麦角病菌荧光定量PCR检测试剂及检测试剂盒和应用的制作方法

技术特征：

1.用于检测麦角病菌的成套单链DNA，由引物对和单链DNA探针组成；

所述引物对，为如下任一：

(a1)由SEQ ID No.1所示的单链DNA和SEQ ID No.2所示的单链DNA组成的引物对；

(a2)由将SEQ ID No.1和SEQ ID No.2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的，且与(a1)中所述引物对功能相同的引物对；

所述单链DNA探针的核苷酸序列为SEQ ID No.3。

2.根据权利要求1所述的成套单链DNA，其特征在于：所述单链DNA探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；

进一步地，所述荧光报告基团为FAM；所述荧光淬灭基团为TAMRA。

3.用于检测麦角病菌的引物对，为权利要求1中的所述引物对。

4.用于检测麦角病菌的试剂，其特征在于：所述试剂中除了含有权利要求1或2所述的成套单链DNA或权利要求3所述引物对外，还含有TaqMan实时荧光定量PCR扩增缓冲液和dd H2O。

5.用于检测麦角病菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有如下组分：

溶液I：2×Universal PCR Master Mix；

溶液II：引物溶液；所述引物溶液中，SEQ ID No.1所示的单链DNA和SEQ ID No.2所示的单链DNA浓度均为10μmol/L；

溶液III：探针溶液；所述探针溶液中，SEQ ID No.3所示的单链DNA的浓度为10μmol/L；

溶液IV：灭菌去离子水；

溶液V：阳性对照液；所述阳性对照液中含有麦角病菌基因组DNA；

溶液VI：阴性对照液；所述阴性对照液中不含有麦角病菌基因组DNA；

溶液VII：定量标准液；所述定量标准液中含有浓度为100ng/μL的麦角病菌基因组DNA。

6.一种检测待测样本中是否含有麦角病菌的方法，为如下(b1)或(b2)：

(b1)包括如下步骤：从待测样本中提取总DNA，作为模板，以权利要求3所述的引物对进行PCR扩增，得到扩增产物；然后按照如下确定所述待测样本中是否含有麦角病菌：如果所述扩增产物中含有59bp的DNA片段，则所述待测样本中含有或候选含有麦角病菌；如果所述扩增产物中不含有59bp的DNA片段，则所述待测样本中不含有或候选不含有麦角病菌；

(b2)包括如下步骤：从待测样本中提取总DNA，作为模板，以权利要求1或2所述的成套单链DNA进行荧光定量PCR扩增；然后根据Ct值和扩增曲线按照如下确定所述待测样本中是否含有麦角病菌：如果Ct值小于等于35且扩增曲线为阳性，则所述待测样本中含有或候选含有麦角病菌；如果无Ct值或Ct值大于等于40或无扩增曲线，则所述待测样本中不含有或候选不含有麦角病菌。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述59bp的DNA片段为SEQ ID No.4所示DNA片段。

8.一种检测待测样本中麦角病菌基因组DNA含量的方法，包括如下步骤：

(c1)将权利要求5所述试剂盒中的定量标准液稀释为系列已知浓度，分别作为模板，以权利要求1或2所述的成套单链DNA进行荧光定量PCR扩增，绘制荧光定量PCR标准曲线；

(c2)从待测样本中提取总DNA，作为模板，以权利要求1或2所述的成套单链DNA进行荧光定量PCR扩增；然后根据步骤(c1)所绘制的荧光定量PCR标准曲线得出所述待测样本中麦角病菌基因组DNA的含量。

9.根据权利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于：进行所述进行荧光定量PCR扩增时，组成所述引物对的两条单链DNA在反应体系中浓度均为0.2μmol/L，所述单链DNA探针在反应体系中浓度为0.7μmol/L；和/或

进行所述进行荧光定量PCR扩增时，退火温度为60℃。

10.如下任一应用：

(d1)权利要求1或2所述的成套单链DNA或权利要求3所述的引物对在制备权利要求4所述试剂中的应用；

(d2)权利要求1或2所述的成套单链DNA或权利要求3所述的引物对或权利要求4所述试剂在制备权利要求5所述试剂盒中的应用；

(d3)权利要求1或2所述的成套单链DNA或权利要求3所述的引物对或权利要求4所述试剂或权利要求5所述试剂盒在检测麦角病菌中的应用，或者在制备用于检测麦角病菌的产品中的应用。