一种具有抗炎作用的多肽SR4及其应用的制作方法

本发明属于多肽功能研究领域，具体涉及一种干扰炎性信号通路并抑制炎性反应的多肽功能的鉴定。

背景技术：

天然免疫系统作为机体第一道免疫防线，可以通过模式识别受体(patternrecognitionreceptors,prrs)识别病原相关分子模式(pathogen-associatedmolecularpatterns,pamps)，激活核转录因子κb(nuclearfactorκb,nfκb)信号通路，诱导产生前炎性细胞因子和抗菌肽来抵抗病原微生物的入侵。toll样受体(toll-likereceptors,tlrs)是一类典型的prrs，pamp-tlr相互作用导致受体通过tir结构域二聚化或发生构象的改变，然后受体的tir结构域结合含tir结构域的适配蛋白，如myd88(myeloiddifferentiationfactor88)和trif(tirdomain-containingadaptorproteinincludinginterferon-β)，启动下游信号级联放大，引起核转录因子nf-κb的易位，导致前炎性细胞因子、活性氧中间体和共刺激分子表达量的上调。

研究表明，tir结构域的多肽能够竞争性结合胞内含tir结构域的适配蛋白，从而干扰正常的tir-tir互作，阻断tlrs-nfκb通路，进而抑制炎性细胞因子和趋化因子的分泌。4r3(tlr4-tirregion3)多肽能够显著抑制lps诱导的小鼠腹腔巨噬细胞炎性因子的分泌，tirap/mal的tir结构域的多肽能够抑制tlr2和tlr4信号通路，并且能降低小鼠体内由lps引起的炎症反应。如使用多肽来模拟myd88tir结构域的bb环，发现这种多肽能减弱小鼠体内由葡萄球菌属肠毒素b诱导的前炎性细胞因子的产生和毒性。许多感染性疾病、自身免疫病和恶性肿瘤都会引发机体产生过度炎症反应，因而靶向天然免疫应答和信号传递的药物具有潜在的医疗前景。在革兰氏阴性菌引起的败血症病人中，tlr4拮抗剂可用于预防因lps引起的内毒素性休克。tlrs拮抗剂可用于治疗自身免疫性疾病，尤其是系统性红斑狼疮(systemiclupuserythematosus,sle)。因此，靶向tlrs的治疗学方法可能会有效地抑制自身免疫疾病的发展和恶化，鉴定具有抑炎效应的小分子多肽具有潜在的医疗前景。

然而，目前报道的具有抑炎功能的多肽均来自真核细胞的受体或适配蛋白。微生物已经进化出相应的策略来抑制机体的炎性应答，细菌逃逸tlrs-nfκb信号通路的机制为未来抗炎性药物的研究提供了理论基础，筛选细菌来源的特定抑炎多肽将为炎症相关疾病的治疗提供新的药物候选。

技术实现要素：

为了克服tlrs信号通路的过度活化导致机体产生严重的炎症反应，本发明提供一种具有抗炎作用的多肽sr4及其应用。本发明鉴定一段具有抗炎功能的多肽sr4，并研究其在小鼠体内的抗炎及抗病毒效应。

为了实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：一种具有抗炎作用的多肽sr4，所述的多肽sr4的氨基酸序列为rqikiwfqnrrmkwkkvvlsksfikkdwteye(seqidno.1)。

本发明还提供前述的sr4多肽抑制小鼠腹腔巨噬细胞炎性细胞因子的产生方法，该方法使用实时荧光定量pcr技术鉴定sr4多肽能抑制lps诱导的炎性细胞因子il-1β和tnf-α的产生，具体步骤如下：

(1)通过序列比对分析将肠炎沙门菌tcps蛋白tir结构域分为多个区段，包括sr4；在多肽的n段引入具有细胞渗透性的antp同源域序列rqikiwfqnrrmkwkk以形成多肽sr4；

(2)小鼠腹腔巨噬细胞的获取；

(3)实时荧光定量pcr鉴定sr4多肽抑制lps诱导的炎性细胞因子的产生。

本发明的又一个目的为提供包含前述的多肽sr4的药物组合物以及在制备抗炎药物或抗流感病毒药物中的用途。

本发明还提供前述的多肽sr4在制备抗炎药物或抗流感病毒药物中的用途。所述抗炎药物具体是指干扰tlr信号通路并抑制炎性细胞因子分泌的药物。

相对于现有技术，本发明将tcps蛋白(ncbi序列号：aiy53972.1)的tir结构域分成多个区段，通过抑炎效果和细胞活性两方面进行综合选择；目前的tcps蛋白通过真核表达质粒转染细胞来表达，且原核表达系统是以包涵体表达(没有可溶蛋白)，制备过程较为复杂。相对于tcps蛋白，本发明的sr4多肽易于获得(32个氨基酸的短肽，其化学合成和质量控制技术成熟，纯度高，工艺简单，省时，成本低)；sr4多肽作用位点更为单一，分子量小，无抗原性，副作用少，安全性高；sr4多肽的n端引入了具有细胞渗透性的antp同源域序列，易于吸收，作用迅速高效。

