一株高产γ-氨基丁酸的嗜热链球菌210202及其应用的制作方法

文档序号:18632695发布日期:2019-09-11 21:49阅读:597来源:国知局
一株高产γ-氨基丁酸的嗜热链球菌210202及其应用的制作方法
本发明涉及微生物发酵
技术领域
,具体地,涉及一株高产γ-氨基丁酸的嗜热链球菌210202及其应用。
背景技术
:γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid,gaba)是哺乳动物中枢神经系统中最重要的抑制性神经递质,在脑中gaba几乎对所有的神经元都有抑制作用。人体内缺乏gaba是导致人的身心不适症状的主要原因。而补充gaba的重要性就在于可以舒缓和抑制过度兴奋和激烈的神经信息传导,从而使人安定平和下来,可以有效缓解精神压力。乳酸菌作为一种食品安全级(gras)的微生物广泛应用于酸奶、奶酪和泡菜等食品的生产中,已经有很多研究表明乳酸菌具有谷氨酸脱羧酶活性,可以催化谷氨酸脱羧产生gaba。传统发酵食品是产gaba乳酸菌的主要分离来源,其酸性的环境、富含底物谷氨酸为乳酸菌合成gaba提供了有利的条件。从乳酸菌中得到高产gaba的菌株,并将其应用于制备功能性食品中或分离纯化得到gaba制剂,有很好的应用前景。虽然目前为止有关产gaba乳酸菌的报道已经很多,但开展对高产gaba的乳酸菌的分离、鉴定、应用等方面的研究对食品工业来说仍为重要,以求获得稳定的、安全的、高效的gaba用于研发富含gaba的功能性食品。对于富含γ-氨基丁酸功能性食品的开发日本研究的工作较多,已有一些实现了商品化生产,如日本的佳叶龙茶、奥里扎公司生产的富含gaba米胚芽提取物、法凯尔公司的发芽糖米、养乐多含gaba乳酸菌饮料等。而我国在这方面处于起步阶段,目前,我国有浙江益万生物技术有限公司成功生产富含gaba米胚芽,安徽来福高科股份有限公司生产的gaba食品添加剂等。但国内将gaba运用于乳制品中的较少,尤其以高产gaba乳酸菌为菌种参与发酵制得的发酵乳产品几乎没有。因此,通过对高产gaba的乳酸菌菌株进行筛选,并将其作为酸奶发酵剂用于开发出富含gaba的乳制品具有重要的社会意义和经济价值。嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)也被称为唾液链球菌嗜热亚种,是一种革兰氏阳性细菌,兼性厌氧。其不产生细胞色素、氧化酶和和过氧化氢酶阴性,不能移动也不能形成芽孢。嗜热链球菌是有毛缘的,最适生长温度为35~42℃。嗜热链球菌也被归类为乳酸菌,并已经在发酵乳品行业广泛使用。通常情况下,嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌(lactobacillusbulgaricus)在牛乳中协同发酵,嗜热链球菌可能给保加利亚乳杆菌提供其所需要的叶酸和甲酸,这两种酸在保加利亚乳杆菌的嘌呤代谢中发挥着重要作用。usda数据显示,在1998年,超过10亿公斤的马苏里拉奶酪和6亿公斤的酸奶是用嗜热链球菌来发酵生产的。虽然链球菌属含有一些致病菌,但食品行业认为嗜热链球菌比其他链球菌都要更加安全,还有人认为含有活的嗜热链球菌的奶酪和酸奶有益于人体健康,活的嗜热链球菌可以帮助乳糖不耐受的人群更加容易的消化乳制品。已经有相关研究证实嗜热链球菌具备产gaba的能力,但gaba的含量偏低。因此,有必要筛选出一株高产gaba的嗜热链球菌。技术实现要素:本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足,提供一株高产γ-氨基丁酸的嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)210202。本发明的另一目的在于提供上述高产γ-氨基丁酸的嗜热链球菌210202在制备γ-氨基丁酸中的应用。本发明的另一目的在于提供上述高产γ-氨基丁酸的嗜热链球菌210202在制备富含γ-氨基丁酸的酸奶发酵剂中的应用。本发明的另一目的在于提供上述高产γ-氨基丁酸的嗜热链球菌210202在制备乳制品中的应用。本发明的另一目的在于提供一种富含γ-氨基丁酸的酸奶发酵剂。本发明的另一目的在于提供一种富含γ-氨基丁酸的乳制品的制备方法为了实现上述目的,本发明是通过以下方案予以实现的:本发明从天然发酵食品中筛选出能够在牛乳中代谢高产gaba的嗜热链球菌菌株,并对其进行了形态学、代谢学和遗传学方面的鉴定,api和16srrna鉴定结果验证其为链球菌属(streptococcus)嗜热链球菌种(s.thermophilus)。通过对其产物γ-氨基丁酸(gaba)进行了鉴定和检测,验证了其在脱脂乳粉复原乳(简称脱脂乳)中产gaba的能力,并与同种其他菌株进行了对比,结果表明该菌株产gaba的能力高于其他乳酸菌。因此,本发明请求保护一株高产γ-氨基丁酸的嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)210202,于2018年10月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc),保藏编号为cgmccno.16585。