一株高产γ-氨基丁酸的乳酸乳球菌乳酸亚种220223及其应用的制作方法

本发明涉及微生物发酵
技术领域：
，具体地，涉及一株高产γ-氨基丁酸的乳酸乳球菌乳酸亚种220223及其应用。
背景技术：
：γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid，gaba)是哺乳动物中枢神经系统中最重要的抑制性神经递质，在脑中gaba几乎对所有的神经元都有抑制作用。人体内缺乏gaba是导致人的身心不适症状的主要原因。而补充gaba的重要性就在于可以舒缓和抑制过度兴奋和激烈的神经信息传导，从而使人安定平和下来，可以有效缓解精神压力。乳酸菌作为一种食品安全级(gras)的微生物广泛应用于酸奶、奶酪和泡菜等食品的生产中，已经有很多研究表明乳酸菌具有谷氨酸脱羧酶活性，可以催化谷氨酸脱羧产生gaba。传统发酵食品是产gaba乳酸菌的主要分离来源，其酸性的环境、富含底物谷氨酸为乳酸菌合成gaba提供了有利的条件。从乳酸菌中得到高产gaba的菌株，并将其应用于制备功能性食品中或分离纯化得到gaba制剂，有很好的应用前景。虽然目前为止有关产gaba乳酸菌的报道已经很多，但开展对高产gaba的乳酸菌的分离、鉴定、应用等方面的研究对食品工业来说仍为重要，以求获得稳定的、安全的、高效的gaba用于研发富含gaba的功能性食品。对于富含γ-氨基丁酸功能性食品的开发日本研究的工作较多，已有一些实现了商品化生产，如日本的佳叶龙茶、奥里扎公司生产的富含gaba米胚芽提取物、法凯尔公司的发芽糖米、养乐多含gaba乳酸菌饮料等。而我国在这方面处于起步阶段，目前，我国有浙江益万生物技术有限公司成功生产富含gaba米胚芽，安徽来福高科股份有限公司生产的gaba食品添加剂等。但国内将gaba运用于乳制品中的较少，尤其以高产gaba乳酸菌为菌种参与发酵制得的发酵乳产品几乎没有。因此，通过对高产gaba的乳酸菌菌株进行筛选，并将其作为酸奶发酵剂用于开发出富含gaba的乳制品具有重要的社会意义和经济价值。乳酸乳球菌(lactococcuslactis)是一种革兰氏阳性细菌，是一种在发酵乳品行业广泛使用的乳酸菌。乳酸乳球菌细胞呈球型，以成对或短链形式出现，当生长环境变化时，还会以卵型出现，其长度约为0.5～1.5μm。乳酸乳球菌不能产生芽孢而且不能移动，同型乳酸发酵，只将乳糖代谢成乳酸。还有研究声称乳酸乳球菌只产生l-乳酸，但当培养环境的ph值很低时，可以产生d-乳酸。乳酸乳球菌代谢产生乳酸是其成为当今乳品行业最重要的发酵菌种之一的主要原因。基于长期食用其发酵食物的历史，乳酸乳球菌已经被认定为安全的食品级微生物(gras)。已经有科学研究证实乳酸乳球菌具备产gaba的能力，但gaba的含量偏低。因此，有必要筛选出一株高产gaba的乳酸乳球菌。技术实现要素：本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一株高产γ-氨基丁酸的乳酸乳球菌乳酸亚种(lactococcuslactissubsp.lactis)220223。本发明的另一目的在于提供上述高产γ-氨基丁酸的乳酸乳球菌乳酸亚种220223在制备γ-氨基丁酸中的应用。本发明的另一目的在于提供上述高产γ-氨基丁酸的乳酸乳球菌乳酸亚种220223在制备富含γ-氨基丁酸的酸奶发酵剂中的应用。本发明的另一目的在于提供上述高产γ-氨基丁酸的乳酸乳球菌乳酸亚种220223在制备乳制品中的应用。本发明的另一目的在于提供一种富含γ-氨基丁酸的酸奶发酵剂。本发明的另一目的在于提供一种富含γ-氨基丁酸的乳制品的制备方法为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：本发明从天然发酵食品中筛选出能够在牛乳中代谢高产gaba的乳酸乳球菌菌株，并对其进行了形态学、代谢学和遗传学方面的鉴定，api和16srrna鉴定结果验证其为乳酸乳球菌乳酸亚种(lactococcuslactissubsp.lactis)。通过其产物γ-氨基丁酸(gaba)进行了鉴定和检测，验证了其在脱脂乳粉复原乳(简称脱脂乳)中产gaba的能力，并与同种其他菌株进行了对比，结果表明该菌株产gaba的能力高于其他乳酸菌。因此，本发明请求保护一株高产γ-氨基丁酸的乳酸乳球菌乳酸亚种(lactococcuslactissubsp.lactis)220223，所述菌株于2018年10月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmccno.16584。