本发明属于发酵工程领域，具体涉及一种用于生产甘精胰岛素的培养基及发酵方法。
背景技术：
：发酵研究的主要目标在于使用高生产率技术使目的产品产生良好的成本效益。由于大多数蛋白在重组大肠杆菌中属于细胞内累积，故生产率与终细胞密度及单位生产率成正比关系。高密度发酵不仅可以提高生产率，还能降低培养容积、生产成本及设备投资，同时便于下游加工、减少废水排放，故高密度培养成为近年来发酵工业重要目标与方向之一。pan(advbiochemengbiotechno，2003；85：43-93)等通过恒速流加培养，生产人生长激素，菌体od600值达到120；allen(biophanmacology，1987；1：38-419)等曾用合成培养基培养重组大肠杆菌，菌密度达到了79g(dcw)/l，但外源蛋白没有表达；jung(anninstpasteurmicrobio，1988；139：129-146)等采用该技术生产干扰素，菌体浓度达到46g(dcw)/l，干扰素比生产率为17mg/g菌体；周宇荀(生物工程学报，2005，21(4)：615-625)等抗菌肽基因工程菌最高发酵密度达到od600＝119，菌体浓度达到40g/l(dcw)，而目的蛋白表达量仅为5％左右，并有40％的工程菌丢失了质粒。变流速或梯度增加流加速度可以在菌体密度较高的情况下通过加入更多的营养物质促进细胞的生长，并对产物的表达有利。李民(生物工程学报，1998，14(3)：270-276)等采用三阶段式流加葡萄糖的方式，高密度培养重组菌yk537/pdh-b2m生产骨形成蛋白(bmp-2a)，发酵密度达od600＝53，bmp-2a产量为2.78g/l。基因工程菌在发酵过程中重组质粒会出现一定的不稳定性，将导致得不到预期的目的基因产物及产量。质粒的不稳定性分为dna片段发生重组、缺失或插入的结构性不稳定和细胞分裂时质粒未进入子细胞的分离不稳定。质粒的稳定性受到宿主和质粒的基因型、宿主和质粒的相互作用、基因表达程度、培养温度、营养限制和反应器操作方式等多种遗传和环境因素的影响。基因工程发酵通常需要高密度菌体培养，以获得更多的目的产物，然而过高的菌体密度会影响工程菌的质粒稳定性。工程菌高密度培养是获得外源基因表达产物的重要手段，但高密度培养的主要障碍之一是代谢副产物乙酸的积累。随着发酵培养密度的提高，乙酸的积累增加，并直接影响菌体的生长和外源蛋白的表达，逐渐成为制约工程菌高密度培养的重要因素。jensen(biotechbioeng，1990；36：1-11)等报道当培养液中乙酸浓度大于6g/l时，乙酸会明显抑制菌体生长；当乙酸浓度大于2.4g/l时，会显著降低比产率。konstan(biotechbioeng，1990；36(1)：750-758)等报道培养液中乙酸浓度大于15g/l时菌体生长就完全停止了。boon(biotechnolletts，1992；14(12):1115-1118)等人利用从大肠杆菌衍生的三株宿主菌与对应的重组菌做乙酸抑制实验，发现重组菌比宿主菌更容易受到乙酸的抑制。cn104726524a公开了一种培养基及用该培养基发酵生产甘精胰岛素前体的方法，通过添加盐类和微量元素来降低有害代谢产物(主要是乙酸)的积累，改善细胞生长，增加菌体得率，虽然产量有所提升，但仍不理想；cn106282274a公开了一种胰岛素前体蛋白的毕赤酵母高密度发酵方法，cn107022591b公开了一种提高胰岛素及其类似物前体表达的毕赤酵母发酵方法，均属于高密度发酵，但需发酵培养130h以上，发酵周期长。基因工程菌高密度发酵，不仅需要获得高的菌体密度，还得兼顾乙酸的积累、质粒稳定性和高效表达，四者之间相互影响，相辅相成。通过以上专利和文献可以看出，现有技术通常只顾及了其中的一方面或几方面，特别是考察高密度培养过程中质粒稳定性的文献更少。因此基因工程菌仅按传统的发酵工艺进行生产是远远不够的，需要对影响高密度发酵和外源基因表达的因素进行综合分析，进而探索出一套适于外源基因高效表达的高密度发酵工艺。技术实现要素：鉴于现有技术存在的诸多缺陷，本发明提供一种简单可行的既能提高甘精胰岛素产量，又能保证低质粒丢失率的培养基和发酵方法。本发明的第一个目的在于提供一种用于生产甘精胰岛素的基础培养基，所述基础培养基包含甘油、酵母提取物、胰蛋白胨、氯化铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钠和微量元素。优选地，所述微量元素包含硫酸亚铁、氯化钴、硫酸铜、氯化钙、氯化锌、硼酸、硫酸锰。进一步优选地，每升基础培养基包括下表1所示的组份：表1进一步优选地，所述微量元素包括下表2所示的组份：表2组分浓度(g/l)组分浓度(g/l)feso4·7h2o10～20zncl20.5～2.5cocl2·6h2o1～5h3bo30.2～1cuso4·5h2o0.2～1mnso4·h2o0.2～1cacl25～15——本发明的第二个目的在于提供一种用于生产甘精胰岛素的补料培养基。所述补料培养基包含甘油、酵母提取物、胰蛋白胨、硫酸镁。优选地，所述补料培养基组成为：glycerol400～600g/l，yeastextract40～80g/l，tryptone80～120g/l，mgso4·7h2o1～3g/l。本发明的第三个目的在于提供一种用于生产甘精胰岛素的发酵方法，技术方案如下：a、将工程菌菌种在种子培养基中逐级放大培养，获得种子液；b、种子液接种至发酵罐基础培养基中进行高密度培养，分批次流加补料培养基，至培养结束。优选地，所述工程菌菌种为pet-glargine/bl21(de3)plyss，构建方法参照专利cn1663960b。本发明方法也适用于产甘精胰岛素的pet-glargine/bl21(de3)，pet-glargine/bl21star等菌株。优选地，所述种子液接种至发酵罐基础培养基中的接种量为：种子液的体积为基础培养基体积的5～10％。优选地，补料过程中所需补料培养基用量为：总补料量为基础培养基体积的23-27％。优选地，补料过程中第一次流加补料培养基控制流速每5～8h流加总补料量的30～35％，第二次流加补料培养基控制流速每15～18h流加总补料量的65～70％。优选地，高密度培养过程中，控制发酵液溶氧量不低于30％，温度为36.0～38.0℃，ph值为7.0～7.2。发酵过程中会产生乙酸，大量乙酸的产生会降低ph，抑制菌体生长，为了降低乙酸对发酵的影响，需要对发酵体系的ph进行控制调整，优选地，用氨水来对反应体系的ph进行控制；氨水用量反映出反应体系产生乙酸的量。以下内容进一步详述一种用于生产甘精胰岛素的发酵方法，包括如下步骤：a、将工程菌菌种在种子培养基中逐级放大培养，获得种子液；步骤a种子液培养具体步骤如下：接种工程菌菌种至固体种子培养基的斜面上，37.0℃培养12～15h，取出放冰箱2～8℃保存；挑取培养好的种子斜面菌落接种于液体种子培养基中，于恒温振荡器中37.0℃培养5～8h，得一级摇瓶种子液；将培养好的一级摇瓶种子液接种于液体种子培养基中，于恒温振荡器中37.0℃培养12～15h，得二级摇瓶种子液。