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所。本发明所述嗜热链球菌210202具有如下形态和生理、生化特性:(1)形态学特征嗜热链球菌210202在m17琼脂平板培养基上厌氧条件下生长良好,培养48h以内可形成明显的菌落,菌落呈乳白色、直径0.5mm~1mm的圆形,不透明;表面呈椭球形凸起,湿润、光滑,外缘整齐。显微镜下,经革兰氏染色,嗜热链球菌210202呈革兰氏阳性,大小为直径0.8~1μm的近似球形,单个、成对或呈短链的排列。(2)生理生化特性嗜热链球菌210202为革兰氏阳性菌,无鞭毛,不可移动,不能生成芽孢,兼性厌氧,适宜生长温度为41~48℃,缺乏表面黏蛋白,因此不具备致病菌特征。可生成少量胞外多糖,在牛乳中可以代谢乳糖、葡萄糖,发酵产生乳酸,其分解蛋白能力弱。在有谷氨酸钠存在的情况下,其代谢产生γ-氨基丁酸的能力显著高于其他嗜热链球菌菌株。所述嗜热链球菌210202的16srrna序列如seqidno:1所示。本发明还请求保护所述高产γ-氨基丁酸的嗜热链球菌210202在制备γ-氨基丁酸中的应用。本发明还请求保护所述高产γ-氨基丁酸的嗜热链球菌210202在制备富含γ-氨基丁酸的酸奶发酵剂中的应用。本发明还请求保护所述高产γ-氨基丁酸的嗜热链球菌210202在制备乳制品中的应用。优选地,所述乳制品为酸奶。更优选地,所述乳制品为富含γ-氨基丁酸的酸奶。本发明还请求保护一种富含γ-氨基丁酸的酸奶发酵剂,所述酸奶发酵剂中含有上述高产γ-氨基丁酸的嗜热链球菌210202。优选地,所述酸奶发酵剂中嗜热链球菌210202的含量为1×109cfu/g~1×1012cfu/g。更优选地,所述酸奶发酵剂中嗜热链球菌210202的含量为1×1011cfu/g。本发明还请求保护一种富含γ-氨基丁酸的乳制品的制备方法,包括如下步骤:将上述嗜热链球菌210202的菌液按1%~6%(v/v)的量,添加到含有2~5g/l谷氨酸钠,8%~12%(w/w)脱脂乳粉复原乳、脱脂生牛乳或全脂生牛乳的发酵体系中;于32~43℃条件下静置培养24~48h,即得富含γ-氨基丁酸的乳制品;所述嗜热链球菌210202的菌液中有效活菌数为1×108cfu/ml~1×1010cfu/ml。优选地,所述嗜热链球菌210202菌液的添加量为3%(v/v);发酵体系中含有3g/l谷氨酸钠、10%(w/v)脱脂乳粉复原乳。优选地,所述静置培养的温度为37℃、时间为48h。与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:本发明从天然发酵食品中筛选出能够在牛乳中代谢高产gaba的嗜热链球菌菌株210202,并对其进行了形态学、代谢学和遗传学方面的鉴定,鉴定为链球菌属嗜热链球菌种。该菌株能在含有谷氨酸钠、脱脂乳粉复原乳的发酵体系中高产gaba,gaba的含量为0.3273g/l。本发明为制备富含γ-氨基丁酸的酸奶发酵剂或乳制品提供了新的途径,对工业化生产高含量gaba的酸奶制品有重要意义。附图说明图1为菌株210202嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)的16srrna鉴定结果。图2为菌株210202嗜热链球菌在培养基上的生长形态。其中,a为嗜热链球菌210202在m17琼脂平板培养基上的生长情况,b为嗜热链球菌210202经革兰氏染色后在显微镜下的形态。图3为γ-氨基丁酸标准品的含量图谱。其中,a为gaba标品浓度为10μg/ml时的图谱,b为gaba标品浓度为50μg/ml时的图谱,c为gaba标品浓度为100μg/ml时的图谱,d为gaba标品浓度为150μg/ml时的图谱,e为gaba标品浓度为250μg/ml时的图谱。图4为嗜热链球菌菌株210202的发酵代谢产物含量图谱。图5为嗜热链球菌菌株210201的发酵代谢产物含量图谱。具体实施方式下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述,所述实施例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明,均为常规方法;所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,为可从商业途径得到的试剂和材料。实施例1嗜热链球菌的筛选和鉴定从新疆赛里木湖边哈萨克族居民毡房里取得的酸奶中筛选取得,取该鲜奶样品1g,使用无菌生理盐水1:10梯度稀释所取得的鲜奶,然后从-5、-6、-7三个稀释梯度的样品中分别取100μl的样品涂布于mrs平板培养基上,置于厌氧环境,置于37℃下培养48h。之后在-5稀释梯度的平板上,挑取单菌落进行平板划线纯化,再置于37℃下厌氧培养48h,重复三次,获得菌株210202。使用api50试剂条和16srrna等技术对该菌株进行分类学鉴定,鉴定为链球菌属嗜热链球菌种(如图1所示)。