人工合成的透明颤菌血红蛋白基因及相应工程菌株和应用的制作方法

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及基因工程领域，具体是指一种人工合成的透明颤菌血红蛋白基因及相应工程菌株和应用。

背景技术：

链霉菌是放线菌中的一个重要的属，它产生大多数已知抗生素及其他生物活性物质，自然界约70％的抗生素是由链霉菌及其近缘放线菌产生的。恩拉霉素(enramycin)又名恩来霉素、安来霉素、持久霉素，由13个不同种类的17个氨基酸分子组成，氨基酸组成环状多肽，脂肪酸分子连在末端的天冬氨酸上，根据末端氨基酸分子的不同分为恩拉霉素a和恩拉霉素b，恩拉霉素是这两种组分的混合物。

恩拉霉素作为一种新肽类抗生素，其抗菌作用机理是是抑制细菌细胞壁的合成。细菌细胞壁主要是维持外形、保持渗透压稳定，其主要成分为粘肽，在革兰氏阳性菌中，粘肽占细胞壁总量65％～95％。恩拉霉素能阻止粘肽的合成，使细胞壁缺损，导致细胞内渗透压升高，细胞外液渗入菌体，使细菌变形肿大，破裂而死亡。主要作用于细菌的裂殖阶段，不仅杀菌，而且溶菌。最小抑菌浓度为0.05～3.13微克/毫升。

恩拉霉素对革兰氏阳性菌有良好的抗菌作用，特别是对肠内的有害梭状芽孢杆菌抑制力很强，因此目前作为饲料添加剂使用于畜禽养殖业。饲料中添加适量的恩拉霉素不仅可以预防常见的动物消化道疾病，还可改善动物肠道内的群落平衡，有利于饲料营养成份的消化吸收，促进动物增重。同时，恩拉霉素具有广谱、低毒、无残留、不易产生耐药性和交叉抗性等优点，因此是目前少数几种可用于饲料添加剂的抗生素之一，具有广阔的市场前景。但是，目前恩拉霉素的生产主要由抗真菌素链霉菌(streptomycesfungicidicus)发酵获得，由于该菌株发酵周期长，产素水平低，限制了恩拉霉素的大规模生产和进一步的推广应用，因此，对恩拉霉素产生菌进行基因层面的菌种改良以提高其产素水平及生产性能具有重要的研究意义和社会效益。

透明颤菌血红蛋白(vhb)是目前为止研究最为透彻的原核生物血红蛋白。研究表明，vhb与氧结合可以形成氧合态，并以该方式介入细胞与氧有关的代谢途径中的某些关键步骤或途径分支点，从而改变限氧时细胞原有的代谢途径。相同培养条件下，vhb的表达可加快细胞的生长速率，提高细胞的呼吸强度，降低细胞的临界氧浓度，在大幅度的溶氧变化中保持恒定的呼吸率，从而使其在低氧条件下仍具有一定的生长优势。目前对透明颤菌血红蛋白基因的研究越来越深入，除大肠杆菌外，还在假单胞杆菌，欧文氏菌，霉菌和酵母等多种微生物中进行了研究，并成功地应用于工业生产中，提高淀粉酶、青霉素酰化酶，放线菌紫红菌素及多种生化产品的产量。抗生素的生产是一个好氧的过程，由于vhb在微氧条件下可以提高细胞的溶氧水平，促进细胞的生长以及提高次级代谢产物的产量，因此vhb在抗生素生产中受到广泛的研究和应用。安德荣等soe-pcr(splicingbyoverlapextentionpcr)技术构建含红霉素抗性基因启动子perme和vgb结构基因融合片段的整合型表达载体pjd100，利用接合转移法将vgb基因整合到瑞拉菌素产生菌委内瑞拉链霉菌秦岭变种中，使工程菌株的效价提高，但其中获得基因片段的过程操作复杂，易产生移码突变。陈文青等基于质粒pwq2005中的硫链丝菌素诱导启动子ptipa启动vgb的表达，利用接合转移法vgb基因整合到泰乐菌素的生产菌株弗氏链霉菌中，但由于ptipa启动子受到硫链丝菌素诱导，发酵过程中添加对菌体生长不利。载体pib139是在链霉菌整合型质粒pset152的多克隆位点加入启动子perme*构建而成的链霉菌穿梭质粒，便于基因在链霉菌中的高效表达，同时由于其中具有接合转移的orit功能区域，链霉菌筛选标记-安普抗性基因(apr)，整合酶基因，链霉菌温和噬菌体的attp位点。因此，pib139可利用简便高效的属间接合转移法导入链霉菌，并可通过特异性重组整合在链霉菌染色体的attb位点上，随着宿主染色体的复制而复制，赵广荣等将vgb基因构建在pib139中的perme*的下游，通过原生质体的方法转入链霉菌中，证明了链霉菌类应用此方法的可行性，但是并未考察重组菌vgb表达对菌株合成目标代谢产物的影响。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服上述现有技术中的缺失，提供一种改善重组基因工程菌株高密度发酵恩拉霉素过程中氧气供求问题、大大提高基因工程菌株的发酵水平的人工合成的透明颤菌血红蛋白基因及相应工程菌株和应用。