本发明不限定种子液培养步骤，任何现有的用于种子液培养的固体培养基、液体种子培养基及其培养方法均可用于本发明。b、种子液接种至发酵罐基础培养基中进行高密度培养，分批次流加补料培养基，至培养结束。具体步骤如下：按照5～10％的接种量接种二级摇瓶种子液至发酵罐基础培养基中，控制发酵罐内溶氧量不低于30％、温度36～38℃，使用氨水自动控制ph7.0～7.2。当溶氧上升且ph同时上升时，开始第一次流加补料培养基，控制流速每5～8h流加总补料量的30～35％，暂停补料后，ph和溶氧值会短暂上升。当培养至od600＝50～60时，加入诱导剂进行诱导。随后开始第二次流加补料培养基，控制流速每15～18h流加总补料量的65～70％，补料流加完毕发酵结束，总补料量为两次流加补料培养基的总量，为基础培养基体积的23～27％。优选地，所述溶氧上升，是指溶氧达到90％。优选地，所述诱导剂为iptg，终浓度为0.1～0.3mm。在一个优选的实施方案中，一种生产甘精胰岛素的发酵方法，包括如下步骤：a.将工程菌菌种在种子培养基中逐级放大培养：接种工程菌菌种至固体种子培养基(固体种子培养基组成为：yeastextract5g/l，tryptone10g/l，nacl10g/l，agarpowder20g/l)的斜面上，37.0℃培养12～15h，取出放冰箱2～8℃保存；挑取培养好的种子斜面菌落接种于液体种子培养基(液体种子培养基组成为：yeastextract5g/l，tryptone10g/l，nacl10g/l)中，于恒温振荡器中37.0℃培养5～8h，得一级摇瓶种子液；将培养好的一级摇瓶种子液接种于液体种子培养基中，于恒温振荡器中37.0℃培养12～15h，得二级摇瓶种子液。b.发酵罐高密度培养：基础培养基组成为：表3组分浓度(g/l)组分浓度(mg/l)yeastextract1.5～5feso4·7h2o4～12tryptone2.5～10cocl2·6h2o0.4～3glycerol10～20cuso4·5h2o0.08～0.6nh4cl1～5cacl22～9na2hpo4·12h2o25～35zncl20.2～1.5kh2po41～3h3bo30.08～0.6mgso40.2～2mnso4·h2o0.08～0.6nacl0.2～2——补料培养基组成为：tryptone80～120g/l，yeastextract40～80g/l，glycerol400～600g/l，mgso4·7h2o1～3g/l按照5％的接种量接种二级摇瓶种子液至100l发酵罐，基础培养基体积为60l，发酵罐初始通气量4±0.5m3/h，温度37.0℃，设定转速200rpm，罐压0.04～0.06mpa，发酵过程中，使用氨水自动控制ph值在7.1±0.1，温度控制在37.0±1.0℃，通过调节转速200～600rpm、空气流量0.6～5.5m3/h、氧气流量0～1m3/h、罐压0.04～0.09mpa控制溶氧不低于30％。当溶氧上升至90％且ph同时上升时，开始第一次流加补料培养基，控制流速每5～6h流加总补料量的30～35％4.5～5.25l，暂停补料后，ph和溶氧值会短暂上升。当培养至od600＝50～60时，加入终浓度0.2mm的诱导剂iptg进行诱导。随后开始第二次流加补料培养基，控制流速每15～18h流加总补料量的65～70％9.75～10.5l，补料流加完毕发酵结束，发酵培养25～38h。本发明的有益效果：本发明通过优化基础培养基与补料培养基组成、控制补加补料培养基的流速与补料量，使得重组大肠杆菌发酵生产的甘精胰岛素发酵密度可达od600＝146，包涵体产量986g/罐以上，与低密度发酵相比菌密度和产量均提高了5倍以上。培养基碳源使用甘油替代葡萄糖并通过调控补料速度明显降低乙酸的产生，氨水用量减少，更有利于发酵的高密度高表达。发酵结束，质粒丢失率在10％以内，电泳表达量在34％以上。本发明的甘精胰岛素高密度发酵提高了生产效率，具有很好的应用前景。具体实施方式虽然本发明己以较佳实施例公开如下，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的推演与替换。本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围。即在此范围内的等同替换改进，同比例放大或缩小试验也在本发明的保护范围之内。以下实施方式所用的菌种参照专利cn1663960b构建。发酵过程中所需试剂无特殊说明均可来自商业途径(市售可得)。实施例1a、将工程菌菌种在种子培养基中逐级放大培养固体种子培养基组成为：yeastextract5g/l，tryptone10g/l，nacl10g/l，agarpowder20g/l；液体种子培养基组成为：yeastextract5g/l，tryptone10g/l，nacl10g/l；接种工程菌菌种至固体种子培养基的斜面上，37.0℃培养12～15h，取出放冰箱2～8℃保存；挑取培养好的种子斜面菌落接种于液体种子培养基中，于恒温振荡器中37.0℃培养5～8h，得一级摇瓶种子液；将培养好的一级摇瓶种子液接种于液体种子培养基中，于恒温振荡器中37.0℃培养12～15h，得二级摇瓶种子液。b、发酵罐高密度培养基础培养基组成为：表4组分浓度(g/l)组分浓度(mg/l)yeastextract3feso4·7h2o7.5tryptone5cocl2·6h2o1.5glycerol15cuso4·5h2o0.25nh4cl2cacl25na2hpo4·12h2o30zncl20.75kh2po42h3bo30.2mgso41mnso4·h2o0.25nacl1——补料培养基组成为：tryptone100g/l，yeastextract60g/l，glycerol500g/l，mgso4·7h2o2g/l。按照5％的接种量接种二级摇瓶种子液至100l发酵罐中，基础培养基体积为60l，发酵罐初始通气量4±0.5m3/h，温度37.0℃，设定转速200rpm，罐压0.04～0.06mpa，发酵过程中，使用氨水自动控制ph值在7.1±0.1，温度控制在37.0±1.0℃，通过调节转速200～600rpm、空气流量0.6～5.5m3/h、氧气流量0～1m3/h、罐压0.04～0.09mpa控制溶氧不低于30％。溶氧上升至90％且ph同时上升时，开始第一次流加补料培养基，控制流速每6h流加总补料量的30％4.5l，暂停补料后，ph和溶氧值会短暂上升，加入终浓度0.2mm的诱导剂iptg进行诱导。随后开始第二次流加补料培养基，控制流速每16h流加总补料量的70％10.5l，补料流加完毕发酵结束，发酵培养30h。取发酵液检测菌体密度、包涵体产量等。