附图说明

图1为tcpstir结构域的不同多肽区段。其中，sr1-sr6为tcpstir结构域的不同肽段，cp为随机多肽序列。此外，每段多肽的n段引入具有细胞渗透性的antp同源域序列rqikiwfqnrrmkwkk分别形成sr1、sr2、sr3、sr4、sr5、sr6和cp，以加强多肽进入细胞的能力。

图2为不同sr多肽体外抑制lps诱导的炎性细胞因子的产生。其中，不同多肽(40μm)分别作用小鼠腹腔巨噬细胞，30min后，以10ng/mllps刺激，刺激1h后trizol裂解，提取rna，qrt-pcr检测炎性细胞因子il-1β(图2a)和tnf-α(图2b)的表达水平，其中内参为β-actin。

图3为mtt实验评价各多肽对细胞活性的影响。其中，将不同多肽(40μm)分别作用小鼠腹腔巨噬细胞，通过mtt实验检测细胞的生物活性。

图4为sr4多肽体内抑制lps诱导的炎性细胞因子的分泌。其中，sr4多肽腹腔注射c57bl/6小鼠(10nmol/g)，1h后再使用亚致死剂量的lps攻毒(1μg/g)，4h后elisa检测血液中的炎性细胞因子il-6(图4a)、il-12p40(图4b)和tnf-α(图4c)的分泌水平。

图5为sr4多肽保护小鼠抵抗流感病毒的感染。其中，以h1n1js38流感病毒滴鼻感染c57bl/6小鼠，感染后第2天至第4天每天均腹腔注射sr4多肽(10nmol/g)，每天对小鼠的体重进行监测。

具体实施方式

以下实施例中进一步定义本发明，根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种修改和改变，以使其使用各种用途和条件。除特殊注明外，本发明所采用的均为该领域现有技术。

实施例1

sr4多肽抑制小鼠腹腔巨噬细胞炎性细胞因子的产生，该方法使用实时荧光定量pcr技术鉴定sr4多肽能显著抑制lps诱导的炎性细胞因子il-1β的产生，具体步骤如下：

(1)肠炎沙门菌tcps蛋白可干扰tlrs信号通路，抑制炎性细胞因子的产生，从而逃逸宿主的天然免疫系统。通过序列比对分析将tcps蛋白tir结构域分为多个区段，分别为sr1、sr2、sr3、sr4、sr5和sr6，同时设置随机多肽cp作为阴性对照(图1)。此外，为加强多肽进入细胞的能力，在每段多肽的n段引入具有细胞渗透性的antp同源域序列rqikiwfqnrrmkwkk分别形成sr1、sr2、sr3、sr4、sr5、sr6和cp，各多肽纯度均≥95％。sr1的氨基酸序列为rqikiwfqnrrmkwkkteditesydvfish(seqidno.2)，sr2的氨基酸序列为rqikiwfqnrrmkwkkaellrakgin(seqidno.3)，sr3的氨基酸序列为rqikiwfqnrrmkwkkvwydefslgwgksl(seqidno.4)，sr4的氨基酸序列为rqikiwfqnrrmkwkkvvlsksfikkdwteye(seqidno.1)，sr5的氨基酸序列为rqikiwfqnrrmkwkklkfsptlvdkmal(seqidno.5)，sr6的氨基酸序列为rqikiwfqnrrmkwkkiaeqlesllk(seqidno.6)，cp的氨基酸序列为rqikiwfqnrrmkwkkslhgrgdpmeafii(seqidno.7)。

(2)小鼠腹腔巨噬细胞的获取

将小鼠安乐处死，75％酒精浸泡3min后取出小鼠，在无菌条件下用灭菌的镊子提起小鼠下腹部皮肤，用手术剪剪开一小口，完全暴露腹膜，用注射器注入10mlrpmi1640培养基，来回抽取腹腔液，不同方向冲洗数次，最后吸出腹腔液，转移至15ml离心管中。细胞悬液1000rpm离心10min，rpmi1640培养基洗涤一遍后，用含10％fbs的rpmi1640悬起细胞，即为小鼠腹腔巨噬细胞。