为了实现上述目的，本发明一方面提供了一种人工合成的透明颤菌血红蛋白基因，其中所述的基因的核苷酸序列如seqidno.1所示，记为vgbl。

本发明提供了一种人工合成的透明颤菌血红蛋白，所述的透明颤菌血红蛋白由所述的透明颤菌血红蛋白基因编码而成，所述的人工合成的透明颤菌血红蛋白与天然透明颤菌血红蛋白的氨基酸序列完全一致。

本发明提供了一种含有所述的核苷酸序列的重组质粒，通过将所述的核苷酸序列整合至载体pib139而获得，记为pib139-vgbl。

本发明提供了一种用于生产恩拉霉素的基因工程菌株，所述的菌株的染色体上整合有所述的透明颤菌的血红蛋白基因vgbl，用于提高所述的菌株对氧的利用效率。所述的vgbl核苷酸序列编码所表达产生蛋白含有146个氨基酸残基，与天然透明颤菌血红蛋白的氨基酸序列完全一致，氨基酸序列为：

mldqqtiniikatvpvlkehgvtitttfyknlfakhpevrplfdmgrqesleqpkalamtvlaaaqnienlpailpavkkiavkhcqagvaaahypivgqellgaikevlgdaatddildawgkaygviadvfiqveadlyaqave。

其中，本发明提供的基因工程菌株，是天然生产恩拉霉素的杀真菌素链霉菌的基因组中整合有血红蛋白基因vgbl的工程菌。其中的血红蛋白基因vgbl是针对天然产恩拉霉素杀真菌素链霉菌做过密码子优化的。所述的链霉菌为天蓝色链霉菌、变铅青链霉菌、阿维链霉菌、灰色链霉菌、红色糖多孢菌或珍贵橙色束丝放线菌。

所述vgbl基因的核苷酸序列如seqidno.1所示，该序列具体是在作为宿主细胞的链霉菌f25的vgb核苷酸序列的两端分别引入nde1和xba1的酶切位点从而获得。

所述的vgbl核苷酸序列的长度为441bp，g+c的百分含量为69％，使用的密码子均为天蓝色链霉菌中使用频率最高的密码子。

所述的密码子的位置具体如下表所示：

本发明提供了一种构建所述的用于生产恩拉霉素的基因工程菌株的方法，所述的方法包括步骤：

(1)构建表达载体pib139-vgbl；

(2)利用原生质体的方法将构建的表达载体pib139-vgbl转入杀真菌素链霉菌f25中，获得所述的基因工程菌株。

较佳地，所述的表达载体pib139-vgbl上的启动子perme*启动vgbl基因的表达。pib139是一个含有阿伯拉霉素抗性基因强启动子perme*的链霉菌整合型载体，vgbl处于perme*强启动子下，解除了氧对其转录的限制，利用原生质体的方法将pib139-vgbl特异性地整合入杀真菌素链霉菌f25的染色体，获得稳定遗传的基因工程菌。

本发明提供了一种所述的基因工程菌株在生产恩拉霉素的应用。将重组菌f25-vgbl进行发酵，与原始菌株相比，重组菌f25-vgbl产恩拉霉素的产量至少提高了16.6％。

本发明的有益效果为：获得可以在链霉菌中高效表达的新的透明颤菌血红蛋白基因vgbl核苷酸序列，人工合成了此基因，并将此基因转入杀真菌链霉菌atcc21013中，与原始野生菌株相比，恩拉霉素的产量提高16.6％，因此可见vgbl能够成为用来提高各种链霉菌中抗生素产量的有效手段。

附图说明

图1为链霉菌f25种子生长曲线。

图2为pib139-vgbl在大肠杆菌dh5α构建成功后，经双酶nde1，xba1双酶切的核酸验证图片。

图3为pib139-vgbl通过原生质体法导入链霉菌f25后，安普霉素(apr)核酸验证图。

图4为pib139-vgbl通过原生质体法导入链霉菌f25后，vgbl核酸验证图。

图5为pib139-vgbl导入链霉菌后，重组链霉菌f25-vgbl和原始菌分别在apr抗性平板上生长状态。

图6为重组链霉菌f25-vgblco差光谱图。

图7为利用载体pib139构建菌体本身基因orf22过表达菌株的转录水平分析。

图8为pib139-vgbl导入链霉菌后，重组链霉菌f25-vgbl和原始菌f25产恩拉霉素的发酵曲线。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，下面对本发明的具体实施方法作进一步说明。

