一种强粘附性、高机械强度的PEGDA-贻贝粘附蛋白-胶原蛋白复合水凝胶的制备方法与流程

本发明属于水凝胶技术领域，具体涉及一种强粘附性、高机械强度的pegda-贻贝粘附蛋白-胶原蛋白复合水凝胶的制备方法。

背景技术：

胶原蛋白是细胞外基质中的主要成分，具有生物相容性、生物可降解性、细胞粘附性、低免疫原性等特点，在药物递送、皮肤替代物、组织工程等方面有广阔应用。目前商业化的胶原蛋白主要来源于猪皮和牛跟腱等，但是较高的提取成本以及病毒传播的可能性限制了哺乳动物胶原蛋白的应用。鱼皮等水产品加工废弃物是胶原蛋白的获取来源之一，价格低廉，安全性高，因此鱼类胶原蛋白逐渐在市场应用中占有一席之地。但是，无论哺乳动物来源或是海洋生物来源的胶原蛋白，形成的水凝胶均具有较差的机械性能，在一定程度上限制了其应用。文献报道了交联剂的加入可以提高胶原蛋白水凝胶的机械性能，但是交联剂的生物安全性存在一定隐患。为此，开发生物来源的胶原蛋白复合水凝胶既可以保证材料的生物安全性，同时又可以提高其机械性能。

贻贝粘附蛋白是在贻贝丝足中提取的天然粘附蛋白，具有良好的粘附性能。目前贻贝粘附蛋白的获得方式有两种，一种是从贻贝中提取天然贻贝粘附蛋白，另一种是利用工程菌表达纯化的重组贻贝粘附蛋白。受贻贝来源的限制，工程菌发酵是目前获取贻贝粘附蛋白常用的手段。贻贝粘附蛋白具有粘附性好、生物安全性高的优点，其已经被用于组织粘合剂等粘附性材料的研发中。

聚乙二醇双丙烯酸酯(pegda)是通过化学反应在聚乙二醇(peg)两端加入丙烯基团得到的产物。pegda是经过美国fda认证符合美国药典(usp)、国家处方集(nf)和食品化学法典(fcc)标准，可被广泛应用于食品、制药、组织工程等领域，具有极高的安全性。但是，未经修饰的pegda水凝胶具有极强的亲水性，不利于细胞粘附。为了改善其细胞粘附性，已有研究将rgd、粘附肽、生长因子、无机化合物和其它生物功能基团连接到pegda凝胶上，增强细胞粘附性。胶原蛋白也以物理混合的方式加入pegda凝胶中，增强细胞粘附性，但是两者物理混合后，机械强度没有发生明显变化，其机械强度仍然不高。此外，该复合胶体组织粘合性仍然较差，不利于在组织表面的固定，限制其应用。

技术实现要素：

为了提高胶原蛋白水凝胶的机械强度和组织粘附性，本发明提供了一种强粘附性、高机械强度的pegda-贻贝粘附蛋白-胶原蛋白复合水凝胶的制备方法，所述方法包括如下步骤：

1)将贻贝粘附蛋白溶解于乙酸溶液中，获得贻贝粘附蛋白乙酸溶液；

2)将胶原蛋白溶解于步骤1)获得的贻贝粘附蛋白乙酸溶液中，获得贻贝粘附蛋白-胶原蛋白溶液；

3)4℃条件下，调节步骤2)获得的贻贝粘附蛋白-胶原蛋白溶液ph至5-9；

4)然后加入聚乙二醇双丙烯酸酯pegda，获得pegda-贻贝粘附蛋白-胶原蛋白混合溶液，加入光引发剂，在紫外光下交联形成pegda-贻贝粘附蛋白-胶原蛋白复合水凝胶。