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。本发明所述乳酸乳球菌乳酸亚种220223具有如下形态和生理、生化特性：(1)形态学特征乳酸乳球菌乳酸亚种220223在m17琼脂平板培养基上厌氧条件下生长良好，培养48h可形成明显菌落，菌落整体乳白色，直径2～4mm，近似圆形，湿润，中心呈不透明的微凸起，光滑；外周呈灰色或半透明的毛缘结构，毛缘中存在缺口，毛缘宽度与中心半径约为1:1；外缘则呈现锯齿状毛边，菌落有单独存在，也有几个菌落相互接触生长。显微镜下，经革兰氏染色，乳酸乳球菌乳酸亚种220223呈革兰氏阳性，大小为1～1.5μm的椭球型，单个、成对、短链、长链、片状的排列均有存在。(2)生理生化特性乳酸乳球菌乳酸亚种220223为革兰氏阳性菌，无鞭毛，不可移动，不能生成芽孢，兼性厌氧，适宜生长温度为30℃～37℃，在牛乳中可以利用葡萄糖、乳糖，发酵产生乳酸，另外，还能在有氧条件下生存和生长，但发酵过程受到影响。在有谷氨酸钠存在的情况下，其代谢产生γ-氨基丁酸的能力显著高于其他乳酸乳球菌菌株。所述乳酸乳球菌乳酸亚种220223的16srrna序列如seqidno:1所示。本发明还请求保护所述高产γ-氨基丁酸的乳酸乳球菌乳酸亚种220223在制备γ-氨基丁酸中的应用。本发明还请求保护所述高产γ-氨基丁酸的乳酸乳球菌乳酸亚种220223在制备富含γ-氨基丁酸的酸奶发酵剂中的应用。本发明还请求保护所述高产γ-氨基丁酸的乳酸乳球菌乳酸亚种220223在制备乳制品中的应用。优选地，所述乳制品为酸奶。更优选地，所述乳制品为富含γ-氨基丁酸的酸奶。本发明还请求保护一种富含γ-氨基丁酸的酸奶发酵剂，所述酸奶发酵剂中含有上述高产γ-氨基丁酸的乳酸乳球菌乳酸亚种220223。优选地，所述酸奶发酵剂中乳酸乳球菌乳酸亚种220223的含量为1×109cfu/g～1×1011cfu/g。更优选地，所述酸奶发酵剂中乳酸乳球菌乳酸亚种220223的含量为1×1010cfu/g。本发明还请求保护一种富含γ-氨基丁酸的乳制品的制备方法，包括如下步骤：将上述乳酸乳球菌乳酸亚种220223的菌液按1％～4％(v/v)的量，添加到含有4～8g/l谷氨酸钠、10％～13％(w/w)脱脂乳粉复原乳、脱脂生牛乳或全脂生牛乳的发酵体系中，于30～38℃条件下静置培养36～48h，即得富含γ-氨基丁酸的乳制品；所述乳酸乳球菌乳酸亚种220223的菌液中有效活菌数为5×108cfu/ml～5×1010cfu/ml。优选地，所述乳酸乳球菌乳酸亚种220223菌液的添加量为4％(v/v)；发酵体系中含有6g/l谷氨酸钠、10％(w/v)脱脂乳粉复原乳。优选地，所述静置培养的温度为36℃、时间为40h。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明从天然发酵食品中筛选出能够在牛乳中代谢高产gaba的乳酸乳球菌乳酸亚种菌株220223，并对其进行了形态学、代谢学和遗传学方面的鉴定，确定为乳酸乳球菌乳酸亚种。该菌株能在含有谷氨酸钠、脱脂乳的发酵体系中高产gaba，gaba的含量为0.3909g/l。本发明为制备富含γ-氨基丁酸的酸奶发酵剂或乳制品提供了新的途径，对工业化生产高含量gaba的酸奶制品有重要意义。附图说明图1为乳酸乳球菌乳酸亚种(lactococcuslactissubsp.lactis)菌株220223的api糖代谢鉴定结果。图2为乳酸乳球菌乳酸亚种菌株220223在培养基上的生长形态。其中，a为乳酸乳球菌乳酸亚种菌株220223在m17琼脂平板培养基上的生长情况，b为乳酸乳球菌乳酸亚种菌株220223革兰氏染色后在显微镜下的形态。图3为乳酸乳乳球菌乳酸亚菌株220223种的16srrna鉴定结果。图4为γ-氨基丁酸标准品的含量图谱。其中，a为gaba标品浓度为10μg/ml时的图谱，b为gaba标品浓度为50μg/ml时的图谱，c为gaba标品浓度为100μg/ml时的图谱，d为gaba标品浓度为150μg/ml时的图谱，e为gaba标品浓度为250μg/ml时的图谱。图5为乳酸乳球菌乳酸亚种菌株220223的发酵代谢产物含量图谱。图6为乳酸乳球菌菌株220203的发酵代谢产物含量图谱。具体实施方式下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。