短小芽孢杆菌S1419及其在解钾上的应用的制作方法

本发明涉及一种短小芽孢杆菌s1419及其在解钾上的应用。

背景技术：

钾是植物生长发育所必需的三大营养元素之一。钾的重要功能主要表现在参与作物体内多种酶的活化、光合作用同化产物运输、碳水化合物代谢与蛋白质合成等，是最有效的酶激活剂；钾元素还可以增强植物抗旱、抗寒、抗病虫害、抗倒伏等能力，从而提高植物抵御不良环境的能力。

自然界中95％的钾元素以矿物钾形态存在于钾长石和云母等物质中，即土壤中的钾大部分以硅铝酸盐等矿物态的形式存在。由于这些矿物态的钾在短时间内难以被土壤中性盐所浸提，不能被作物直接吸收利用，属于缓效钾。所以，我国的耕地约70％缺钾，约45％严重缺钾，不利于植物(作物)生长。为了弥补这个缺陷，农业生产中频繁施用大量化学肥料，导致对土壤结构的破坏，土壤有机质含量下降，影响农业可持续发展，不利于绿色发展。

植物(作物)可以直接吸收利用的为速效钾(即土壤中的水溶性钾)，这部分钾占全钾量的2％以下。但在一定的条件下，缓效钾、速效钾、矿物态钾三者之间可相互转化。自然界中，微生物解钾菌介导了矿物态钾(缓效钾)转化为速效钾的过程，且充当重要的角色。

因此，急需要能快速将矿物态钾(缓效钾)转化为速效钾的解钾菌。

技术实现要素：

本发明提供一种短小芽孢杆菌s1419(bacilluspumilus)及其在解钾上的应用。本发明的短小芽孢杆菌s1419能将矿物态钾(缓效钾)转化为速效钾，从而被植物(作物)吸收。

本发明是通过以下技术方案实现的：

所述短小芽孢杆菌为短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)s1419，于2019年5月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，简称为cgmcc，保藏编号为：cgmccno.17816。

称取新鲜的春羽的根际土壤(philodenronselloumkoch)，溶于蒸馏水中形成土壤溶液，充分摇匀振荡，然后配制浓度为10^-1～10^-6g/ml的土壤溶液，再吸取上述的土壤溶液，采用涂布法均匀地接种涂布在初筛培养基上，然后倒置于30℃恒温培养箱培养4天，再挑取长势好、完整的菌落进行分离、纯化得到初筛菌株，然后将初筛菌株接种在nb培养基上并倒置于30℃恒温培养箱培养3天，之后挑取nb固体培养基上的菌落点种至解钾培养基上，放置于30℃恒温培养箱培养3天，筛选得到所述的短小芽孢杆菌s1419；

所述的初筛培养基由以下组分按照以下质量浓度配制而成：5.0g/l蔗糖+2.0g/lmgso4·7h2o+0.1g/lcaco3+0.005g/lfecl3+20.0g/l琼脂；将上述的组分配制好后经高温消毒，然后冷凝则可以使用；

所述的nb培养基由以下组分按照以下质量浓度配制而成：10.0g/l细菌学蛋白胨+3.0g/l牛肉浸膏+5.0g/l氯化钠+15.0g/l琼脂，ph为7.2；将上述的组分配制好后经高温消毒，然后冷凝则可以使用；

所述的解钾培养基由以下组分按照以下质量浓度配制而成：5.0g/l蔗糖+2.0g/lmgso4·7h2o+0.1g/lcaco3+0.005g/lfecl3+1.0g/l钾长石粉+20.0g/l琼脂；将上述的组分配制好后经高温消毒，然后冷凝则可以使用。

一种短小芽孢杆菌s1419在解钾中的应用，将所述的短小芽孢杆菌s1419与矿物态的钾混合能将矿物态的钾转化成水溶性钾。

较之前的现有技术，本发明的有益效果如下：本发明开发出一株具有较好应用前景的解磷短小芽孢杆菌s1419，能将矿物态钾(缓效钾)转化为速效钾，丰富生防资源。减少化肥钾的使用，可以减少化学肥料的使用，从而不会破坏土壤结构，使农业可持续发展。

附图说明

图1扫描电镜下菌株菌落形态

图2菌株解钾圈

图3菌株的16sdna序列比对结果

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

实施方式

所述短小芽孢杆菌为短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)s1419，于2019年5月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，简称为cgmcc，保藏编号为：cgmccno.17816。