进一步地限定，步骤1)所述乙酸溶液体积浓度为5％，所述贻贝粘附蛋白在贻贝粘附蛋白乙酸溶液中的浓度为0.01g/ml-0.1g/ml。

进一步地限定，步骤1)所述贻贝粘附蛋白为天然贻贝粘附蛋白或由基因工程菌发酵获得的人工合成贻贝粘附蛋白。

进一步地限定，步骤2)所述胶原蛋白为鱼皮胶原蛋白、哺乳动物胶原蛋白、类人胶原蛋白或甲基丙烯酸修饰胶原蛋白。

进一步地限定，步骤2)所述胶原蛋白以固体形式加入贻贝粘附蛋白乙酸溶液中，所述胶原蛋白在贻贝粘附蛋白-胶原蛋白溶液中的质量体积浓度为1mg/ml-4mg/ml；优选为4mg/ml。

进一步地限定，步骤3)所述调节ph所用的溶液为强碱溶液；所述ph值优选为5。

进一步地限定，步骤4)所述光引发剂为irgacure2959；所述紫外光波长为365nm。

进一步地限定，步骤4)所述pegda以固体形式加入贻贝粘附蛋白-胶原蛋白溶液中，所述pegda在贻贝粘附蛋白-胶原蛋白溶液中的质量体积浓度为0.05g/ml-0.1g/ml，优选为0.1g/ml。

进一步地限定，步骤4)所述光引发剂在pegda-贻贝粘附蛋白-胶原蛋白溶液中的质量体积浓度为0.5mg/ml-1mg/ml，优选为1mg/ml。

进一步地限定，步骤4)所述紫外光交联时间为10-30min。

有益效果

本发明首次将pegda、贻贝粘附蛋白和胶原蛋白复合制备成水凝胶，既解决了胶原蛋白机械性能差的问题，又赋予了复合水凝胶良好的粘附性能。pegda、胶原蛋白和贻贝粘附蛋白都是生物安全性良好的材料，因此制得的复合水凝胶安全无毒副作用。pegda-贻贝粘附蛋白-胶原蛋白的复合水凝胶中贻贝粘附蛋白和胶原蛋白以物理混合方式复合在一起，两者之间主要通过氢键相连，伴有一定几率贻贝粘附蛋白与胶原蛋白分子间酰胺键的形成；经甲基丙烯酸修饰后的胶原蛋白与pegda以碳碳双键聚合连在一起，使得复合水凝胶结合了三种材料的优良特性，具有良好的生物安全性、组织粘附性、细胞粘附性和机械性能，压缩强度最高可达2.3mpa，可应用于组织工程等领域。

本发明以pegda、贻贝粘附蛋白和胶原蛋白为原料，通过酸溶解、碱中和以及紫外光交联的方法，将三者制备成复合水凝胶，本发明制备过程无需添加毒副作用的试剂，绿色环保，成本低廉，工艺简单，易于操作，在组织工程、医学等领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为pegda-贻贝粘附蛋白-胶原蛋白复合水凝胶不同ph条件下的应力-应变曲线，横坐标为压缩应变(％)，纵坐标为压缩强度(mpa)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

本发明方法所采用的胶原蛋白可以通过商业途径购买，也可以自行提取纯化获得。

所述胶原蛋白为鱼皮胶原蛋白、哺乳动物胶原蛋白(如猪、牛)或类人胶原蛋白，胶原蛋白也可以是甲基丙烯酰胺修饰胶原蛋白。使用上述胶原蛋白制备的复合水凝胶相比于单纯的胶原蛋白水凝胶的机械性能都得到了显著提升，其中使用甲基丙烯酸修饰鱼皮胶原蛋白获得的pegda-贻贝粘附蛋白-胶原蛋白复合水凝胶的机械强度提升效果最好。

以下实施例以鱼皮胶原蛋白为例进行说明，自行提取纯化的鱼皮胶原蛋白可以经由胃蛋白酶消化法提取纯化获得，所用鱼如鲈鱼和罗非鱼，但不局限于这两种鱼类，我国常见的经济鱼类均包含在内，其他鱼类鱼皮提取的胶原蛋白均适用于本发明。

