一种香豆素衍生物及其合成方法和应用与流程

本发明涉及香豆素衍生物，具体属于一种香豆素衍生物及其合成方法，以及该衍生物在超灵敏检测半胱氨酸中的应用。

背景技术：

研究表明，半胱氨酸的来源途径之一是胱硫醚β-合酶(cbs)和胱硫醚γ-裂解酶(cse)对同型半胱氨酸的硫转移；同时，半胱氨酸也可以通过γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(gcs)和谷氨酰胺合成酶(gs)的连续作用转化为谷胱甘肽。因此，作为细胞内活性硫物质的转运站，半胱氨酸在生物体中起着重要作用。半胱氨酸作为一种还原性物质，与维持氧化还原的稳态，蛋白质翻译和折叠，以及信号转导等生理过程方面有着紧密的联系。正常血浆中cys的总浓度为250μm，细胞中半胱氨酸的总浓度为30～200μm。同时，研究表明，半胱氨酸浓度的异常往往与某些疾病有关，如心脑血管疾病，阿尔茨海默病，抑郁症，肠道损伤甚至癌症。

近年来，荧光探针因其设计选择性好、具有低细胞毒性、可原位检测等优异的性能而引起了许多人的关注，已成为生物医学发展中具有广阔前景的课题之一。

在本发明中，合成了一种基于香豆素的化合物，通过半胱氨酸和化合物在反应前后荧光信号的变化，实现半胱氨酸的超灵敏、特异性检测。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种香豆素衍生物及其合成方法，以及该衍生物在检测半胱氨酸中的应用，该衍生物用于检测半胱氨酸时检出限低，选择性好。

本发明提供的一种香豆素衍生物，中文名称为((e)-7-(二乙基氨基)-3-(3-(4-((7-硝基苯并[c][1,2,5]恶二唑-4-基)氧基)苯基)丙烯酰基)-2h-吡喃-2-酮，英文名称为(e)-7-(diethylamino)-3-(3-(4-((7-nitrobenzo[c][1,2,5]oxadiazol-4-yl)oxy)phenyl)acryloyl)-2h-chromen-2-one，命名为cns。其结构式为：

cns的合成方法，步骤为：

1)按摩尔比1:1～1.5将3-乙酰基-7-二乙基氨基-香豆素与对羟基苯甲醛在无水乙醇中搅拌溶解；加入催化量的哌啶，逐渐加热至回流，回流后搅拌该混合溶液12～24小时，待反应完全后，减压除去溶剂，经硅胶柱层析纯化，得到橙色粉末即化合物1；

2)将化合物1和nbd-cl按摩尔比1:1～1.5一同溶解于无水乙醇中，随后加入催化量的tfa,常温下搅拌12～24小时，然后将反应溶液倒入冰水中，搅拌2～2.5小时，用适量的二氯甲烷萃取，收集有机相，干燥，减压除去溶剂后经硅胶柱层析纯化，得到橙色固体cns。

作为优选：步骤1)中3-乙酰基-7-二乙基氨基-香豆素和对羟基苯甲醛的摩尔比为1:1.2。步骤2)中化合物1和nbd-cl的摩尔比为1:1.1。

上述合成的香豆素衍生物cns用于超灵敏检测半胱氨酸。

一种检测半胱氨酸的方法，包括如下步骤：

(1)、配制ph＝7.4、浓度为10mm的pbs缓冲溶液，配制2mm的半胱氨酸水溶液，配置2mm的cns的dmso溶液；

(2)、取1800μlpbs缓冲溶液、200μldmso、0.5μlcns的dmso溶液于荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，随着半胱氨酸的加入，555nm处的荧光强度的逐渐增强；