实施例1

(1)基因vgb密码子修改和新基因vgbl的全合成

依据天蓝色链霉菌(streptomycescoelicolor)基因组中密码子的使用频率，其中使用频率，检查基因vgb天然序列中的每一个密码子，保持氨基酸序列不变，产生新的基因vgbl。为了后续实验的操作方便，在基因vgbl两端分别引入nde1和xba1的酶切位点，其中在vgbl核苷酸序列的5，端添加9个核苷酸，形成限制性内切酶nde1位点和保护碱基，在vgbl核苷酸序列的3，端添加8个核苷酸，形成限制性内切酶xba1位点和保护碱基。将vgbl全基因合成，合成的这一段dna被插在载体pib139载体的相应的位点上，测序证明无误。其中基因全合成、插入载体、测序验证由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

(2)质粒的构建

pib139是一个含有红霉素抗性基因强启动子perme*的链霉菌整合型载体，vgbl处于启动子perme*强启动子之下，解除了氧对其转录的限制。可以通过原生质体的方法转入链霉菌，发生位点特异性重组后整合在链霉菌的染色体上，随着染色体一起复制和遗传。

(3)把质粒导入链霉菌宿主以及转化子的筛选和验证

本实施例中涉及的菌株杀真菌素链霉菌源于山东杰诺生物酶科技有限公司所有，以菌株杀真菌素链霉菌f25作为宿主，以恩拉霉素a和恩拉霉素b双组份的产量作为检测标准。

原生质体制备具体实施过程如下:

杀真菌素链霉菌原生质体培养基制备的最佳配方：

称取3％tsb培养基干粉，3％大豆胨，2％糊精，0.69％磷酸氢二钠，0.1％磷酸二氢钾，0.08％硫酸镁，0.01％氯化钙，0.2％微离子溶液，ph7.(培养时需加入一定量玻璃珠)，115℃高压灭菌20min，烘箱干燥后置于常温备用。

tsb-甘氨酸培养基(培养链霉菌用于制备原生质体)

50mltsb体系中加入0.25g的甘氨酸；培养抗性菌株时，应在培养基中添加相应抗生素。制作原生质体的一级、二级、三级菌株生长曲线，一级种子的生长时间分别为24，32，40，48，56，64，72，80，84h取样，以单位体积的菌体的湿重为指标，测定其生长曲线，其曲线如图1所示；通过生长曲线，确定一级种子最佳的培养时间为3天。原生质体制备时所需溶菌酶的含量为1mg/ml,酶解的最佳时间为40min。制备好的原生质体通过r3m固体培养基平板检测原生质体的再生率为20％，因此原生质体具有较高的活性，证明可作为宿主用于质粒的转入。链霉菌原生质体的再生和孢子形成的r3m培养基配方如下：蔗糖(sucrose)10.3％，酵母提取物(yeastextract)0.4％，酪蛋白氨基酸(casaminoacids))0.4％，硫酸钾(k2so4)：0.025％，胰蛋白胨(tryptone)0.4％，琼脂粉(agar)：2.2％。搅拌溶解，115℃灭菌20min，使用前在无菌条件下加入以下已灭菌处理的溶液，50％glucose4.0ml，2.5mol/lcacl24.0ml，2.5mol/lmgcl24.0ml，2mol/ltris-hcl(ph7.0)2.5ml，1mol/lnaoh0.5ml，0.5mol/lkh2po474μl。微量元素溶液40μl。微量元素溶液(1l):zncl240mg，fecl3·6h2o200mg，cucl2·2h2o10mg，mncl2·4h2o10mg，na2b4o7·10h2o10mg，(nh4)6mo7o24·4h2o10mg。最后将制备好的质粒，通过peg-t介导的方式，转入制备好的原生质体中，然后涂布于相应的r3m固体培养基中，无菌鼓风吹干后，30℃培养箱培养30h后，然后用含有200ug安普霉素的1ml无菌水覆盖平板，30℃继续至长出转化子，并挑出转化子在抗性平板上进行多次复筛。将各转化子接种在含有安普霉素素抗性的tsb改进培养基中，28℃培养2～3天。