实施例2a、将工程菌菌种在种子培养基中逐级放大培养固体种子培养基组成为：yeastextract5g/l，tryptone10g/l，nacl10g/l，agarpowder20g/l；液体种子培养基组成为：yeastextract5g/l，tryptone10g/l，nacl10g/l；接种工程菌菌种至固体种子培养基的斜面上，37.0℃培养12～15h，取出放冰箱2～8℃保存；挑取培养好的种子斜面菌落接种于液体种子培养基中，于恒温振荡器中37.0℃培养5～8h，得一级摇瓶种子液；将培养好的一级摇瓶种子液接种于液体种子培养基中，于恒温振荡器中37.0℃培养12～15h，得二级摇瓶种子液。b、发酵罐高密度培养基础培养基组成为：表5组分浓度(g/l)组分浓度(mg/l)yeastextract2feso4·7h2o5tryptone4cocl2·6h2o0.5glycerol12cuso4·5h2o0.1nh4cl3cacl22.5na2hpo4·12h2o28zncl20.25kh2po42h3bo30.1mgso40.5mnso4·h2o0.1nacl0.5——补料培养基组成为：tryptone100g/l，yeastextract60g/l，glycerol500g/l，mgso4·7h2o2g/l。按照5％的接种量接种二级摇瓶种子液至100l发酵罐中，基础培养基体积为60l，发酵罐初始通气量4±0.5m3/h，温度37.0℃，设定转速200rpm，罐压0.04～0.06mpa，发酵过程中，使用氨水自动控制ph值在7.1±0.1，温度控制在37.0±1.0℃，通过调节转速200～600rpm、空气流量0.6～5.5m3/h、氧气流量0～1m3/h、罐压0.04～0.09mpa控制溶氧不低于30％。溶氧上升至90％且ph同时上升时，开始第一次流加补料培养基，控制流速每7h流加总补料量的30％4.8l，暂停补料后，ph和溶氧值会短暂上升，加入终浓度0.2mm的诱导剂iptg进行诱导。随后开始第二次流加补料培养基，控制流速每17h流加总补料量的70％11.2l，补料流加完毕发酵结束，发酵培养32h。取发酵液检测菌体密度、包涵体产量等。实施例3a、将工程菌菌种在种子培养基中逐级放大培养固体种子培养基组成为：yeastextract5g/l，tryptone10g/l，nacl10g/l，agarpowder20g/l；液体种子培养基组成为：yeastextract5g/l，tryptone10g/l，nacl10g/l；接种工程菌菌种至固体种子培养基的斜面上，37.0℃培养12～15h，取出放冰箱2～8℃保存；挑取培养好的种子斜面菌落接种于液体种子培养基中，于恒温振荡器中37.0℃培养5～8h，得一级摇瓶种子液；将培养好的一级摇瓶种子液接种于液体种子培养基中，于恒温振荡器中37.0℃培养12～15h，得二级摇瓶种子液。b、发酵罐高密度培养基础培养基组成为：表6补料培养基组成为：tryptone100g/l，yeastextract60g/l，glycerol500g/l，mgso4·7h2o2g/l。按照5％的接种量接种二级摇瓶种子液至100l发酵罐中，基础培养基体积为60l，发酵罐初始通气量4±0.5m3/h，温度37.0℃，设定转速200rpm，罐压0.04～0.06mpa，发酵过程中，使用氨水自动控制ph值在7.1±0.1，温度控制在37.0±1.0℃，通过调节转速200～600rpm、空气流量0.6～5.5m3/h、氧气流量0～1m3/h、罐压0.04～0.09mpa控制溶氧不低于30％。溶氧上升至90％且ph同时上升时，开始第一次流加补料培养基，控制流速每7h流加总补料量的30％4.8l，暂停补料后，ph和溶氧值会短暂上升，加入终浓度0.2mm的诱导剂iptg进行诱导。随后开始第二次流加补料培养基，控制流速每17h流加总补料量的70％11.2l，补料流加完毕发酵结束，发酵培养32h。取发酵液检测菌体密度、包涵体产量等。实施例4a、将工程菌菌种在种子培养基中逐级放大培养固体种子培养基组成为：yeastextract5g/l，tryptone10g/l，nacl10g/l，agarpowder20g/l；液体种子培养基组成为：yeastextract5g/l，tryptone10g/l，nacl10g/l；接种工程菌菌种至固体种子培养基的斜面上，37.0℃培养12～15h，取出放冰箱2～8℃保存；挑取培养好的种子斜面菌落接种于液体种子培养基中，于恒温振荡器中37.0℃培养5～8h，得一级摇瓶种子液；将培养好的一级摇瓶种子液接种于液体种子培养基中，于恒温振荡器中37.0℃培养12～15h，得二级摇瓶种子液。b、发酵罐高密度培养基础培养基组成为：表7补料培养基组成为：tryptone120g/l，yeastextract80g/l，glycerol600g/l，mgso4·7h2o1g/l。按照10％的接种量接种二级摇瓶种子液至100l发酵罐中，基础培养基体积为60l，发酵罐初始通气量4±0.5m3/h，温度37.0℃，设定转速200rpm，罐压0.04～0.06mpa，发酵过程中，使用氨水自动控制ph值在7.1±0.1，温度控制在37.0±1.0℃，通过调节转速200～600rpm、空气流量0.6～5.5m3/h、氧气流量0～1m3/h、罐压0.04～0.09mpa控制溶氧不低于30％。溶氧上升至90％且ph同时上升时，开始第一次流加补料培养基，控制流速每7h流加总补料量的35％5.67l，暂停补料后，ph和溶氧值会短暂上升，加入终浓度0.2mm的诱导剂iptg进行诱导。随后开始第二次流加补料培养基，控制流速每16h流加总补料量的65％10.53l，补料流加完毕发酵结束，发酵培养30h。取发酵液检测菌体密度、包涵体产量等。实施例5a、将工程菌菌种在种子培养基中逐级放大培养固体种子培养基组成为：yeastextract5g/l，tryptone10g/l，nacl10g/l，agarpowder20g/l；液体种子培养基组成为：yeastextract5g/l，tryptone10g/l，nacl10g/l；接种工程菌菌种至固体种子培养基的斜面上，37.0℃培养12～15h，取出放冰箱2～8℃保存；挑取培养好的种子斜面菌落接种于液体种子培养基中，于恒温振荡器中37.0℃培养5～8h，得一级摇瓶种子液；将培养好的一级摇瓶种子液接种于液体种子培养基中，于恒温振荡器中37.0℃培养12～15h，得二级摇瓶种子液。b、发酵罐高密度培养基础培养基组成为：表8补料培养基组成为：tryptone80g/l，yeastextract40g/l，glycerol400g/l，mgso4·7h2o3g/l。按照7％的接种量接种二级摇瓶种子液至100l发酵罐中，基础培养基体积为60l，发酵罐初始通气量4±0.5m3/h，温度37.0℃，设定转速200rpm，罐压0.04～0.06mpa，发酵过程中，使用氨水自动控制ph值在7.1±0.1，温度控制在37.0±1.0℃，通过调节转速200～600rpm、空气流量0.6～5.5m3/h、氧气流量0～1m3/h、罐压0.04～0.09mpa控制溶氧不低于30％。