(3)实时荧光定量pcr鉴定sr4多肽抑制lps诱导的炎性细胞因子的产生

将小鼠腹腔巨噬细胞铺板(24孔细胞板，2×10⁵个/孔)，过夜培养后弃掉未贴壁的细胞，加入medium或不同多肽(40μm，比如sr1、sr2、sr3、sr4、sr5和sr6)孵育30min后，以10ng/mllps刺激，刺激1h后trizol裂解，提取rna，去dna后反转录成cdna，qrt-pcr检测细胞因子il-1β和tnf-α的表达水平，以β-actin为内参基因。qrt-pcr体系为(20μl)：faststartuniversalsybrgreenmaster(rox)10μl，forwardprimer(10μm)0.6μl，reserveprimer(10μm)0.6μl，模板2μl(～30ng)，rnase-freeh2o6.8μl。反应条件为(a)95℃，30s；(b)95℃，5s；(c)60℃，34s，(b)-(c)40个循环。引物序列为β-actin，f：agccatgtacgtagccatcc，r：ctctcagctgtggtggtgaa；il-1β，f：gcccatcctctgtgactcat，r：aggccacaggtattttgtcg；tnf-α，f：agcccccagtctgtatcctt，r：ctccctttgcagaactcagg；以上引物序列分别为seqidno.8-13。结果显示lps能诱导大量炎性细胞因子的产生，而多肽可显著抑制lps诱导的炎性细胞因子的产生，其中，对il-1β的抑制率分别为sr2(64％)、sr3(84％)、sr4(73％)、sr5(72％)、sr6(84％)，对tnf-α的抑制率分别为sr1(63％)、sr2(90％)、sr3(93％)、sr4(96％)、sr5(94％)、sr6(95％)(图2)。

实施例2

sr4多肽可维持良好的细胞活性：将不同多肽分别作用小鼠腹腔巨噬细胞，通过mtt实验检测细胞的生物活性。具体步骤如下：

将小鼠腹腔巨噬细胞铺板(96孔细胞板，5×10⁴个/孔)，过夜培养后弃掉未贴壁的细胞，加入medium或不同多肽(40μm)孵育5h后，加入0.5mg/mlmtt试剂孵育3h，弃去培养基，加入100μlformazan溶剂，在摇床上温和地振荡5min，在酶标仪上读取od540以评价各多肽对细胞活性的影响。结果显示多肽sr1、sr3和sr4均可维持较好的细胞活性，其细胞活性分别为sr1(115％)、sr3(102％)、sr4(107％)(图3)，结合上述各多肽的抑炎效果，将sr4作为最优的抑炎多肽候选。

实施例3

sr4多肽可抑制小鼠全身性炎性细胞因子的分泌：将sr4多肽腹腔注射小鼠，再注射亚致死剂量的lps，检测小鼠血清中的炎性细胞因子水平。具体步骤如下：

将sr4多肽腹腔注射c57bl/6小鼠(10nmol/g)，1h后再使用亚致死剂量的lps攻毒(1μg/g)，4h后取小鼠血清，elisa检测血清中的炎性细胞因子il-6、il-12p40和tnf-α的分泌水平，其中，il-6和il-12p40elisa试剂盒购于bd公司(il-6elisaset：cat#555240，il-12p40opteiaset：cat#555165)，tnf-αelisa试剂盒购于biolegend公司(tnf-αelisamax^tm：cat#430901)。具体步骤为：①将各包被抗体4℃包被过夜。②次日用pbst洗涤5次后加入封闭液于37℃封闭2h。③pbst洗涤5次，各孔加入100μl待测样品，37℃孵育2h。④pbst洗涤5次，分别加入相应的检测抗体，37℃孵育1h。⑤pbst洗涤5次，各孔加入100μl链亲和素标记的辣根过氧化物酶，37℃孵育30min。⑥pbst洗涤5次，加入100μltmb底物显色5min，50μl2mh2so4终止显色，酶标仪读取od450值。结果显示lps能大量诱导小鼠血液中炎性细胞因子的分泌，而sr4多肽可显著抑制lps诱导的炎性细胞因子的产生，其抑制率分别为il-6(78％)、il-12p40(72％)、tnf-α(58％)，其中il-12p40和tnf-α甚至恢复至正常水平(图4)。

实施例4

sr4多肽可保护小鼠抵抗流感病毒的感染：流感病毒感染小鼠后，将sr4多肽腹腔注射小鼠，每日监测小鼠的体重变化。具体步骤如下：

以10⁶eid50h1n1js38流感病毒滴鼻感染c57bl/6小鼠，感染后第2天至第4天每天均腹腔注射sr4多肽(10nmol/g)，每天对小鼠的体重进行监测。结果表明在流感病毒感染后，pbs对照组和cp对照组的小鼠体重急剧下降(感染后第10天体重下降幅度分别为27％和29％)，而sr4多肽能够保护小鼠防止其体重降低(感染后第10天体重下降幅度仅为5.5％)(图5)。

本发明的一种具有抗炎功能的多肽sr4，可显著降低炎性细胞因子的分泌，抑制机体的炎症反应，且维持较好的细胞生物活性，是一种极具潜力的抗炎药物候选，同时也为新型抗炎性小分子药物的设计提供了新思路。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110>扬州大学

<120>一种具有抗炎作用的多肽sr4及其应用

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