具体提取方法为：5g干燥鱼皮剪碎后，加入0.1m氢氧化钠溶液洗涤36小时，每12小时更换溶液，离心去上清；沉淀中加入10％异丙醇溶液搅拌36小时，每12小时更换溶液，离心去上清；沉淀中加入含有胃蛋白酶(1.25g)的0.5m冰醋酸溶液消化48小时，离心去沉淀；上清液中缓慢加入4.45m氯化钠溶液至氯化钠终浓度为0.84-0.89m，离心去上清；沉淀物溶于0.1m冰醋酸溶液，0.02m磷酸氢二钠溶液透析36小时，离心去上清；沉淀物溶于0.5m冰醋酸溶液，过滤，蒸馏水透析48小时，冷冻干燥，最终获得鱼皮胶原蛋白样品，纯度高于99％。

以下实施例中所用的甲基丙烯酸修饰胶原蛋白是在鱼皮胶原蛋白基础上化学修饰合成的，具体合成方法如下：胶原蛋白以5mg/ml的质量体积浓度完全溶解于0.1m盐酸溶液中，加入甲基丙烯酸酐，4℃避光反应9小时，利用去离子水透析48小时，冷冻干燥获得甲基丙烯酰胺胶原蛋白。

以下实施例中所用的贻贝粘附蛋白通过商业途径购买获得。本发明方法所采用的贻贝粘附蛋白可以是天然贻贝粘附蛋白，也可以是由基因工程菌发酵获得的人工合成贻贝粘附蛋白。

以下实施例中所用的pegda在peg的基础上修饰合成的，peg是通过商业途径购买的。pegda合成方法如下：0.1m干燥peg(分子量6000)、0.4m丙烯酰氯和0.2m三乙胺溶于无水二氯甲烷，氮气保护下室温(25℃)反应过夜。获得溶液利用2m碳酸钾溶液中和，溶液静置过夜后取二氯甲烷相，利用无水硫酸镁除水。最后，利用冷的乙醚沉淀pegda，过滤后，经真空干燥箱干燥。

实施例1：pegda-贻贝粘附蛋白-胶原蛋白复合水凝胶的制备方法。

1)将贻贝粘附蛋白溶解于体积浓度为5％的乙酸溶液中，4℃搅拌5min，获得贻贝粘附蛋白乙酸溶液，其中贻贝粘附蛋白质量体积浓度为0.01g/ml；

2)将鱼皮胶原蛋白固体直接溶解于步骤1)中的贻贝粘附蛋白乙酸溶液中，4℃搅拌4小时，获得贻贝粘附蛋白-鱼皮胶原蛋白溶液，其中鱼皮胶原蛋白质量体积浓度为1mg/ml；

3)将4m氢氧化钠溶液逐滴加入到步骤2)获得的贻贝粘附蛋白-鱼皮胶原蛋白溶液中，4℃搅拌调节ph至9；

4)然后，将pegda固体加入到ph为9的贻贝粘附蛋白-鱼皮胶原蛋白溶液中，使pegda质量体积浓度为0.05g/ml，完全溶解后，加入5mg/ml光引发剂irgacure2959母液至最终质量体积浓度为0.5mg/ml，紫外光365nm下交联10min，形成pegda-贻贝粘附蛋白-鱼皮胶原蛋白复合水凝胶。经万能测试机测试其压缩强度为0.18mpa；通过搭接-剪切实验测试其粘附强度为2.6kpa。