溶氧上升至90％且ph同时上升时，开始第一次流加补料培养基，控制流速每6h流加总补料量的30％4.14l，暂停补料后，ph和溶氧值会短暂上升，加入终浓度0.2mm的诱导剂iptg进行诱导。随后开始第二次流加补料培养基，控制流速每17h流加总补料量的70％9.66l，补料流加完毕发酵结束，发酵培养32h。取发酵液检测菌体密度、包涵体产量等。实施例6a、将工程菌菌种在种子培养基中逐级放大培养固体种子培养基组成为：yeastextract5g/l，tryptone10g/l，nacl10g/l，agarpowder20g/l；液体种子培养基组成为：yeastextract5g/l，tryptone10g/l，nacl10g/l；接种工程菌菌种至固体种子培养基的斜面上，37.0℃培养12～15h，取出放冰箱2～8℃保存；挑取培养好的种子斜面菌落接种于液体种子培养基中，于恒温振荡器中37.0℃培养5～8h，得一级摇瓶种子液；将培养好的一级摇瓶种子液接种于液体种子培养基中，于恒温振荡器中37.0℃培养12～15h，得二级摇瓶种子液。b、发酵罐高密度培养基础培养基组成为：表9补料培养基组成为：tryptone100g/l，yeastextract60g/l，glycerol500g/l，mgso4·7h2o2g/l。按照5％的接种量接种二级摇瓶种子液至100l发酵罐中，基础培养基体积为60l，发酵罐初始通气量4±0.5m3/h，温度37.0℃，设定转速200rpm，罐压0.04～0.06mpa，发酵过程中，使用氨水自动控制ph值在7.1±0.1，温度控制在37.0±1.0℃，通过调节转速200～600rpm、空气流量0.6～5.5m3/h、氧气流量0～1m3/h、罐压0.04～0.09mpa控制溶氧不低于30％。溶氧上升至90％且ph同时上升时，开始第一次流加补料培养基，控制流速每6h流加总补料量的30％4.5l，暂停补料后，ph和溶氧值会短暂上升，加入终浓度0.2mm的诱导剂iptg进行诱导。随后开始第二次流加补料培养基，控制流速每18h流加总补料量的70％10.5l，补料流加完毕发酵结束，发酵培养31h。取发酵液检测菌体密度、包涵体产量等。实施例7a、将工程菌菌种在种子培养基中逐级放大培养固体种子培养基组成为：yeastextract5g/l，tryptone10g/l，nacl10g/l，agarpowder20g/l；液体种子培养基组成为：yeastextract5g/l，tryptone10g/l，nacl10g/l；接种工程菌菌种至固体种子培养基的斜面上，37.0℃培养12～15h，取出放冰箱2～8℃保存；挑取培养好的种子斜面菌落接种于液体种子培养基中，于恒温振荡器中37.0℃培养5～8h，得一级摇瓶种子液；将培养好的一级摇瓶种子液接种于液体种子培养基中，于恒温振荡器中37.0℃培养12～15h，得二级摇瓶种子液。b、发酵罐高密度培养基础培养基组成为：表10组分浓度(g/l)组分浓度(mg/l)yeastextract10feso4·7h2o15tryptone15cocl2·6h2o5glycerol25cuso4·5h2o1nh4cl10cacl215na2hpo4·12h2o40zncl22.5kh2po45h3bo31.2mgso43mnso4·h2o1.5nacl5——补料培养基组成为：tryptone100g/l，yeastextract60g/l，glycerol500g/l，mgso4·7h2o2g/l。按照5％的接种量接种二级摇瓶种子液至100l发酵罐中，基础培养基体积为60l，发酵罐初始通气量4±0.5m3/h，温度37.0℃，设定转速200rpm，罐压0.04～0.06mpa，发酵过程中，使用氨水自动控制ph值在7.1±0.1，温度控制在37.0±1.0℃，通过调节转速200～600rpm、空气流量0.6～5.5m3/h、氧气流量0～1m3/h、罐压0.04～0.09mpa控制溶氧不低于30％。溶氧上升至90％且ph同时上升时，开始第一次流加补料培养基，控制流速每7h流加总补料量的30％4.5l，暂停补料后，ph和溶氧值会短暂上升，加入终浓度0.2mm的诱导剂iptg进行诱导。随后开始第二次流加补料培养基，控制流速每16h流加总补料量的70％10.5l，补料流加完毕发酵结束。发酵培养30h。取发酵液检测菌体密度、包涵体产量等。实施例8a、将工程菌菌种在种子培养基中逐级放大培养固体种子培养基组成为：yeastextract5g/l，tryptone10g/l，nacl10g/l，agarpowder20g/l；液体种子培养基组成为：yeastextract5g/l，tryptone10g/l，nacl10g/l；接种工程菌菌种至固体种子培养基的斜面上，37.0℃培养12～15h，取出放冰箱2～8℃保存；挑取培养好的种子斜面菌落接种于液体种子培养基中，于恒温振荡器中37.0℃培养5～8h，得一级摇瓶种子液；将培养好的一级摇瓶种子液接种于液体种子培养基中，于恒温振荡器中37.0℃培养12～15h，得二级摇瓶种子液。b、发酵罐高密度培养基础培养基组成为：表11组分浓度(g/l)组分浓度(mg/l)yeastextract3feso4·7h2o7.5tryptone5cocl2·6h2o1.5glycerol15cuso4·5h2o0.25nh4cl2cacl25na2hpo4·12h2o30zncl20.75kh2po42h3bo30.2mgso41mnso4·h2o0.25nacl1——补料培养基组成为：tryptone60g/l，yeastextract20g/l，glycerol300g/l，mgso4·7h2o1g/l。按照7％的接种量接种二级摇瓶种子液至100l发酵罐中，基础培养基体积为60l，发酵罐初始通气量4±0.5m3/h，温度37.0℃，设定转速200rpm，罐压0.04～0.06mpa，发酵过程中，使用氨水自动控制ph值在7.1±0.1，温度控制在37.0±1.0℃，通过调节转速200～600rpm、空气流量0.6～5.5m3/h、氧气流量0～1m3/h、罐压0.04～0.09mpa控制溶氧不低于30％。溶氧上升至90％且ph同时上升时，开始第一次流加补料培养基，控制流速每7h流加总补料量的30％4.5l，暂停补料后，ph和溶氧值会短暂上升，加入终浓度0.2mm的诱导剂iptg进行诱导。随后开始第二次流加补料培养基，控制流速每16h流加总补料量的70％10.5l，补料流加完毕发酵结束，发酵培养31h。取发酵液检测菌体密度、包涵体产量等。实施例9a、将工程菌菌种在种子培养基中逐级放大培养固体种子培养基组成为：yeastextract9g/l，tryptone5g/l，nacl6g/l，agarpowder15g/l；液体种子培养基组成为：glucose5g/l，kh2po43g/l，k2hpo45g/l，yeastextract12g/l，nacl6g/l；将菌株在固体种子培养基上培养，35℃培养24h，得到斜面菌种。用接种针将斜面的菌种刮下，转接到装有液体种子培养基的三角瓶(0.07mpa10min)中，于37℃往复式摇床振动培养18小时，得到液体种子。