mannal、ae-cho、ap-cho、az-phe、aha或hpg。

一个具体实施例中，所述偶联有修饰物的生物活性分子为ae-cho。

具体的，偶联有修饰物的生物活性分子的结构式如下：

本发明中，所述的生物活性分子修饰于car-t细胞细胞膜表面的糖蛋白/磷脂分子上。

本发明所述car-t细胞的制备方法，包括：将car-t细胞与所述生物活性分子于37℃共同孵育后，以pbs清洗，制得代谢修饰的car-t细胞。优选的，共同孵育的时间为48h。

具体的，car-t细胞经过叠氮化的糖/脂/氨基酸类衍生物共孵育48h，通过t细胞糖代谢工程，将叠氮基团嵌入car-t细胞膜表面，从而获得叠氮修饰的car-t细胞(n3-car-t)；

本发明提供的代谢修饰的car-t细胞适用于新型的细胞代谢衍生物和一种基于代谢工程与“生物正交反应”(bioorthogonalreaction)的car-t细胞肿瘤靶向治疗技术。本发明提供的代谢修饰的car-t细胞中的生物活性分子是以叠氮、-bcn或炔基修饰的脂类、糖类或氨基酸，t细胞或肿瘤细胞则与脂类/单糖/氨基酸的基团衍生物小分子共孵育，使其小分子基团(-n3/-bcn/-炔基)通过细胞内糖/脂/氨基酸代谢途径标记在各自的细胞膜表面糖蛋白/磷脂分子上。在体内car-t细胞表面的-n3/-bcn/-炔基报告基团与肿瘤细胞膜表面配对的-bnc/-n3基团发生高效、特异的“生物正交反应”，形成稳定共价结合，从而有效拉近car-t细胞与肿瘤距离，提高car-t细胞对肿瘤抗原的识别与活化，增强car-t细胞的抗肿瘤效应。

本发明所述的car-t细胞在制备细胞免疫治疗的制剂中的应用。

本发明还提供了一种细胞免疫治疗的制剂，其包括(i)或(ii)中的任一项：

(i)本发明所述的car-t细胞；

(ii)car-t细胞以及偶联有修饰物的生物活性分子；

其中，所述修饰物为叠氮、-bcn或炔基；所述生物活性分子为单糖，脂类或氨基酸。

所述的细胞免疫治疗的制剂，还包括与所述生物活性分子产生生物正交反应的代谢衍生物。

一些实施例中，所述代谢衍生物为bcn修饰的糖类、脂类或氨基酸。一个具体实施例中，所述代谢衍生物为ac4mannbcn。

一些具体实施例中，所述细胞免疫治疗的制剂包括：偶联有ae-cho的car-t细胞和ac4mannbcn。

在此实施例中，所述细胞免疫治疗的制剂还包括荧光素酶。

本发明还提供了一种基于生物正交反应的car-t细胞靶向治疗技术。

细胞免疫治疗的制剂中，包含本发明所述的car-t细胞，则所述靶向治疗技术为，先对靶细胞进行修饰，然后与发明所述的car-t细胞接触。

细胞免疫治疗的制剂中，包含car-t细胞以及偶联有修饰物的生物活性分子，则先以生物活性分子修饰car-t细胞；在对靶细胞进行修饰，然后使经修饰的car-t细胞与经修饰的靶细胞接触。

car-t细胞表面修饰叠氮基团，则靶细胞表面修饰bcn基团。

一些实施例中，靶细胞的修饰包括：将将bcn修饰的糖类衍生物代谢处理肿瘤细胞(共孵育48h)与组织(瘤内注射3次)，通过细胞糖代谢工程，将bcn基团嵌入肿瘤细胞与组织表面，从而获得bcn修饰的肿瘤细胞与组织(bcn-tumor)。

本发明公开了一种基于细胞代谢工程与生物正交靶向的car-t细胞免疫治疗技术。该技术通过细胞代谢构建car-t细胞与肿瘤识别的人工化学靶点，在体内通过高效、特异的生物正交反应，提高car-t细胞的识别与抗肿瘤效应。该方法通过t细胞的糖类/脂类/氨基酸代谢将化学报告基团(-n3/-tz/-bcn等)嵌入car-t与肿瘤细胞表面，car-t细胞表面的报告基团与肿瘤细胞表面的配对基团发生共价结合，有效地提高体内car-t细胞对肿瘤的识别并激活car-t细胞的抗肿瘤能力。此外，本发明还涉及一种克服car-t细胞治疗的脱靶效应的方法，通过生物正交反应抑制car-t细胞对正常细胞脱靶毒性，增强car-t细胞在肿瘤中的浸润与富集，从而增强细胞免疫治疗的安全性与疗效。