实施例1乳酸乳球菌的筛选和鉴定从新疆伊宁市新华东路路边摊的鲜奶中筛选取得，取该鲜奶样品1ml，使用无菌生理盐水1:10梯度稀释所取得的鲜奶，然后从-5、-6、-7三个稀释梯度的样品中分别取100μl的样品涂布于mrs平板培养基上，置于厌氧环境，置于37℃下培养48h。之后在-5稀释梯度的平板上，挑取单菌落进行平板划线纯化，再置于37℃下厌氧培养48h，重复三次，获得菌株220223。使用api50试剂条和16srrna等技术对该菌株进行分类学鉴定，确认为乳酸乳球菌乳酸亚种(如图1、图3所示)。然后使用10％(m/v)脱脂乳保存该菌株，于-80℃冻藏备用。所述乳酸乳球菌乳酸亚种220223具有如下形态和生理、生化特性：(1)形态学特征乳酸乳球菌乳酸亚种220223在m17琼脂平板培养基上厌氧条件下生长良好，培养48h可形成明显菌落，菌落整体乳白色，直径2～4mm，近似圆形，湿润，中心呈不透明的微凸起，光滑；外周呈灰色或半透明的毛缘结构，毛缘中存在缺口，毛缘宽度与中心半径约为1:1；外缘则呈现锯齿状毛边，菌落有单独存在，也有几个菌落相互接触生长(如图2所示)。显微镜下，经革兰氏染色，乳酸乳球菌乳酸亚种220223呈革兰氏阳性，大小为1～1.5μm的椭球型，单个、成对、短链、长链、片状的排列均有存在。(2)生理生化特性乳酸乳球菌乳酸亚种220223为革兰氏阳性菌，无鞭毛，不可移动，不能生成芽孢，兼性厌氧，适宜生长温度为30℃～37℃，在牛乳中可以利用葡萄糖、乳糖，发酵产生乳酸，另外，还能在有氧条件下生存和生长，但发酵过程受到影响。在有谷氨酸钠存在的情况下，其代谢产生γ-氨基丁酸的能力显著高于其他乳酸乳球菌菌株。所述乳酸乳球菌乳酸亚种220223的16srrna序列如seqidno:1所示。实施例2高产gaba的乳酸乳球菌菌株的筛选方法将实施例1中得到的乳酸乳球菌乳酸亚种220223与自有菌种库中的其他134株乳酸乳球菌在同等培养条件下进行产gaba量的比对。具体步骤如下：1、制种将冻存的乳酸乳球菌135株分别使用mrs平板划线活化，然后分别挑取单菌落使用m17肉汤培养基在37℃静置培养24h，重复两次后，即制成种子液。2、初筛将种子液按3％(v/v)的添加量，吸取活化好的种子液接种于m17合成培养基中，置于37℃下静置培养72h后，对其发酵液中gaba含量进行测定，完成对高产gaba菌的初筛。3、复筛将种子液按4％(v/v)的添加量，吸取活化好的种子液接种于含6g/l谷氨酸钠的脱脂乳(10％，w/v)培养基中，置于36℃下静置培养40h后，对其发酵乳中gaba含量进行测定，完成对高产gaba菌的复筛。实施例3高效液相色谱检测脱脂乳中gaba含量本实施例采用高效液相色谱，检测市售gaba纯品，建立峰面积与含量的标准曲线，并确定保留时间；然后检测乳酸乳球菌发酵40h后的脱脂乳样品，计算特定时间的峰面积，计算出样品中的gaba含量，比较不同乳酸乳球菌的产gaba量。一、检测试剂的制备1、5％(v/v)醋酸溶液，2mol/l的氢氧化钠溶液，5％(w/v)三氯乙酸溶液。2、硼酸缓冲液称取2.47g硼酸，溶于80ml蒸馏水，而后用2mol/l的氢氧化钠溶液调至ph10.2。3、衍生剂的配制称取0.1g邻苯二甲醛(opa)于10ml棕色容量瓶，加入1ml甲醇(色谱级)待充分溶解后，再加入160μlβ-巯基乙醇，而后用ph10.2的硼酸缓冲液定容10ml。4、流动相的配制流动相a：称取2.0412g乙酸钠，溶于1000ml纯水，而后加入0.22ml三乙胺，并用5％(v/v)醋酸溶液调至ph7.2，最后加入5ml四氢呋喃，过0.45μm水系滤膜、超声脱气后备用。流动相b：将500ml乙腈(色谱级)和500ml甲醇(色谱级)等体积混合，超声脱气后备用。二、hplc分析方法1、样品前处理：取适量发酵乳/发酵液置于离心管，分别在7830rpm/12000rpm，4℃条件下离心3min，而后取适量的上清液，与5％(w/v)三氯乙酸溶液等体积混合，并于12000rpm、4℃条件下离心15min。2、衍生处理：取适量经前处理完后的样品，与衍生剂等体积混合，室温衍生2min后，上机分析。衍生方法及各参数如表1所示。表1hplc分析参数设置三、检测结果hplc分析结果如表2、表3所示。