b、发酵罐高密度培养基础培养基组成为：表12组分浓度(g/l)组分浓度(mg/l)yeastextract3feso4·7h2o7.5tryptone5cocl2·6h2o1.5glycerol15cuso4·5h2o0.25nh4cl2cacl25na2hpo4·12h2o30zncl20.75kh2po42h3bo30.2mgso41mnso4·h2o0.25nacl1——补料培养基组成为：tryptone150g/l，yeastextract100g/l，glycerol700g/l，mgso4·7h2o5g/l。按照5％的接种量接种种子液至100l发酵罐中，基础培养基体积为60l，发酵罐初始通气量4±0.5m3/h，温度37.0℃，设定转速200rpm，罐压0.04～0.06mpa，发酵过程中，使用氨水自动控制ph值在7.1±0.1，温度控制在37.0±1.0℃，通过调节转速200～600rpm、空气流量0.6～5.5m3/h、氧气流量0～1m3/h、罐压0.04～0.09mpa控制溶氧不低于30％。溶氧上升至90％且ph同时上升时，开始第一次流加补料培养基，控制流速每7h流加总补料量的30％4.2l，暂停补料后，ph和溶氧值会短暂上升，加入终浓度0.2mm的诱导剂iptg进行诱导。随后开始第二次流加补料培养基，控制流速每17h流加总补料量的70％9.8l，补料流加完毕发酵结束，发酵培养28h。取发酵液检测菌体密度、包涵体产量等。实施例10a、将工程菌菌种在种子培养基中逐级放大培养固体种子培养基组成为：yeastextract5g/l，tryptone10g/l，nacl10g/l，agarpowder20g/l；液体种子培养基组成为：yeastextract5g/l，tryptone10g/l，nacl10g/l；接种工程菌菌种至固体种子培养基的斜面上，37.0℃培养12～15h，取出放冰箱2～8℃保存；挑取培养好的种子斜面菌落接种于液体种子培养基中，于恒温振荡器中37.0℃培养5～8h，得一级摇瓶种子液；将培养好的一级摇瓶种子液接种于液体种子培养基中，于恒温振荡器中37.0℃培养12～15h，得二级摇瓶种子液。b、发酵罐高密度培养基础培养基组成为：表13组分浓度(g/l)组分浓度(mg/l)yeastextract3feso4·7h2o7.5tryptone5cocl2·6h2o1.5glycerol15cuso4·5h2o0.25nh4cl2cacl25na2hpo4·12h2o30zncl20.75kh2po42h3bo30.2mgso41mnso4·h2o0.25nacl1——补料培养基组成为：tryptone100g/l，yeastextract60g/l，glycerol500g/l，mgso4·7h2o3g/l。按照7％的接种量接种二级摇瓶种子液至100l发酵罐中，基础培养基体积为60l，发酵罐初始通气量4±0.5m3/h，温度37.0℃，设定转速200rpm，罐压0.04～0.06mpa，发酵过程中，使用氨水自动控制ph值在7.1±0.1，温度控制在37.0±1.0℃，通过调节转速200～600rpm、空气流量0.6～5.5m3/h、氧气流量0～1m3/h、罐压0.04～0.09mpa控制溶氧不低于30％。溶氧上升至90％且ph同时上升时，开始第一次流加补料培养基，控制流速每5h流加总补料量的30％4.5l，暂停补料后，ph和溶氧值会短暂上升，加入终浓度0.2mm的诱导剂iptg进行诱导。随后开始第二次流加补料培养基，控制流速每18h流加总补料量的70％10.5l，补料流加完毕发酵结束，发酵培养33h。取发酵液检测菌体密度、包涵体产量等。实施例11a、将工程菌菌种在种子培养基中逐级放大培养固体种子培养基组成为：yeastextract9g/l，tryptone5g/l，nacl6g/l，agarpowder15g/l；液体种子培养基组成为：glucose5g/l，kh2po43g/l，k2hpo45g/l，yeastextract12g/l，nacl6g/l；将菌株在固体种子培养基上培养，35℃培养24h，得到斜面菌种。用接种针将斜面的菌种刮下，转接到装有液体种子培养基的三角瓶(0.07mpa10min)中，于37℃往复式摇床振动培养18小时，得到液体种子。b、发酵罐高密度培养基础培养基组成为：表14组分浓度(g/l)组分浓度(mg/l)yeastextract3feso4·7h2o7.5tryptone5cocl2·6h2o1.5glycerol15cuso4·5h2o0.25nh4cl2cacl25na2hpo4·12h2o30zncl20.75kh2po42h3bo30.2mgso41mnso4·h2o0.25nacl1——补料培养基组成为：tryptone100g/l，yeastextract60g/l，glycerol500g/l，mgso4·7h2o2g/l。按照5％的接种量接种种子液至100l发酵罐中，基础培养基体积为60l，发酵罐初始通气量4±0.5m3/h，温度37.0℃，设定转速200rpm，罐压0.04～0.06mpa，发酵过程中，使用氨水自动控制ph值在7.1±0.1，温度控制在37.0±1.0℃，通过调节转速200～600rpm、空气流量0.6～5.5m3/h、氧气流量0～1m3/h、罐压0.04～0.09mpa控制溶氧不低于30％。溶氧上升至90％且ph同时上升时，开始第一次流加补料培养基，控制流速每8h流加总补料量的35％4.5l，暂停补料后，ph和溶氧值会短暂上升，加入终浓度0.2mm的诱导剂iptg进行诱导。随后开始第二次流加补料培养基，控制流速每15h流加总补料量的65％10.5l，补料流加完毕发酵结束，发酵培养28h。取发酵液检测菌体密度、包涵体产量等。实施例12a、将工程菌菌种在种子培养基中逐级放大培养固体种子培养基组成为：yeastextract5g/l，tryptone10g/l，nacl10g/l，agarpowder20g/l；液体种子培养基组成为：yeastextract5g/l，tryptone10g/l，nacl10g/l；接种工程菌菌种至固体种子培养基的斜面上，37.0℃培养12～15h，取出放冰箱2～8℃保存；挑取培养好的种子斜面菌落接种于液体种子培养基中，于恒温振荡器中37.0℃培养5～8h，得一级摇瓶种子液；将培养好的一级摇瓶种子液接种于液体种子培养基中，于恒温振荡器中37.0℃培养12～15h，得二级摇瓶种子液。b、发酵罐高密度培养基础培养基组成为：表15组分浓度(g/l)组分浓度(mg/l)yeastextract3feso4·7h2o7.5tryptone5cocl2·6h2o1.5glycerol15cuso4·5h2o0.25nh4cl2cacl25na2hpo4·12h2o30zncl20.75kh2po42h3bo30.2mgso41mnso4·h2o0.25nacl1——补料培养基组成为：tryptone100g/l，yeastextract60g/l，glycerol500g/l，mgso4·7h2o2g/l。