大豆亚硫酸盐输出蛋白GmSET1编码基因的应用的制作方法

本发明涉及大豆亚硫酸盐输出蛋白gmset1编码基因的应用，属于基因工程领域。

背景技术：

大豆蛋白质含量丰富属高蛋白豆类植物，一般豆类蛋白质含量约为20％-30％，碳水化合物占60％左右，而大豆的蛋白含量达到40％左右，其他物质如碳水化合物约占26％，油脂占20％，矿物质占4％，磷脂占2％，并且其还富含丰水溶性和脂溶性维生素，对人类饮食和畜禽饲料来说营养价值极高。相比于玉米、小麦和菜豆等作物，大豆含硫氨基酸含量相对较高，平均为2.4％，但是与3.5％的标准氨基酸比例(由联合国粮食及农业组织fao规定)相比，还是比较低的。其中met的含量相对更低，只有1.1-1.6％，成为大豆营养品质的第一限制性氨基酸。因此高大豆营养品质和蛋白利用率的关键是增加大豆籽粒含硫氨基酸的相对含量。

技术实现要素：

本发明的目的在于公开大豆亚硫酸盐输出蛋白gmset1的大豆营养型改良基因工程应用，该基因可作为目的基因导入大豆毛状根中，gmset1通过增加大豆中甲硫氨酸及半胱氨酸的含量来显著提高其总含硫氨酸的含量。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

seqidno.1所示大豆亚硫酸盐输出蛋白gmset1的编码基因在基因工程改造大豆含硫氨基酸含量中的应用。

本发明所述的应用,优选过表达该基因，能够显著提高大豆含硫氨基酸的含量。

有益效果

本发明通过实验发现过表达gmset1的大豆阳性毛状根中基因的转录水平和含硫氨基酸含量都得到了显著提高。与对照相比，gmset1的相对表达量最高达到其3.43倍，met含量最大提高了35.6％，且总含硫氨基酸含量最大提高了22.7％。因此判断gmset1对大豆含硫氨基酸的合成有促进作用，这对大豆营养品质的改良有重要意义。

附图说明

图1.gmset1的pcr扩增结果。

m为marker(dl2000，takara)；1、2、3为gmset1的目的条带

图2.gmset1在大豆各组织中的转录水平。以科丰材料的根、茎、叶、花、15天和45天的荚皮及种子的cdna为模板，使用荧光定量qrt-pcr的方法验证gmset1在植物不同组织中的表达模式。

root：根；stem：茎；leaf：叶；flower：花；15dpod:开花后15天荚皮；45dpod：开花后45天荚皮；15dseed：开花后15天种子；45dseed：开花后45天种子

图3.gmset1在四份极端材料中的表达量。测定了gmset1在2份高含硫氨基酸材料及份低含硫氨基酸材料中的表达情况，以验证其转录水平与大豆含硫氨基酸的关系。

njau_c097：新昌六月豆；njau_c179：鄂豆7号；njau_c097和njau_c179为高含硫氨基酸材料；njau_c129：柘城紫花糙；njau_c201：长垣范屯小天鹅蛋，njau_c129和njau_c201为低含硫氨基酸材料。

图4.大豆毛状根的阳性检测。

m：dl2000；n,negativecontrol

图5.大豆毛状根中过表达gmset1基因的转录水平。提取pcr检测为阳性的大豆毛状根总rna进行qrt-pcr，检测目的基因gmset1在对照和过表达毛状根中的转录水平。

图6.过表达gmset1大豆毛状根中含硫氨基酸含量。测定了转化为阳性的毛状根游离含硫氨基酸含量，以验证过表达gmset1对大豆含硫氨基酸含量产生的影响。

cys：半胱氨酸；met：甲硫氨酸；saa：总含硫氨基酸

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。

下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。

实施例1

以大豆品种科丰1号为取材对象，取其叶，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mlep管，充分振荡后，移至1.5mlep管中，抽提总rna(totalrnakit，天根，北京，中国)。用甲醛变性胶电泳鉴定总rna质量，分光光度计测定rna含量。以获得的总rna为模板，按照日本takara公司提供的反转录试剂盒(takaraprimerscript^tmrtreagentkit，日本)的说明书进行反转录，得到cdna第一链后，进行pcr扩增，pcr程序如下pcr程序如下：95℃预变性3分钟，95℃变性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸90秒，共35个循环，最后72℃保温5分钟，随后12℃恒温，获得科丰1号的cdna。

从ncbi数据库和phytozomev12大豆数据库，找到gmset1所对应的基因(glyma.10g07420，geneid:100788770)，根据数据库提供的核苷酸序列设计特异引物引物，引物序列见seqidno.3和seqidno.4，从大豆品种科丰1号的基因编码区(cds)序列扩增基因，pcr克隆后随后进行pcr产物割胶纯化、连接及转化工作，挑取阳性单克隆测序，测序后获得具有完整编码区的长度为1395bp的大豆gmset1基因的cds序列，其中编码区序列见seqidno.1，大小为1395bp(图1)，核苷酸序列和氨基酸序列(seqidno.1和seqidno.2)。