所述细胞免疫治疗，其过程主要包括使经修饰的car-t细胞与经修饰的靶细胞接触，具体方式采用静脉注射。

所述的car-t细胞主要针对人源的cd19，cd20，her2，egfr,vegf，b7-h3等肿瘤抗原靶点。所述的细胞靶向治疗方法主要包括以下步骤：

第一步，将携带生物正交报告基团的糖/脂/氨基酸衍生物与car-t细胞，37℃孵育48h，获得化学报告基团修饰的car-t细胞。

第二步，将携带配对报告基团的糖/脂/氨基酸衍生物与肿瘤细胞再37℃共孵育48h，获得配对化学报告基团修饰的肿瘤细胞；对于肿瘤组织，在荷瘤小鼠的肿瘤中注射上述ac4mannbcn糖类衍生物(50-500mg/kg)，每隔一天注射1次，共3次，获得配对化学报告基团修饰的活体肿瘤组织。

第三步，将上述0.2×10⁶-2×10⁶个raji肿瘤细胞注入小鼠体内建立血液瘤模型，尾静脉注射报告基团修饰的car-t细胞进行靶向免疫治疗；在实体瘤中，通过尾静脉注射0.1×10⁷-2×10⁷个上述报告基团修饰car-t细胞，对配对化学基团修饰的实体瘤进行靶向免疫治疗。

本发明方案的主要优势：(1)基于-bcn/-n3/-tz与-n3/-bcn/炔基间的高效、特异的“生物正交反应”，且不受体内复杂环境中其他因素的干扰，因此携带化学报告基团的car-t细胞可以迅速与肿瘤细胞膜表面互补配对基团形成共价结合，从而有效地协助t细胞表面的cars对肿瘤抗原的识别与活化。(2)利用这种高效、特异的体内生物正交靶向技术可以有效克服细胞治疗过程中的脱靶现象与肿瘤免疫逃逸。(3)通过细胞代谢工程对t细胞进行代谢修饰，高效无毒，可避免直接化学偶联对细胞表面活性分子的影响,有效保护car-t细胞的功能活性。

附图说明

图1示基于细胞糖代谢工程的生物正交靶向增强car-t细胞抗肿瘤免疫效应；

图2示共聚焦成像与流式细胞分析脂类代谢衍生物ae-cho对car-t细胞代谢标记情况；其中，图2(a)示共聚焦成像结果；图2(b)示流式细胞分析结果；

图3示共聚焦成像与流式细胞分析糖类衍生物ac4mannbcn对raji肿瘤细胞代谢标记情况；其中，图3(a)示共聚焦成像结果；图3(b)示流式细胞分析结果；

图4示流式细胞与共聚焦成像分析人工生物正交靶向增强car-t细胞对b淋巴瘤的免疫治疗；其中，图4(a)示流式细胞分析结果；图4(b)示不同受试组中raji细胞的百分数；图4(c)示共聚焦成像结果；图4(d)示不同受试组中car-t细胞的数量；

图5示流式细胞与共聚焦成像分析人工生物正交靶向增强car-t细胞对实体肿瘤的免疫治疗；其中，图5(a)示流式细胞分析结果；图5(b)示不同受试组中raji细胞的百分数；图5(c)示共聚焦成像结果；图5(d)示不同受试组中car-t细胞的数量；图5(e)示共聚焦成像结果；

图6示不同受试组car-t细胞的肿瘤细胞杀伤毒性。

具体实施方式

本发明提供了代谢修饰的car-t细胞及其制备方法与应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：化学报告基团修饰的糖/脂衍生物的制备

糖类衍生物的合成：我们首先根据以前的文献(angew.chem.int.ed.engl.2010,49,9422-9425)合成4-硝基苯基氯甲酸酯活化的双环[6.1.0]壬烯(npc-bcn)。然后将npc-bcn与聚糖(甘露糖)偶联以得到n-bcn-羰基-d-甘露糖胺(mann-bcn)。为了增加细胞摄取，将这些非天然聚糖全乙酰化形成四-o-乙酰基化合物，冻干获得四乙酰化-n-bcn-羰基-d-甘露糖胺(ac4mannbcn)粉末。

脂类衍生物的合成:主要参照文献analyticalchemistry201385(10)，5263–5270中所公开的方法合成。具体制备方法如下：将一定量的1,2-二溴乙烷及叠氮化钠溶解在dmf中，80℃反应20小时，反应后加入冰水及氯化钠溶液，萃取得到中间体2’-溴叠氮乙烷。将获得的2’-溴叠氮乙烷溶解在四氢呋喃中，氩气保护下加入二甲基甲醇胺，在0℃下反应6h，用乙醚沉的得到目标产物叠氮乙基胆碱ae-cho。

实施例2：人工生物正交靶向的car-t细胞治疗血液瘤

car-t细胞的叠氮基团修饰：将car-t细胞与终浓度为32-64μm的叠氮修饰的胆碱衍生物(ae-cho)在37℃下共同孵育48h，通过t细胞的脂类代谢过程，叠氮基团被的嵌入car-t细胞膜表面(n3-car-t)。用pbs缓冲液洗去多余的修饰剂，细胞进行dbco-fluor488染色。收获细胞并用共聚焦与细胞流式分析叠氮分子在细胞表面的表达情况。如图3所示，叠氮分子高效表达在car-t细胞表面。