(3)、在10个比色皿中，各加入1800μlpbs缓冲溶液、200μldmso、0.5μmcns的dmso溶液，分别加入半胱氨酸溶液的量为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1μm，5min后在荧光光谱仪上测定555nm处荧光强度为181、228.7、272.1、316.2、359.3、396.4、469.7、513.2、576.3、670.6，以半胱氨酸浓度为横坐标，以荧光强度为纵坐标绘制图，得到半胱氨酸浓度的工作曲线；线性回归方程为：f-f⁰＝506.91818c+121.16818,r²＝0.9862，c的单位为10^-6mol/l；

(4)、测定样品溶液时，将测得的荧光强度代入线性回归方程，即可求得半胱氨酸的浓度。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

1、本发明香豆素衍生物cns的合成只需两步，合成方法简单，操作方便；

2、本发明将香豆素衍生物cns用于半胱氨酸检测，将nbd设计为识别位点，由于nbd氨基衍生物优异的光学性质，检出限远远小于其他检测半胱氨酸荧光探针，为0.02μm；

3、检测手段简单，只需要借助荧光光谱仪即可实现；

4、检测信号明显，为增强型荧光；

5、通过生物学应用，探针可成为研究半胱氨酸在活体中功能的良好传感器，也为疾病的诊断和治疗提供了新的途径。

附图说明

图1实施例1制备的cns的核磁氢谱图

图2实施例1制备的cns的核磁碳谱图

图3实施例1制备的cns的质谱图

图4cns与半胱氨酸作用的荧光发射图

图5cns测定半胱氨酸的工作曲线

图6cns与各种分析物的荧光柱状图

图7cns测定半胱氨酸的时间曲线

图8cns测定内、外源性半胱氨酸的细胞成像图

图9cns测定不同浓度外源性半胱氨酸的细胞成像图

图10cns测定内、外源性半胱氨酸的活体(斑马鱼)成像图

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明保护范围不受下述实施例的限制。

实施例1

cns的制备和表征

1)按摩尔比1:1.2将3-乙酰基-7-二乙基氨基-香豆素与对羟基苯甲醛在无水乙醇中搅拌溶解；加入催化量的哌啶，逐渐加热至回流，回流后搅拌该混合溶液12～24小时，待反应完全后，减压除去溶剂，经硅胶柱层析纯化，得到橙色粉末即化合物1；

2)将化合物1和nbd-cl按摩尔比1:1.1一同溶解于无水乙醇中，随后加入催化量的tfa,常温下搅拌12～24小时，然后将反应溶液倒入冰水中，搅拌2～2.5小时，用适量的二氯甲烷萃取，收集有机相，干燥，减压除去溶剂后经硅胶柱层析纯化，得到橙色固体cns(0.18g,37％yield)。¹hnmr(600mhz,dmso-d6)8.67–8.60(m,2h),8.00(d,j＝16.5hz,1h),7.95(d,j＝6.7hz,2h),7.76(d,j＝16.4hz,1h),7.71(d,j＝8.3hz,1h),7.51(d,j＝7.3hz,2h),6.84(t,j＝10.8hz,2h),6.63(s,1h),3.32(s,4h),1.16(s,6h),(见图1)。¹³cnmr(151mhz,dmso-d6)δ186.0,160.4158.8,154.8,153.6,153.1,149.0,145.9,144.9,140.8,135.9,134.1,132.9,131.3,131.1,130.1,126.4,121.9,115.9,110.8,110.7,108.4,96.4,45.0,12.9.(见图2)。esi-msm/z:[m+na]⁺calcdfor549.1380；found549.1377(见图3)。

实施例2

在荧光比色皿中，加入1800μlpbs缓冲溶液、200μldmso、0.5μmcns的dmso溶液，逐渐加入半胱氨酸水溶液(0-1μm)，每加入一次，5min后在荧光光谱仪上测定555nm处荧光强度，荧光强度逐渐增强(见图4)。