2)gmcdf1在科丰1号材料中的组织表达分析

在科丰1号材料出苗4周时取根、茎、叶，开花时取花，开花后分别取其15天和45天的荚和种子于液氮中速冻，后储存于-80℃冰箱保存，总rna的提取同步骤1)。以科丰材料各组织取样获得的总rna为模板，反转为cdna。gmset1荧光定量引物序列见seqidno.5和seqidno.6，检测gmset1基因受盐胁迫的表达量变化以大豆组成内参基因tubulin作为内部参照，引物序列见seqidno.7和seqidno.8，进行实时荧光定量pcr反应(real-timert-pcr)。

以科丰材料的根、茎、叶、花、15天和45天的荚皮及种子的cdna为模板，使用荧光定量qrt-pcr的方法验证gmset1在植物不同组织中的表达模式。结果表明，gmset1在根中表达量较高，其次是15天的荚皮、叶和花，在其他组织中的表达量较低(图2)。

实施例2基因gmset1的基因工程应用

1)大豆亚硫酸盐输出蛋白编码基因gmset1的克隆

以大豆品种科丰1号根的总rna为模板，经反转录合成cdna第一链后，进行pcr扩增，引物序列见seqidno.9和seqidno.10，pcr程序如下：95℃预变性3分钟，95℃变性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸90秒，共35个循环，最后72℃保温5分钟，随后4℃恒温，测序后获得具有完整编码区的长度为1395bp的大豆gmset1基因的cds序列,其序列见seqidno.1；

2)植物表达载体的构建

构建过表达载体时，将gmset1基因序列与vazyme公司的entryonestepcloningkit(c114-01)试剂盒中的ceentryvector载体进行bp反应，并进行菌液pcr测序验证，引物序列见seqidno.9和seqidno.10，具体的pcr过程与步骤1)相同，获得入门载体。接着将得到的入门载体与vazyme公司开发的entryonestepcloningkit(c112-01)进行同源重组，得到pmdc83-gmset1植物过量表达表达载体，植物转化载体pmdc83含有2x35s强启动子，可强烈诱导目的基因gmset1在受体中的表达。然后通过冻融法将载体转入根癌农杆菌菌株k599中。同时将空载pmdc83也转化到k599中，作为空载对照。

3)转基因毛状根的获得

利用kereszt等人(2007)提出的大豆毛状根转化方法，将步骤2)获得的pmdc83-gmset1载体及空载对照的发根农杆菌菌株k599菌液涂布在含有50mg/lkan和50mg/lrif的yeb固体培养基上，28℃倒置培养36-48h。将验证为阳性的单克隆接种于1ml含有50mg/lkan和50mg/lrif的yeb液体培养基中，28℃，200rpm摇10h。将1ml菌液全部加入100ml新的含有抗生素的yeb液体培养基中，28℃摇至od600达到0.8左右。将其转入50ml离心管中4500rpm离心10min，弃上清。用高压灭菌过的10mmmgcl2重新悬浮菌液，测得od600在0.5左右。在剪下的培养好的大豆子叶背部挖一个洞，在white固体培养基上使其背部朝上平铺(培养基含有头孢和羧苄青霉素)。在子叶洞里滴1-2滴用mgcl2悬浮过的菌液。后置于培养箱中，在设定的25℃环境下进行3周的培养。

为检测是否为阳性毛状根，利用特异性引物对提取的dna片段进行pcr检测。过表达毛状根检测引物序列见seqidno.11和seqidno.12，pcr阳性毛状根检测胶见图4。实时荧光定量qpcr发现在过表达毛状根(pmdc83-gmset1)中gmset1基因表达量要显著高于对照的(图5)。

为了验证过表达gmset1对大豆含硫氨基酸含量是否会产生影响，根据阳性pcr结果，对转化为阳性的毛状根游离含硫氨基酸含量进行测定。将培养了3周毛状根去除多余培养基后放入冷冻干燥机中冻干并磨成粉末状。用5ml10mmhcl浸提置于2ml离心管中100mg左右的粉末，后过滤定容至10ml。在离心管中吸入500μl的磺基水杨酸及定容液体，离心15min(15000rpm)。用0.22μm的水系滤膜过滤上清液于上机瓶中。游离氨基酸含量的测定使用氨基酸分析仪l-8900。结果发现，与对照相比，cys和met含量都得到了显著提高，尤其是met含量，最大提高了35.6％，总含硫氨基酸含量最大提高了22.7％(图6)，说明其对大豆含硫氨基酸的合成至关重要。

序列表

<110>南京农业大学

<120>大豆亚硫酸盐输出蛋白gmset1编码基因的应用

<160>12

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1395

<212>dna

<213>大豆(glycinemax)

<400>1

atgccaatgttgtcttcgagaggcttcatcgcttatctcgtatctgctttctcttgtgct60

gttctgtctgcgctttttctcaccaaccacatccatcatgatgataacaagccaattact120

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<213>大豆(glycinemax)

<400>2

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151015

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202530

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145150155160

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165170175

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195200205

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210215220

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245250255

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260265270

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355360365

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370375380

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435440445

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<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

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<210>4

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<211>22

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

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