然后使用10%(m/v)脱脂乳保存该菌株,于-80℃冻藏备用。所述嗜热链球菌210202具有如下形态和生理、生化特性:(1)形态学特征嗜热链球菌210202在m17琼脂平板培养基上厌氧条件下生长良好,培养48h以内可形成明显的菌落,菌落呈乳白色、直径0.5mm~1mm的圆形,不透明;表面呈椭球形凸起,湿润、光滑,外缘整齐(如图2a所示)。显微镜下,经革兰氏染色,嗜热链球菌210202呈革兰氏阳性,大小为直径0.8~1μm的近似球形,单个、成对或呈短链的排列(如图2b所示)。(2)生理生化特性嗜热链球菌210202为革兰氏阳性菌,无鞭毛,不可移动,不能生成芽孢,兼性厌氧,适宜生长温度为41-45℃,缺乏表面黏蛋白,因此不具备致病菌特征。可生成少量胞外多糖,在牛乳中可以代谢乳糖、葡萄糖,发酵产生乳酸,其分解蛋白能力弱。在有谷氨酸钠存在的情况下,其代谢产生γ-氨基丁酸的能力显著高于其他嗜热链球菌菌株。所述嗜热链球菌210202的16srrna序列如seqidno:1所示。实施例2高产gaba的嗜热链球菌菌株的筛选方法将实施例1中得到的嗜热链球菌210202与自有菌种库中的其他74株嗜热链球菌在同等培养条件下进行产gaba量的比对。具体步骤如下:1、制种将冻存的嗜热链球菌75株菌株分别使用mrs平板划线活化,然后分别挑取单菌落使用m17肉汤培养基在37℃静置培养24h,重复两次后,即制成种子液。2、初筛将种子液按3%(v/v)的添加量,吸取活化好的种子液接种于m17合成培养基中,置于37℃下静置培养72h后,对其发酵液中gaba含量进行测定,完成对高产gaba菌的初筛。3、复筛将种子液按3%(v/v)的添加量,吸取活化好的种子液接种于含3g/l谷氨酸钠的脱脂乳粉复原乳(10%,w/v)培养基中,置于37℃下静置培养48h后,对其发酵乳中gaba含量进行测定,完成对高产gaba菌的复筛。实施例3高效液相色谱检测脱脂乳中gaba含量本实施例采用高效液相色谱,检测市售gaba纯品,建立峰面积与含量的标准曲线,并确定保留时间;然后检测嗜热链球菌发酵48h后的脱脂乳样品,计算特定时间的峰面积,计算出样品中的gaba含量,比较不同嗜热链球菌的产gaba量。一、检测试剂的制备1、5%(v/v)醋酸溶液,2mol/l的氢氧化钠溶液,5%(w/v)三氯乙酸溶液。2、硼酸缓冲液称取2.47g硼酸,溶于80ml蒸馏水,而后用2mol/l的氢氧化钠溶液调至ph10.2。3、衍生剂的配制称取0.1g邻苯二甲醛(opa)于10ml棕色容量瓶,加入1ml甲醇(色谱级)待充分溶解后,再加入160μlβ-巯基乙醇,而后用ph10.2的硼酸缓冲液定容10ml。4、流动相的配制流动相a:称取2.0412g乙酸钠,溶于1000ml纯水,而后加入0.22ml三乙胺,并用5%(v/v)醋酸溶液调至ph7.2,最后加入5ml四氢呋喃,过0.45μm水系滤膜、超声脱气后备用。流动相b:将500ml乙腈(色谱级)和500ml甲醇(色谱级)等体积混合,超声脱气后备用。二、hplc分析方法1、样品前处理:取适量发酵乳/发酵液置于离心管,分别在7830rpm/12000rpm,4℃条件下离心3min,而后取适量的上清液,与5%(w/v)三氯乙酸溶液等体积混合,并于12000rpm、4℃条件下离心15min。2、衍生处理:取适量经前处理完后的样品,与衍生剂等体积混合,室温衍生2min后,上机分析。衍生方法及各参数如表1所示。表1hplc分析参数设置三、检测结果hplc分析结果如表2、表3所示。表2不同浓度gaba标品的保留时间及峰面积gaba标品浓度(μg/ml)保留时间(min)峰面积1022.5211027455022.36065294410022.436132606815022.367206338025022.3313500344表3菌株210202与其他嗜热链球菌产gaba量的比较菌株编号菌株种类培养条件gaba含量(g/l)210201嗜热链球菌48h,37℃,10%脱脂乳,3g/l谷氨酸钠0.0102210222嗜热链球菌48h,37℃,10%脱脂乳,3g/l谷氨酸钠0.0106210202嗜热链球菌48h,37℃,10%脱脂乳,3g/l谷氨酸钠0.3273210207嗜热链球菌48h,37℃,10%脱脂乳,3g/l谷氨酸钠0.0721220209嗜热链球菌48h,37℃,10%脱脂乳,3g/l谷氨酸钠0.0828220221嗜热链球菌48h,37℃,10%脱脂乳,3g/l谷氨酸钠0.0106210001嗜热链球菌48h,37℃,10%脱脂乳,3g/l谷氨酸钠0.0181210002嗜热链球菌48h,37℃,10%脱脂乳,3g/l谷氨酸钠0.0156210101嗜热链球菌48h,37℃,10%脱脂乳,3g/l谷氨酸钠0.0103210102嗜热链球菌48h,37℃,10%脱脂乳,3g/l谷氨酸钠0.0213210106嗜热链球菌48h,37℃,10%脱脂乳,3g/l谷氨酸钠0.0276210200嗜热链球菌48h,37℃,10%脱脂乳,3g/l谷氨酸钠0.0188210201嗜热链球菌48h,37℃,10%脱脂乳,3g/l谷氨酸钠0.0097以上结果表明,相比于其他乳酸菌,嗜热链球菌210202能高产gaba,因此于2018年10月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc),保藏编号为cgmccno.16585。