血液瘤细胞(raji)的糖代谢修饰：将携带荧光素酶的luci-raji细胞与终浓度为20μm的bcn基团修饰甘露糖(ac4mannbcn)在37℃下共同孵育48h，通过肿瘤细胞raji的糖代谢过程，将-bcn基团嵌入肿瘤细胞表面(bcn-raji)。用pbs缓冲液洗去多余的修饰剂，细胞进行n3-cy5.5染色20min。收获细胞并用共聚焦成像与细胞流式分析叠氮分子在细胞表面的表达情况。如图4所示，bcn基团高效表达在raji细胞表面。

生物正交靶向的car-t细胞治疗血液瘤：将上述处理的luci-raji肿瘤细胞(5×10⁵)用pbs洗涤两次，去除残留的糖类衍生物,尾静脉注入nod/scid小鼠体内。接种5天后，将上述叠氮修饰car-t细胞(n3-car-t)注入荷瘤小鼠体内，分别在d1,d3,d5,d10,d20,d30天分别对小鼠腹腔注射荧光素底物，并运用小动物活体成像系统对小鼠进行生物发光活体成像，记录并分析小鼠体内肿瘤细胞的信号与分布,评价治疗效果。

由于该实验采用的luci-raji肿瘤细胞表面表达cd19抗原，因此，在体内cd19-car-t细胞可以有效的识别并杀伤raji细胞，而car-t细胞对luci-raji细胞的杀伤可以通过检测raji细胞内荧光素酶的表达水平来评价体内肿瘤细胞的清除情况。如图5a-b所示，流式细胞分析确定小鼠血液内的肿瘤细胞几乎清除殆尽。而对照组pbs与car-t组小鼠则具有较强的肿瘤细胞信号，生物正交靶向的car-t细胞具更强的肿瘤细胞杀伤能力。此外，组织免疫荧光成像显示，car-t对照组小鼠脾脏存在大量的外源car-t细胞，而生物正交靶向的n3-car-t处理组小鼠脾脏体内car-t细胞显著降低(图5c-e)。这些结果表明基于糖代谢的生物正交靶向可有效增强car-t细胞对血液瘤治疗效果，并显著降低car-t细胞的“脱靶效应”。

实施例3：人工生物正交靶向的car-t细胞治疗实体瘤

car-t细胞的叠氮基团修饰：将car-t细胞与终浓度为64μm的叠氮修饰的胆碱衍生物(ae-cho)在37℃下共同孵育48h，通过t细胞的脂类代谢过程，叠氮基团被的嵌入car-t细胞膜表面(n3-car-t)。用pbs缓冲液洗去多余的修饰剂，细胞进行dbco-fluor488染色。收获细胞并用共聚焦成像与细胞流式分析叠氮分子在细胞表面的表达情况。如图3所示，叠氮分子高效表达在car-t细胞表面。

raji实体瘤的糖代谢修饰：将1×10⁷携带荧光素酶的luci-raji细胞皮下荷瘤nod/scid小鼠。待肿瘤体积达到100mm³左右时，通过瘤内注射5-100mm的ac4mannbcn单糖衍生物，每隔一天注射1次，共3次。收获肿瘤细胞并用细胞流式分析与免疫荧光染色分析bcn基团在细胞表面的表达情况。

生物正交靶向的car-t细胞治疗实体瘤：将上述处理的luci-raji皮下荷瘤小鼠尾静脉注入上述叠氮修饰car-t细胞(n3-car-t)注入荷瘤小鼠体内，分别在d1,d3,d5,d10,d20,d30天分别对小鼠腹腔注射荧光素底物，并运用小动物活体成像系统对小鼠进行生物发光活体成像，记录并分析肿瘤组织内car-t细胞的浸润、积累与分布情况，评价治疗效果。

结果发现，经过具有生物正交靶向的car-t细胞治疗后，小鼠肿瘤部位的生物发光信号相对较弱，肿瘤体积比其他对照组明显缩小。同时流式细胞分析显示在生物正交靶向治疗组肿瘤组织内有大量的car-t细胞积累，而对照car-t组小鼠瘤内car-t细胞浸润较少，结果如图5a-b所示。肿瘤免疫荧光成像分析表明，n3-car-t细胞治疗组具有大量的car-t细胞穿透至肿瘤深处，而对照car-t细胞组的car-t细胞主要富集在肿瘤边缘或浅表区域(见图5c-e)。这些结果表明生物正交靶向的car-t细胞对raji实体瘤具更强的杀伤能力，通过人工生物正交靶向car-t细胞更容易穿透并积累在肿瘤内部发挥抗肿瘤效应。

另外，将不同比例的car-t细胞与肿瘤细胞(1:1～10:1)孵育4h,运用细胞毒性检测分析生物正交靶向对car-t细胞杀伤效率的影响。研究表明，单独的car-t对cd19分子阴性的肿瘤细胞k562杀伤能力有限，对cd19阳性肿瘤细胞raji杀伤能力较强；然而，具有代谢修饰的生物正交靶向的car-t细胞对cd19阴性细胞k562杀伤能力没有显著改善(轻微提高)，却对cd19阳性的raji细胞表现出优异的杀伤效果(高于任何一组)(图6)。该结果表明基于代谢修饰的生物正交靶向与物理拉近，可有效提高car-t细胞的肿瘤细胞的杀伤能力。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。