表2不同浓度gaba标品的保留时间及峰面积gaba标品浓度(μg/ml)保留时间(min)峰面积1022.5211027455022.36065294410022.436132606815022.367206338025022.3313500344表3菌株220223与其他乳酸乳球菌产gaba量的比较以上结果表明，相比于其他乳酸菌，乳酸乳球菌乳酸亚种220223能高产gaba，因此于2018年10月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmccno.16584。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。利用该菌株可制备富含γ-氨基丁酸的酸奶发酵剂或乳制品，对工业化生产高含量gaba的酸奶制品有重要意义。最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。序列表<110>绿雪生物工程（深圳）有限公司<120>一株高产γ-氨基丁酸的乳酸乳球菌乳酸亚种220223及其应用<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1284<212>dna<213>乳酸乳球菌乳酸亚种(lactococcuslactissubsp.lactis)<400>1ggtgagtaacgcgtggggaatctgcctttgagcgggggacaacatttggaaacgaatgct60aataccgcataaaaactttaaacacaagttttaagtttgaaagatgcaattgcatcactc120aaagatgatcccgcgttgtattagctagttggtgaggtaaaggctcaccaaggcgatgat180acatagccgacctgagagggtgatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcct240acgggaggcagcagtagggaatcttcggcaatggacgaaagtctgaccgagcaacgccgc300gtgagtgaagaaggttttcggatcgtaaaactctgttggtagagaagaacgttggtgaga360gtggaaagctcatcaagtgacggtaactacccagaaagggacggctaactacgtgccagc420agccgcggtaatacgtaggtcccgagcgttgtccggatttattgggcgtaaagcgagcgc480aggtggtttattaagtctggtgtaaaaggcagtggctcaaccattgtatgcattggaaac540tggtagacttgagtgcaggagaggagagtggaattccatgtgtagcggtgaaatgcgtag600atatatggaggaacaccggtggcgaaagcggctctctggcctgtaactgacactgaggct660cgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgag720tgctagatgtagggagctataagttctctgtatcgcagctaacgcaataagcactccgcc780tggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggt840ggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatactcgt900gctattcctagagataggaagttccttcgggacacgggatacaggtggtgcatggttgtc960gtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccctattgtta1020gttgccatcattaagttgggcactctaacgagactgccggtgataaaccggaggaaggtg1080gggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggat1140ggtacaacgagtcgcgagacagtgatgtttagctaatctcttaaaaccattctcagttcg1200gattgtaggctgcaactcgcctacatgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagcac1260gccgcggtgaatacgttcccgggc1284当前第1页12