实施例2：pegda-贻贝粘附蛋白-胶原蛋白复合水凝胶的制备方法。

1)将贻贝粘附蛋白溶解于体积浓度为5％的乙酸溶液中，4℃搅拌5min，获得贻贝粘附蛋白乙酸溶液，其中贻贝粘附蛋白质量体积浓度为0.05g/ml；

2)将鱼皮胶原蛋白固体直接溶解于贻贝粘附蛋白乙酸溶液中，4℃搅拌4小时，获得贻贝粘附蛋白-鱼皮胶原蛋白溶液，其中鱼皮胶原蛋白质量体积浓度为2mg/ml；

3)将4m氢氧化钠溶液逐滴加入到步骤2)获得的贻贝粘附蛋白-鱼皮胶原蛋白溶液中，4℃搅拌调节ph至7；

4)然后，将pegda固体加入到ph为7的贻贝粘附蛋白-鱼皮胶原蛋白溶液中，使pegda质量体积浓度为0.1g/ml，完全溶解后，加入5mg/ml光引发剂irgacure2959母液至最终质量体积浓度为1mg/ml，紫外光365nm下交联30min，形成pegda-贻贝粘附蛋白-鱼皮胶原蛋白复合水凝胶。经万能测试机测试其压缩强度为0.30mpa；通过搭接-剪切实验测试其粘附强度为26kpa。

实施例3：pegda-贻贝粘附蛋白-胶原蛋白复合水凝胶的制备方法。

1)将贻贝粘附蛋白溶解于体积浓度为5％的乙酸溶液中，4℃搅拌5min，获得贻贝粘附蛋白乙酸溶液，其中贻贝粘附蛋白质量体积浓度为0.1g/ml；

2)将甲基丙烯酰胺胶原蛋白固体直接溶解于步骤1)中的贻贝粘附蛋白乙酸溶液中，4℃搅拌4小时，获得贻贝粘附蛋白-甲基丙烯酰胺胶原蛋白溶液，其中甲基丙烯酰胺胶原蛋白的质量体积浓度为4mg/ml；

3)将4m氢氧化钠溶液逐滴加入到步骤2)获得的贻贝粘附蛋白-甲基丙烯酰胺胶原蛋白溶液中，4℃搅拌调节ph至5；

4)然后，将pegda固体加入到ph为5的贻贝粘附蛋白-甲基丙烯酰胺胶原蛋白溶液中，使pegda质量体积浓度为0.1g/ml，完全溶解后，加入5mg/ml光引发剂irgacure2959母液至最终质量体积浓度为1mg/ml，紫外光365nm下交联15min，形成pegda-贻贝粘附蛋白-甲基丙烯酰胺胶原蛋白复合水凝胶。经万能测试机测试其压缩强度为2.35mpa；通过搭接-剪切实验测试其粘附强度为68kpa。

实施例4：pegda-贻贝粘附蛋白-胶原蛋白复合水凝胶的制备方法。

1)将贻贝粘附蛋白溶解于体积浓度为5％的乙酸溶液中，4℃搅拌5min，获得贻贝粘附蛋白乙酸溶液，其中贻贝粘附蛋白质量体积浓度为0.1g/ml；

2)将甲基丙烯酰胺胶原蛋白固体直接溶解于贻贝粘附蛋白乙酸溶液中，4℃搅拌4小时，获得贻贝粘附蛋白-甲基丙烯酰胺胶原蛋白溶液，其中甲基丙烯酰胺胶原蛋白质量体积浓度为4mg/ml；

3)将4m氢氧化钠溶液逐滴加入到步骤2)获得的贻贝粘附蛋白-甲基丙烯酰胺胶原蛋白溶液中，4℃搅拌调节ph至7；

4)然后，将pegda固体加入到ph为7的贻贝粘附蛋白-甲基丙烯酰胺胶原蛋白溶液中，使pegda质量体积浓度为0.1g/ml，完全溶解后，加入5mg/ml光引发剂irgacure2959母液至最终质量体积浓度为1mg/ml，紫外光365nm下交联15min，形成pegda-贻贝粘附蛋白-甲基丙烯酰胺胶原蛋白复合水凝胶。经万能测试机测试其压缩强度为1.31mpa；通过搭接-剪切实验测试其粘附强度为51kpa。