称取新鲜的春羽的根际土壤(philodenronselloumkoch)，溶于蒸馏水中形成土壤溶液，充分摇匀振荡，然后配制浓度为10^-1～10^-6g/ml的土壤溶液，再吸取上述的土壤溶液，采用涂布法均匀地接种涂布在初筛培养基上，然后倒置于30℃恒温培养箱培养4天，再挑取长势好、完整的菌落进行分离、纯化得到初筛菌株，然后将初筛菌株接种在nb培养基上并倒置于30℃恒温培养箱培养3天，之后挑取nb固体培养基上的菌落点种至解钾培养基上，放置于30℃恒温培养箱培养3天，筛选得到所述的短小芽孢杆菌s1419；

所述的初筛培养基由以下组分按照以下质量浓度配制而成：5.0g/l蔗糖+2.0g/lmgso4·7h2o+0.1g/lcaco3+0.005g/lfecl3+20.0g/l琼脂；将上述的组分配制好后经高温消毒，然后冷凝则可以使用；

所述的nb培养基由以下组分按照以下质量浓度配制而成：10.0g/l细菌学蛋白胨+3.0g/l牛肉浸膏+5.0g/l氯化钠+15.0g/l琼脂，ph为7.2；将上述的组分配制好后经高温消毒，然后冷凝则可以使用；

所述的解钾培养基由以下组分按照以下质量浓度配制而成：5.0g/l蔗糖+2.0g/lmgso4·7h2o+0.1g/lcaco3+0.005g/lfecl3+1.0g/l钾长石粉+20.0g/l琼脂；将上述的组分配制好后经高温消毒，然后冷凝则可以使用。

一种短小芽孢杆菌s1419在解钾中的应用，将所述的短小芽孢杆菌s1419与矿物态的钾混合能将矿物态的钾转化成水溶性钾。

实施例1

称取新鲜的春羽的根际土壤(philodenronselloumkoch)，溶于蒸馏水中形成土壤溶液，充分摇匀振荡，然后配制浓度为10^-1g/ml的土壤溶液，再吸取上述的土壤溶液，采用涂布法均匀地接种涂布在初筛培养基上，然后倒置于30℃恒温培养箱培养4天，再挑取长势好、完整的菌落进行分离、纯化得到初筛菌株，然后将初筛菌株接种在nb培养基上并倒置于30℃恒温培养箱培养3天，之后挑取nb固体培养基上的菌落点种至解钾培养基上，放置于30℃恒温培养箱培养3天，筛选得到所述的短小芽孢杆菌s1419；

所述的初筛培养基由以下组分按照以下质量浓度配制而成：5.0g/l蔗糖+2.0g/lmgso4·7h2o+0.1g/lcaco3+0.005g/lfecl3+20.0g/l琼脂；将上述的组分配制好后经高温消毒，然后冷凝则可以使用；

所述的nb培养基由以下组分按照以下质量浓度配制而成：10.0g/l细菌学蛋白胨+3.0g/l牛肉浸膏+5.0g/l氯化钠+15.0g/l琼脂，ph为7.2；将上述的组分配制好后经高温消毒，然后冷凝则可以使用；

所述的解钾培养基由以下组分按照以下质量浓度配制而成：5.0g/l蔗糖+2.0g/lmgso4·7h2o+0.1g/lcaco3+0.005g/lfecl3+1.0g/l钾长石粉+20.0g/l琼脂；将上述的组分配制好后经高温消毒，然后冷凝则可以使用。

一种短小芽孢杆菌s1419在解钾中的应用，将所述的短小芽孢杆菌s1419与矿物态的钾混合能将矿物态的钾转化成水溶性钾。

实施例2

称取新鲜的春羽的根际土壤(philodenronselloumkoch)，溶于蒸馏水中形成土壤溶液，充分摇匀振荡，然后配制浓度为10^-2g/ml的土壤溶液，再吸取上述的土壤溶液，采用涂布法均匀地接种涂布在初筛培养基上，然后倒置于30℃恒温培养箱培养4天，再挑取长势好、完整的菌落进行分离、纯化得到初筛菌株，然后将初筛菌株接种在nb培养基上并倒置于30℃恒温培养箱培养3天，之后挑取nb固体培养基上的菌落点种至解钾培养基上，放置于30℃恒温培养箱培养3天，筛选得到所述的短小芽孢杆菌s1419；

所述的初筛培养基由以下组分按照以下质量浓度配制而成：5.0g/l蔗糖+2.0g/lmgso4·7h2o+0.1g/lcaco3+0.005g/lfecl3+20.0g/l琼脂；将上述的组分配制好后经高温消毒，然后冷凝则可以使用；

所述的nb培养基由以下组分按照以下质量浓度配制而成：10.0g/l细菌学蛋白胨+3.0g/l牛肉浸膏+5.0g/l氯化钠+15.0g/l琼脂，ph为7.2；将上述的组分配制好后经高温消毒，然后冷凝则可以使用；