实施例3

配制ph＝7.4、浓度为10mm的pbs缓冲溶液，并用dmso配制2mmcns的溶液，配制2mm半胱氨酸水溶液；在10个比色皿中，取1800μlpbs缓冲溶液、200μldmso、0.5μmcns的dmso溶液，分别加入半胱氨酸溶液的量为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1μm，5min后在荧光光谱仪上测定555nm处荧光强度为181、228.7、272.1、316.2、359.3、396.4、469.7、513.2、576.3、670.6，以半胱氨酸浓度为横坐标，以荧光强度为纵坐标绘制图，得到半胱氨酸浓度的工作曲线；线性回归方程为：f-f⁰＝506.91818c+121.16818,r²＝0.9862，c的单位为10^-6mol/l(见图5)。

实施例4

配制ph＝7.4、浓度为10mm的pbs缓冲溶液，配制2mmcns的dmso溶液，配制2mm的半胱氨酸水溶液；在荧光比色皿中，加1800μlpbs缓冲溶液、200μldmso和0.5μmcns的dmso溶液，再分别加入10倍当量的其它分析物和半胱氨酸：1.arg,2.asn,3.asp,4.br^-,5.cl^-,6.cn^-,7.co3^2-,8.f^-,9.trp,10.glu,11.gly,12.gsh,13.h2s,14.hcy,15.i^-,16.leu,17.lys,18.no2^-,19.phe,20.thr,21.val,22.cys,23.hyp,24.try,25.gagb,26.tyr,27.so4^2-)的水溶液，在荧光分光光度仪上检测，绘制不同分析物对应的555nm处荧光强度柱状图(见图6)。半胱氨酸使得检测体系在555nm处荧光强度明显升高，其它的分析物基本没有引起检测体系荧光强度的变化。

实施例5

配制ph＝7.4、浓度为10mm的pbs缓冲溶液，配制2mmcns的dmso溶液，配制2mm的半胱氨酸水溶液；在荧光比色皿中，加1800μlpbs缓冲溶液、200μldmso和0.5μmcns的dmso溶液，再加入1μl半胱氨酸水溶液，在555nm处测得其反应时间为300秒.(见图7)。

实施例6

配制ph＝7.4、浓度为10mm的pbs缓冲溶液，并用dmso配制2mmcns的溶液，配制2mm半胱氨酸水溶液；把5μlcns的dmso溶液加入到2ml的pbs中；将探针溶液加入hela细胞培养液中，使得其浓度为5μm，与hela细胞在37℃下，孵育15分钟后用pbs溶液冲洗三次，进行激光共聚焦成像，此时细胞内有微弱荧光；把20mμnem(n-乙基马来酰亚胺：细胞内硫醇清除剂)溶液加入到2ml的pbs中，将溶液加入hela细胞培养液中，在37℃下孵育20分钟后用pbs溶液冲洗三次，进行激光共聚焦成像，细胞内无荧光；向孵育过nem的细胞中再加入5μm的探针溶液，在37℃下孵育15分钟后用pbs溶液冲洗三次，进行激光共聚焦成像，此时细胞在荧光成像仪下显示出明显黄色荧光(见图8)；将探针溶液加入hela细胞培养液中，使得其浓度为5μm，与hela细胞在37℃下，孵育15分钟后用pbs溶液冲洗三次，再加入外源的半胱氨酸，使其浓度分别为30μm、50μm、100μm、200μm，在37℃下，孵育15分钟，随后均用pbs缓冲溶液冲洗三次，进行激光共聚焦成像，此时细胞在荧光成像仪下显示出不同程度的黄色荧光，如图9。

实施例7

配制2mmcns的dmso溶液，配制2mm半胱氨酸水溶液；当探针cns(10μm，15分钟)与未处理的斑马鱼直接孵育时，在黄色通道中发出强荧光信号。然而，探针在nem预处理的斑马鱼中孵育，荧光信号强度显着降低。nem和探针预处理后cys再灌注时，黄色通道的荧光强度再次增强(见图10)。实验结果表明，探针cns可以对斑马鱼内源性和外源性cys进行特异性成像。

上述实验结果说明cns是检测活体内半胱氨酸良好的候选者。