液体培养基中活化得到各转化子，提取各转化子的基因组dna，用引物pib139y-f和pib139y-f，pcr扩增vgbl基因，用引物apr-f和apr-r扩增安普霉素抗性基因，序列如下：

pib139y-f:5'-ttgggctgcaggtcgactctagt-3'

pib139y-r:5'-agtgagcgaggaagcggaagag-3'

apr-f:5'-gtgcaatacgaatggcgaaaagc-3'

apr-r:5'-tcagccaatcgactggcgag-3'

pcr验证结果如图3和图4所示，图3中泳道1-4，图4中泳道2箭头所指分别为扩增出的apr基因条带，图4中泳道1箭头所指为扩增出的vgbl基因条带，而以出发菌株的染色体为模板时均未扩增出相应的条带(图3泳道5和6)，证实了重组质粒pib139-vgbl的成功整合。

所得重组vgb基因的杀真菌素链霉菌命名为链霉菌f25-vgbl。

(4)链霉菌f25-vgbl在恩拉霉素发酵中的应用

用无菌水洗涤杀真菌素链霉菌和重组链霉菌f25-vgbl的斜面孢子，制成孢子悬液(7×108个/ml)，按10％的接种量接种到5ml的种子培养基中，30℃，转速200r/min，发酵12d。发酵结束后分别测定vhb的活性及恩拉霉素的产量。

vhb活性测定步骤如下：

1)、取20ml发酵液离心，沉淀用等体积生理盐水洗涤一次后，重悬于10ml0.1m的磷酸缓冲液(ph7.5)中，超生破碎(300w，破碎5s，间隙5s，破碎时间20min)；

2)、将经上述处理的样品分成两份，一份通co3min，另一份通空气3min；

3)、用紫外可见分光光度计，在400-500nm范围内分别对两份样品扫描，以通入空气的样品为对照，所得曲线即为co差光谱图(图6)。

4)、如图5所示，与原始菌株相比，重组菌f25-vgbl在420nm处有吸收峰，证明了vgbl基因的成功表达。

5)、恩拉霉素的测定方法为取2ml发酵液，加入18ml预先配制好的丙酮浸提液(丙酮:2m盐酸:水＝20:1:21)，使用超声波震荡40分钟后，离心，取上清液，经过的滤膜过滤后，注射到hplc系统中。色谱柱c18反向色谱柱，4.6×150mm，φ＝5μm，流速1.0ml/min，检测波长267nm，流动相乙腈：50mm磷酸二氢钠＝3：7，ph4.5。根据分析得到各组分面积，计算改造后菌株发酵液中的恩拉霉素产量，与原始菌株相比，f25-vgbl的恩拉霉素产量提高了16.6％。图7是杀真菌素链霉菌和重组菌f25-vgbl的恩拉霉素产量的比较。

以上验证perme*启动下的基因vgbl能够提高抗生素产量，选取了一野生型链霉菌为宿主，检测orf22蛋白的产量变化。通过原生质体的方法将pib139-orf22转入野生型链霉菌中，选取转化子进行发酵，检测恩拉霉素产量的变化，与野生型菌株相比，pib139-orf22转化菌株中恩拉霉素的转录水平增加6.93倍，进而可以证明化学合成的基因可以在perme*的启动下正常转录和表达，并行使功能，提高抗生素表达。

本发明的有益效果为：获得可以在链霉菌中高效表达的新的透明颤菌血红蛋白基因vgbl核苷酸序列，人工合成了此基因，并将此基因转入杀真菌链霉菌atcc21013中，与原始野生菌株相比，恩拉霉素的产量提高16.6％，因此可见vgbl能够成为用来提高各种链霉菌中抗生素产量的有效手段。

在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以做出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。

序列表

<110>枣庄市杰诺生物酶有限公司

华东理工大学

<120>人工合成的透明颤菌血红蛋白基因及相应工程菌株和应用

<130>1

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>441

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

atgctggaccagcagaccatcaacatcatcaaggccaccgtgccggtcctgaaggagcac60

ggcgtcaccatcaccaccaccttctacaagaacctgttcgccaagcaccccgaggtgcgc120

ccgctgttcgacatgggccgccaggagtccctggagcagccgaaggccctggccatgacc180

gtcctggcggccgcccagaacatcgagaacctgccggccatcctgccggccgtcaagaag240

atcgccgtgaagcactgccaggcgggcgtcgccgcggcccactacccgatcgtgggccag300

gagctgctgggcgccatcaaggaagtgctgggcgacgcggccaccgacgacatcctggac360

gcctggggcaaggcgtacggcgtgatcgcggacgtcttcatccaggtggaggccgacctg420

tacgcccaggccgtggagtga441