所述的解钾培养基由以下组分按照以下质量浓度配制而成：5.0g/l蔗糖+2.0g/lmgso4·7h2o+0.1g/lcaco3+0.005g/lfecl3+1.0g/l钾长石粉+20.0g/l琼脂；将上述的组分配制好后经高温消毒，然后冷凝则可以使用。

一种短小芽孢杆菌s1419在解钾中的应用，将所述的短小芽孢杆菌s1419与矿物态的钾混合能将矿物态的钾转化成水溶性钾。

实施例3

称取新鲜的春羽的根际土壤(philodenronselloumkoch)，溶于蒸馏水中形成土壤溶液，充分摇匀振荡，然后配制浓度为10^-3g/ml的土壤溶液，再吸取上述的土壤溶液，采用涂布法均匀地接种涂布在初筛培养基上，然后倒置于30℃恒温培养箱培养4天，再挑取长势好、完整的菌落进行分离、纯化得到初筛菌株，然后将初筛菌株接种在nb培养基上并倒置于30℃恒温培养箱培养3天，之后挑取nb固体培养基上的菌落点种至解钾培养基上，放置于30℃恒温培养箱培养3天，筛选得到所述的短小芽孢杆菌s1419；

所述的初筛培养基由以下组分按照以下质量浓度配制而成：5.0g/l蔗糖+2.0g/lmgso4·7h2o+0.1g/lcaco3+0.005g/lfecl3+20.0g/l琼脂；将上述的组分配制好后经高温消毒，然后冷凝则可以使用；

所述的nb培养基由以下组分按照以下质量浓度配制而成：10.0g/l细菌学蛋白胨+3.0g/l牛肉浸膏+5.0g/l氯化钠+15.0g/l琼脂，ph为7.2；将上述的组分配制好后经高温消毒，然后冷凝则可以使用；

所述的解钾培养基由以下组分按照以下质量浓度配制而成：5.0g/l蔗糖+2.0g/lmgso4·7h2o+0.1g/lcaco3+0.005g/lfecl3+1.0g/l钾长石粉+20.0g/l琼脂；将上述的组分配制好后经高温消毒，然后冷凝则可以使用。

一种短小芽孢杆菌s1419在解钾中的应用，将所述的短小芽孢杆菌s1419与矿物态的钾混合能将矿物态的钾转化成水溶性钾。

实施例4

称取新鲜的春羽的根际土壤(philodenronselloumkoch)，溶于蒸馏水中形成土壤溶液，充分摇匀振荡，然后配制浓度为10^-4g/ml的土壤溶液，再吸取上述的土壤溶液，采用涂布法均匀地接种涂布在初筛培养基上，然后倒置于30℃恒温培养箱培养4天，再挑取长势好、完整的菌落进行分离、纯化得到初筛菌株，然后将初筛菌株接种在nb培养基上并倒置于30℃恒温培养箱培养3天，之后挑取nb固体培养基上的菌落点种至解钾培养基上，放置于30℃恒温培养箱培养3天，筛选得到所述的短小芽孢杆菌s1419；

所述的初筛培养基由以下组分按照以下质量浓度配制而成：5.0g/l蔗糖+2.0g/lmgso4·7h2o+0.1g/lcaco3+0.005g/lfecl3+20.0g/l琼脂；将上述的组分配制好后经高温消毒，然后冷凝则可以使用；

所述的nb培养基由以下组分按照以下质量浓度配制而成：10.0g/l细菌学蛋白胨+3.0g/l牛肉浸膏+5.0g/l氯化钠+15.0g/l琼脂，ph为7.2；将上述的组分配制好后经高温消毒，然后冷凝则可以使用；

所述的解钾培养基由以下组分按照以下质量浓度配制而成：5.0g/l蔗糖+2.0g/lmgso4·7h2o+0.1g/lcaco3+0.005g/lfecl3+1.0g/l钾长石粉+20.0g/l琼脂；将上述的组分配制好后经高温消毒，然后冷凝则可以使用。

一种短小芽孢杆菌s1419在解钾中的应用，将所述的短小芽孢杆菌s1419与矿物态的钾混合能将矿物态的钾转化成水溶性钾。

实施例5

称取新鲜的春羽的根际土壤(philodenronselloumkoch)，溶于蒸馏水中形成土壤溶液，充分摇匀振荡，然后配制浓度为10^-5g/ml的土壤溶液，再吸取上述的土壤溶液，采用涂布法均匀地接种涂布在初筛培养基上，然后倒置于30℃恒温培养箱培养4天，再挑取长势好、完整的菌落进行分离、纯化得到初筛菌株，然后将初筛菌株接种在nb培养基上并倒置于30℃恒温培养箱培养3天，之后挑取nb固体培养基上的菌落点种至解钾培养基上，放置于30℃恒温培养箱培养3天，筛选得到所述的短小芽孢杆菌s1419；