按照5％的接种量接种二级摇瓶种子液至100l发酵罐中，基础培养基体积为60l，发酵罐初始通气量4±0.5m3/h，温度37.0℃，设定转速200rpm，罐压0.04～0.06mpa，发酵过程中，使用氨水自动控制ph值在7.1±0.1，温度控制在37.0±1.0℃，通过调节转速200～600rpm、空气流量0.6～5.5m3/h、氧气流量0～1m3/h、罐压0.04～0.09mpa控制溶氧不低于30％。溶氧上升至90％且ph同时上升时，开始第一次流加补料培养基，控制流速每3h流加总补料量的30％4.5l，暂停补料后，ph和溶氧值会短暂上升，加入终浓度0.2mm的诱导剂iptg进行诱导。随后开始第二次流加补料培养基，控制流速每14h流加总补料量的70％10.5l，补料流加完毕发酵结束，发酵培养25h。取发酵液检测菌体密度、包涵体产量等。实施例13a、将工程菌菌种在种子培养基中逐级放大培养固体种子培养基组成为：yeastextract5g/l，tryptone10g/l，nacl10g/l，agarpowder20g/l；液体种子培养基组成为：yeastextract5g/l，tryptone10g/l，nacl10g/l；接种工程菌菌种至固体种子培养基的斜面上，37.0℃培养12～15h，取出放冰箱2～8℃保存；挑取培养好的种子斜面菌落接种于液体种子培养基中，于恒温振荡器中37.0℃培养5～8h，得一级摇瓶种子液；将培养好的一级摇瓶种子液接种于液体种子培养基中，于恒温振荡器中37.0℃培养12～15h，得二级摇瓶种子液。b、发酵罐高密度培养基础培养基组成为：表16组分浓度(g/l)组分浓度(mg/l)yeastextract3feso4·7h2o7.5tryptone5cocl2·6h2o1.5glycerol15cuso4·5h2o0.25nh4cl2cacl25na2hpo4·12h2o30zncl20.75kh2po42h3bo30.2mgso41mnso4·h2o0.25nacl1——补料培养基组成为：tryptone100g/l，yeastextract60g/l，glycerol500g/l，mgso4·7h2o2g/l。按照5％的接种量接种二级摇瓶种子液至100l发酵罐中，基础培养基体积为60l，发酵罐初始通气量4±0.5m3/h，温度37.0℃，设定转速200rpm，罐压0.04～0.06mpa，发酵过程中，使用氨水自动控制ph值在7.1±0.1，温度控制在37.0±1.0℃，通过调节转速200～600rpm、空气流量0.6～5.5m3/h、氧气流量0～1m3/h、罐压0.04～0.09mpa控制溶氧不低于30％。溶氧上升至90％且ph同时上升时，开始第一次流加补料培养基，控制流速每8h流加总补料量的30％4.5l，暂停补料后，ph和溶氧值会短暂上升，加入终浓度0.2mm的诱导剂iptg进行诱导。随后开始第二次流加补料培养基，控制流速每20h流加总补料量的70％10.5l，补料流加完毕发酵结束。发酵培养38h。取发酵液检测菌体密度、包涵体产量等。实施例14a、将工程菌菌种在种子培养基中逐级放大培养固体种子培养基组成为：yeastextract5g/l，tryptone10g/l，nacl10g/l，agarpowder20g/l；液体种子培养基组成为：yeastextract5g/l，tryptone10g/l，nacl10g/l；接种工程菌菌种至固体种子培养基的斜面上，37.0℃培养12～15h，取出放冰箱2～8℃保存；挑取培养好的种子斜面菌落接种于液体种子培养基中，于恒温振荡器中37.0℃培养5～8h，得一级摇瓶种子液；将培养好的一级摇瓶种子液接种于液体种子培养基中，于恒温振荡器中37.0℃培养12～15h，得二级摇瓶种子液。b、发酵罐高密度培养基础培养基组成为：表17组分浓度(g/l)组分浓度(mg/l)yeastextract3feso4·7h2o7.5tryptone5cocl2·6h2o1.5glycerol15cuso4·5h2o0.25nh4cl2cacl25na2hpo4·12h2o30zncl20.75kh2po42h3bo30.2mgso41mnso4·h2o0.25nacl1——补料培养基组成为：tryptone100g/l，yeastextract60g/l，glycerol500g/l，mgso4·7h2o2g/l。按照5％的接种量接种二级摇瓶种子液至100l发酵罐中，基础培养基体积为60l，发酵罐初始通气量4±0.5m3/h，温度37.0℃，设定转速200rpm，罐压0.04～0.06mpa，发酵过程中，使用氨水自动控制ph值在7.1±0.1，温度控制在37.0±1.0℃，通过调节转速200～600rpm、空气流量0.6～5.5m3/h、氧气流量0～1m3/h、罐压0.04～0.09mpa控制溶氧不低于30％。溶氧上升至90％且ph同时上升时，开始第一次流加补料培养基，控制流速每6h流加总补料量的40％6l，暂停补料后，ph和溶氧值会短暂上升，加入终浓度0.2mm的诱导剂iptg进行诱导。随后开始第二次流加补料培养基，控制流速每16h流加总补料量的60％9l，补料流加完毕发酵结束，发酵培养30h。取发酵液检测菌体密度、包涵体产量等。实施例15a、将工程菌菌种在种子培养基中逐级放大培养固体种子培养基组成为：yeastextract5g/l，tryptone10g/l，nacl10g/l，agarpowder20g/l；液体种子培养基组成为：yeastextract5g/l，tryptone10g/l，nacl10g/l；接种工程菌菌种至固体种子培养基的斜面上，37.0℃培养12～15h，取出放冰箱2～8℃保存；挑取培养好的种子斜面菌落接种于液体种子培养基中，于恒温振荡器中37.0℃培养5～8h，得一级摇瓶种子液；将培养好的一级摇瓶种子液接种于液体种子培养基中，于恒温振荡器中37.0℃培养12～15h，得二级摇瓶种子液。b、发酵罐高密度培养基础培养基组成为：表18组分浓度(g/l)组分浓度(mg/l)yeastextract3feso4·7h2o7.5tryptone5cocl2·6h2o1.5glycerol15cuso4·5h2o0.25nh4cl2cacl25na2hpo4·12h2o30zncl20.75kh2po42h3bo30.2mgso41mnso4·h2o0.25nacl1——补料培养基组成为：tryptone100g/l，yeastextract60g/l，glycerol500g/l，mgso4·7h2o2g/l。按照5％的接种量接种二级摇瓶种子液至100l发酵罐中，基础培养基体积为60l，发酵罐初始通气量4±0.5m3/h，温度37.0℃，设定转速200rpm，罐压0.04～0.06mpa，发酵过程中，使用氨水自动控制ph值在7.1±0.1，温度控制在37.0±1.0℃，通过调节转速200～600rpm、空气流量0.6～5.5m3/h、氧气流量0～1m3/h、罐压0.04～0.09mpa控制溶氧不低于30％。