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所。利用该菌株可制备富含γ-氨基丁酸的酸奶发酵剂或乳制品,对工业化生产高含量gaba的酸奶制品有重要意义。最后所应当说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制,对于本领域的普通技术人员来说,在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动,这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。序列表<110>绿雪生物工程(深圳)有限公司<120>一株高产γ-氨基丁酸的嗜热链球菌210202及其应用<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1296<212>dna<213>嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)<400>1ggcccgggaacgtattcaccgcggcgtgctgatccgcgattactagcgattccgacttca60tgtaggcgagttgcagcctacaatccgaactgagattggctttaagagattagctcgccg120tcaccgactcgcaactcgttgtaccaaccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataag180gggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttattaccggcagtctcgcta240gagtgcccaactgaatgatggcaactaacaataggggttgcgctcgttgcgggacttaac300ccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcaccgatgtaccgaa360gtaactttctatctctagaaatagcatcgggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgt420tgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagt480ttcaaccttgcggtcgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcggcactgaa540tcccggaaaggatccaacacctagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatct600aatcctgttcgctccccacgctttcgagcctcagcgtcagttacagaccagagagccgct660ttcgccaccggtgttcctccatatatctacgcatttcaccgctacacatggaattccact720ctccccttctgcactcaagtttgacagtttccaaagcgaactatggttgagccacagcct780ttaacttcagacttatcaaaccgcctgcgctcgctttacgcccaataaatccggacaacg840ctcgggacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtccctttctggtaag900ctaccgtcacagtgtgaactttccactctcacacccgttcttgacttacaacagagcttt960acgatccgaaaaccttcttcactcacgcggcgttgctcggtcagggttgcccccattgcc1020gaagattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggc1080cgatcaccctctcaggtcggctatgtatcgtcgcctaggtgagccattacctcacctact1140agctaatacaacgcaggtccatcttgtagtggagcaattgcccctttcaaataaatgaca1200tgtgtcatccattgttatgcggtattagctatcgtttccaatagttatcccccgctacaa1260ggcaggttacctacgcgttactcacccgttcgcaac1296当前第1页12
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