实施例5：pegda-贻贝粘附蛋白-胶原蛋白复合水凝胶的制备方法。

1)将贻贝粘附蛋白溶解于体积浓度为5％的乙酸溶液中，4℃搅拌5min，获得贻贝粘附蛋白乙酸溶液，其中贻贝粘附蛋白质量体积浓度为0.1g/ml；

2)将甲基丙烯酰胺胶原蛋白固体直接溶解于步骤1)中的贻贝粘附蛋白乙酸溶液中，4℃搅拌4小时，获得贻贝粘附蛋白-甲基丙烯酰胺胶原蛋白溶液，其中甲基丙烯酰胺胶原蛋白质量体积浓度为4mg/ml；

3)将4m氢氧化钠溶液逐滴加入到步骤2)获得的贻贝粘附蛋白-甲基丙烯酰胺胶原蛋白溶液中，4℃搅拌调节ph至9；

4)然后，将pegda固体加入到ph为9的贻贝粘附蛋白-甲基丙烯酰胺胶原蛋白溶液中，使pegda质量体积浓度为0.1g/ml，完全溶解后，加入5mg/ml光引发剂irgacure2959母液至最终质量体积浓度为1mg/ml，紫外光365nm下交联15min，形成pegda-贻贝粘附蛋白-甲基丙烯酰胺胶原蛋白复合水凝胶。经万能测试机测试其压缩强度为0.28mpa；通过搭接-剪切实验测试其粘附强度为33kpa。

对比例1：pegda-胶原蛋白复合水凝胶的制备方法。

1)将胶原蛋白固体直接溶解于体积浓度为5％的乙酸溶液中，4℃搅拌4小时，获得胶原蛋白溶液，其中胶原蛋白质量体积浓度为4mg/ml；

2)将4m氢氧化钠溶液逐滴加入到步骤1)获得的胶原蛋白溶液中，4℃搅拌调节ph至7；

3)然后，将pegda固体加入到ph为7的胶原蛋白溶液中，使pegda质量体积浓度为0.1g/ml，完全溶解后，加入5mg/ml光引发剂irgacure2959母液至最终质量体积浓度为1mg/ml，紫外光365nm下交联15min，形成pegda-胶原蛋白复合水凝胶。经万能测试机测试其压缩强度为0.41mpa；通过搭接-剪切实验测试其粘附强度为0.9kpa。

对比例2：pegda-甲基丙烯酰胺胶原蛋白复合水凝胶的制备方法。

1)将甲基丙烯酰胺胶原蛋白固体直接溶解于体积浓度为5％的乙酸溶液中，4℃搅拌4小时，获得甲基丙烯酰胺胶原蛋白溶液，其中甲基丙烯酰胺胶原蛋白质量体积浓度为4mg/ml；

2)将4m氢氧化钠溶液逐滴加入到步骤1)获得的甲基丙烯酰胺胶原蛋白溶液中，4℃搅拌调节ph至7；

3)然后，将pegda固体加入到ph为7的甲基丙烯酰胺胶原蛋白溶液中，使pegda质量体积浓度为0.1g/ml，完全溶解后，加入5mg/ml光引发剂irgacure2959母液至最终质量体积浓度为1mg/ml，紫外光365nm下交联15min，形成pegda-甲基丙烯酰胺胶原蛋白复合水凝胶。经万能测试机测试其压缩强度为0.75mpa；通过搭接-剪切实验测试其粘附强度为1.5kpa。

表1不同复合水凝胶机械强度和粘附性能对比

实施例3-5还考察了不同ph条件下，制备获得的pegda-贻贝粘附蛋白-胶原蛋白复合水凝胶的压缩强度-压缩应变情况，如图1可见，ph影响pegda-贻贝粘附蛋白-胶原蛋白复合水凝胶的机械强度，随着ph的升高，其机械强度明显降低，ph为5时，其机械强度最高，可达到2.3mpa。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。