溶氧上升至90％且ph同时上升时，开始第一次流加补料培养基，控制流速每6h流加总补料量的20％3.0l，暂停补料后，ph和溶氧值会短暂上升，加入终浓度0.2mm的诱导剂iptg进行诱导。随后开始第二次流加补料培养基，控制流速每16h流加总补料量的80％12.0l，补料流加完毕发酵结束，发酵培养30h。取发酵液检测菌体密度、包涵体产量等。对比实施例1a、将工程菌菌种在种子培养基中逐级放大培养固体种子培养基组成为：yeastextract5g/l，tryptone10g/l，nacl10g/l，agarpowder20g/l；液体种子培养基组成为：yeastextract5g/l，tryptone10g/l，nacl10g/l；接种工程菌菌种至固体种子培养基的斜面上，37.0℃培养12～15h，取出放冰箱2～8℃保存；挑取培养好的种子斜面菌落接种于液体种子培养基中，于恒温振荡器中37.0℃培养5～8h，得一级摇瓶种子液；将培养好的一级摇瓶种子液接种于液体种子培养基中，于恒温振荡器中37.0℃培养12～15h，得二级摇瓶种子液。b、发酵罐高密度培养基础培养基组成为：trptone10g/l，yeastextract5g/l，glucose10g/l，nacl10g/l。补料培养基组成为：tryptone100g/l，yeastextract60g/l，glycerol600g/l。按照5％的接种量接种二级摇瓶种子液至100l发酵罐中，基础培养基体积为60l，发酵罐初始通气量4±0.5m3/h，温度37.0℃，设定转速200rpm，罐压0.04～0.06mpa，发酵过程中，使用氨水自动控制ph值在7.1±0.1，温度控制在37.0±1.0℃，通过调节转速200～600rpm、空气流量0.6～5.5m3/h、氧气流量0～1m3/h、罐压0.04～0.09mpa控制溶氧不低于30％。溶氧上升至90％且ph同时上升时，开始第一次流加补料培养基，控制流速每6h流加总补料量的30％4.5l，暂停补料后，ph和溶氧值会短暂上升，加入终浓度0.2mm的诱导剂iptg进行诱导。随后开始第二次流加补料培养基，控制流速每17h流加总补料量的70％10.5l，补料流加完毕发酵结束，发酵培养28h。取发酵液检测菌体密度、包涵体产量等。对比实施例2a、将工程菌菌种在种子培养基中逐级放大培养固体种子培养基组成为：yeastextract5g/l，tryptone10g/l，nacl10g/l，agarpowder20g/l；液体种子培养基组成为：yeastextract5g/l，tryptone10g/l，nacl10g/l；接种工程菌菌种至固体种子培养基的斜面上，37.0℃培养12～15h，取出放冰箱2～8℃保存；挑取培养好的种子斜面菌落接种于液体种子培养基中，于恒温振荡器中37.0℃培养5～8h，得一级摇瓶种子液；将培养好的一级摇瓶种子液接种于液体种子培养基中，于恒温振荡器中37.0℃培养12～15h，得二级摇瓶种子液。b、发酵罐高密度培养基础培养基组成为：表19组分浓度(g/l)组分浓度(mg/l)yeastextract3feso4·7h2o7.5tryptone5cocl2·6h2o1.5glucose15cuso4·5h2o0.25nh4cl2cacl25na2hpo4·12h2o30zncl20.75kh2po42h3bo30.2mgso41mnso4·h2o0.25nacl1——补料培养基组成为：tryptone100g/l，yeastextract60g/l，glucose600g/l，mgso4·7h2o2g/l。按照5％的接种量接种二级摇瓶种子液至100l发酵罐中，基础培养基体积为60l，发酵罐初始通气量4±0.5m3/h，温度37.0℃，设定转速200rpm，罐压0.04～0.06mpa，发酵过程中，使用氨水自动控制ph值在7.1±0.1，温度控制在37.0±1.0℃，通过调节转速200～600rpm、空气流量0.6～5.5m3/h、氧气流量0～1m3/h、罐压0.04～0.09mpa控制溶氧不低于30％。溶氧上升且ph同时上升时，开始第一次流加补料培养基，控制流速每6h流加总补料量的30％4.5l，暂停补料后，ph和溶氧值会短暂上升，加入终浓度0.2mm的诱导剂iptg进行诱导。随后开始第二次流加补料培养基，控制流速每15h流加总补料量的70％10.5l，补料流加完毕发酵结束，发酵培养24h。取发酵液检测菌体密度、包涵体产量等。对比实施例3a、将工程菌菌种在种子培养基中逐级放大培养固体种子培养基组成为：yeastextract5g/l，tryptone10g/l，nacl10g/l，agarpowder20g/l；液体种子培养基组成为：yeastextract5g/l，tryptone10g/l，nacl10g/l；接种工程菌菌种至固体种子培养基的斜面上，37.0℃培养12～15h，取出放冰箱2～8℃保存；挑取培养好的种子斜面菌落接种于液体种子培养基中，于恒温振荡器中37.0℃培养5～8h，得一级摇瓶种子液；将培养好的一级摇瓶种子液接种于液体种子培养基中，于恒温振荡器中37.0℃培养12～15h，得二级摇瓶种子液。b、发酵罐高密度培养基础培养基组成为：表20组分浓度(g/l)组分浓度(g/l)yeastextract3na2hpo4·12h2o30tryptone5kh2po42glycerol15mgso41nh4cl2nacl1补料培养基组成为：tryptone100g/l，yeastextract60g/l，glycerol500g/l，mgso4·7h2o2g/l。按照5％的接种量接种二级摇瓶种子液至100l发酵罐中，基础培养基体积为60l，发酵罐初始通气量4±0.5m3/h，温度37.0℃，设定转速200rpm，罐压0.04～0.06mpa，发酵过程中，使用氨水自动控制ph值在7.1±0.1，温度控制在37.0±1.0℃，通过调节转速200～600rpm、空气流量0.6～5.5m3/h、氧气流量0～1m3/h、罐压0.04～0.09mpa控制溶氧不低于30％。溶氧上升且ph同时上升时，开始第一次流加补料培养基，控制流速每6h流加总补料量的30％4.5l，暂停补料后，ph和溶氧值会短暂上升。当培养至od600＝50～60时，加入终浓度0.2mm的诱导剂iptg进行诱导。随后开始第二次流加补料培养基，控制流速每16h流加总补料量的70％10.5l，补料流加完毕发酵结束，发酵培养30h。取发酵液检测菌体密度、包涵体产量等。对比实施例4a、将工程菌菌种在种子培养基中逐级放大培养固体种子培养基组成为：yeastextract9g/l，tryptone5g/l，nacl6g/l，agarpowder15g/l；液体种子培养基组成为：yeastextract9g/l，tryptone5g/l，nacl6g/l；接种工程菌菌种至固体种子培养基的斜面上，37.0℃培养12～15h，取出放冰箱2～8℃保存；挑取培养好的种子斜面菌落接种于液体种子培养基中，于恒温振荡器中37.0℃培养5～8h，得一级摇瓶种子液；将培养好的一级摇瓶种子液接种于液体种子培养基中，于恒温振荡器中37.0℃培养12～15h，得二级摇瓶种子液。b、发酵罐高密度培养基础培养基组成为：表21组分浓度(g/l)组分浓度(mg/l)葡萄糖12钼酸铵0.8甘油2硫酸铜0.5酵母提取物13硼酸2柠檬酸5碘化钾0.4硫酸铁0.05氯化锰3磷酸氢二铵5乙酸锌3磷酸二氢钾3——硫酸镁2——维生素b100.1——补料培养基组成为：tryptone100g/l，yeastextract60g/l，glycerol500g/l，mgso4·7h2o2g/l。按照5％的接种量接种二级摇瓶种子液至100l发酵罐中，基础培养基体积为60l，发酵罐初始通气量4±0.5m3/h，温度37.0℃，设定转速200rpm，罐压0.04～0.06mpa，发酵过程中，使用氨水自动控制ph值在7.1±0.1，温度控制在37.0±1.0℃，通过调节转速200～600rpm、空气流量0.6～5.5m3/h、氧气流量0～1m3/h、罐压0.04～0.09mpa控制溶氧不低于30％。溶氧上升且ph同时上升时，开始第一次流加补料培养基，控制流速每6h流加总补料量的30％4.5l，暂停补料后，ph和溶氧值会短暂上升。当培养至od600＝50～60时，加入终浓度0.2mm的诱导剂iptg进行诱导。随后开始第二次流加补料培养基，控制流速每16h流加总补料量的70％10.5l，补料流加完毕发酵结束，发酵培养30h。取发酵液检测菌体密度、包涵体产量等。对比实施例5将重组大肠杆菌菌株在固体斜面培养基(ph6.7，蛋白胨5g，酵母粉9g，氯化钠6g，琼脂15g，加自来水溶解混合至1l)上培养，35℃培养24小时，得到斜面菌种。用接种针将斜面上约1cm2的菌种刮下，转接到装有20ml液体种子培养基(ph值6.8，葡萄糖5g，磷酸二氢钾3g，磷酸氢二钾5g，氯化钠6g，酵母粉12g，加自来水溶解混合至1l)的500ml三角瓶(0.07mpa10min)中，于37℃往复式摇床(振幅65cm，摇床转速180r/m)振动培养18小时，得到液体种子。将3.0l液体种子接种入装有60l发酵培养基(将柠檬酸3g，硫酸铁0.01g，磷酸氢二铵2g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，葡萄糖8g，甘油1g，酵母提取物10g，维生素b10.05g，痕量元素钼酸铵0.5mg，硫酸铜0.1mg，硼酸1mg，碘化钾0.2mg，氯化锰1mg和乙酸锌1mg，加自来水溶解混合至1l，用5％naoh调节上述溶液的ph为6.8)的100l发酵罐中(接种前120℃灭菌8分钟)通风量(即每分钟内每单位体积发酵液通入空气的体积比)为1：0.1，37℃发酵培养，当发酵进行至13小时，停止发酵。取发酵液检测菌体密度、包涵体产量等。对比实施例6a、将工程菌菌种在种子培养基中逐级放大培养固体种子培养基组成为：yeastextract5g/l，tryptone10g/l，nacl10g/l，agarpowder20g/l；液体种子培养基组成为：yeastextract5g/l，tryptone10g/l，nacl10g/l；接种工程菌菌种至固体种子培养基的斜面上，37.0℃培养12～15h，取出放冰箱2～8℃保存；挑取培养好的种子斜面菌落接种于液体种子培养基中，于恒温振荡器中37.0℃培养5～8h，得一级摇瓶种子液；将培养好的一级摇瓶种子液接种于液体种子培养基中，于恒温振荡器中37.0℃培养12～15h，得二级摇瓶种子液。b、发酵罐高密度培养基础培养基组成为：表22组分浓度(g/l)组分浓度(mg/l)yeastextract3feso4·7h2o7.5tryptone5cocl2·6h2o1.5glycerol15cuso4·5h2o0.25nh4cl2cacl25na2hpo4·12h2o30zncl20.75kh2po42h3bo30.2mgso41mnso4·h2o0.25nacl1——补料培养基组成为：tryptone50g/l，yeastextract30g/l，glucose300g/l，mgso4·7h2o2g/l。按照5％的接种量接种摇瓶种子液至发酵罐中，发酵罐初始通气量4±0.5m3/h，温度37.0℃，设定转速200rpm，罐压0.04～0.06mpa，发酵过程中，使用氨水自动控制ph值在7.1±0.1，温度控制在37.0±1.0℃，通过调节转速200～600rpm、空气流量0.6～5.5m3/h罐压0.04～0.09mpa控制溶氧不低于30％。当溶氧上升且ph同时上升时，加入终浓度0.2mm的诱导剂iptg进行诱导。随后开始流加补料培养基，控制流速每4～5h流加15l补料培养基至培养结束，发酵培养20h。取发酵液检测菌体密度、包涵体产量等。对比实施例7a、将工程菌菌种在种子培养基中逐级放大培养固体种子培养基组成为：yeastextract5g/l，tryptone10g/l，nacl10g/l，agarpowder20g/l；液体种子培养基组成为：yeastextract5g/l，tryptone10g/l，nacl10g/l；接种工程菌菌种至固体种子培养基的斜面上，37.0℃培养12～15h，取出放冰箱2～8℃保存；挑取培养好的种子斜面菌落接种于液体种子培养基中，于恒温振荡器中37.0℃培养5～8h，得一级摇瓶种子液；将培养好的一级摇瓶种子液接种于液体种子培养基中，于恒温振荡器中37.0℃培养12～15h，得二级摇瓶种子液。b、发酵罐高密度培养基础培养基组成为：表23组分浓度(g/l)组分浓度(mg/l)yeastextract3feso4·7h2o7.5tryptone5cocl2·6h2o1.5glycerol15cuso4·5h2o0.25nh4cl2cacl25na2hpo4·12h2o30zncl20.75kh2po42h3bo30.2mgso41mnso4·h2o0.25nacl1——补料培养基组成为：tryptone100g/l，yeastextract60g/l，glucose500g/l，mgso4·7h2o2g/l。按照5％的接种量接种摇瓶种子液至发酵罐中，发酵罐初始通气量4±0.5m3/h，温度37.0℃，设定转速200rpm，罐压0.04～0.06mpa，发酵过程中，使用氨水自动控制ph值在7.1±0.1，温度控制在37.0±1.0℃，通过调节转速200～600rpm、空气流量0.6～5.5m3/h罐压0.04～0.09mpa控制溶氧不低于30％。当溶氧上升且ph同时上升时，加入终浓度0.2mm的诱导剂iptg进行诱导。随后开始流加补料培养基，控制流速每16-20h流加15l补料培养基至培养结束，发酵培养26h。取发酵液检测菌体密度、包涵体产量等。实施例与对比例的测试结果见表24。表24不同培养条件测试结果当前第1页12