所述的初筛培养基由以下组分按照以下质量浓度配制而成：5.0g/l蔗糖+2.0g/lmgso4·7h2o+0.1g/lcaco3+0.005g/lfecl3+20.0g/l琼脂；将上述的组分配制好后经高温消毒，然后冷凝则可以使用；

所述的nb培养基由以下组分按照以下质量浓度配制而成：10.0g/l细菌学蛋白胨+3.0g/l牛肉浸膏+5.0g/l氯化钠+15.0g/l琼脂，ph为7.2；将上述的组分配制好后经高温消毒，然后冷凝则可以使用；

所述的解钾培养基由以下组分按照以下质量浓度配制而成：5.0g/l蔗糖+2.0g/lmgso4·7h2o+0.1g/lcaco3+0.005g/lfecl3+1.0g/l钾长石粉+20.0g/l琼脂；将上述的组分配制好后经高温消毒，然后冷凝则可以使用。

一种短小芽孢杆菌s1419在解钾中的应用，将所述的短小芽孢杆菌s1419与矿物态的钾混合能将矿物态的钾转化成水溶性钾。

实施例6

称取新鲜的春羽的根际土壤(philodenronselloumkoch)，溶于蒸馏水中形成土壤溶液，充分摇匀振荡，然后配制浓度为10^-6g/ml的土壤溶液，再吸取上述的土壤溶液，采用涂布法均匀地接种涂布在初筛培养基上，然后倒置于30℃恒温培养箱培养4天，再挑取长势好、完整的菌落进行分离、纯化得到初筛菌株，然后将初筛菌株接种在nb培养基上并倒置于30℃恒温培养箱培养3天，之后挑取nb固体培养基上的菌落点种至解钾培养基上，放置于30℃恒温培养箱培养3天，筛选得到所述的短小芽孢杆菌s1419；

所述的初筛培养基由以下组分按照以下质量浓度配制而成：5.0g/l蔗糖+2.0g/lmgso4·7h2o+0.1g/lcaco3+0.005g/lfecl3+20.0g/l琼脂；将上述的组分配制好后经高温消毒，然后冷凝则可以使用；

所述的nb培养基由以下组分按照以下质量浓度配制而成：10.0g/l细菌学蛋白胨+3.0g/l牛肉浸膏+5.0g/l氯化钠+15.0g/l琼脂，ph为7.2；将上述的组分配制好后经高温消毒，然后冷凝则可以使用；

所述的解钾培养基由以下组分按照以下质量浓度配制而成：5.0g/l蔗糖+2.0g/lmgso4·7h2o+0.1g/lcaco3+0.005g/lfecl3+1.0g/l钾长石粉+20.0g/l琼脂；将上述的组分配制好后经高温消毒，然后冷凝则可以使用。

一种短小芽孢杆菌s1419在解钾中的应用，将所述的短小芽孢杆菌s1419与矿物态的钾混合能将矿物态的钾转化成水溶性钾。

解钾菌的鉴定：

将上述实施例1-6中得到的菌株的进行如下菌落形态鉴定：在超净工作台内用接种环划线法将短小芽孢杆菌s1419接种至nb培养基上，倒置平板于30℃恒温培养箱内培养3天。观察并记录菌落形态。

菌株的菌体形态：用扫描电镜和普通光学显微镜观察菌体形态。(图1为实施例1的菌体形态，其它实施例的形态均相似。)

菌落与菌株形态：如图2所示，菌落在解钾培养基上呈现边缘整齐，为圆形，半透明凸起，表面湿润。接种环挑取时有弹性，拉成丝状。普通光学显微镜下，菌体呈现弧杆小球状，扫描电镜下观察，菌体呈短杆状，长度约5μm，直径约3μm。

菌株的生理生化测试：用接种环挑取适量的菌株进行革兰氏染色与镜检。据《常见细菌系统鉴定手册》其余生理生化测试，包括：糖发酵试验、甲基红试验、淀粉水解试验、吲哚试验、产硫化氢试验、脲酶试验、过氧化氢酶试验、氧化酶试验等。菌株生理生化特性测试结果见表1。

表1菌株生理生化试验结果

菌株分子生物学鉴定结果：将上述实施例1-6所得到的菌株经16sdna序列测定，在ncbi网站的blastn序列比对，菌株与参比的芽孢杆菌属同源相似度在99％以上，结合菌株形态学和生理生化试验结果，该菌株鉴定为短小芽孢杆菌，命名为短小芽孢杆菌s1419。

菌株分子生物学鉴定：将解钾能力的菌株送至铂尚生物技术(上海)有限公司福州测序部进行16sdna测序，返回序序列在ncbi网站上的blastn中进行序列比对，与菌体形态和生理生化测试结果结合，进行菌株种属鉴定。所得的解钾菌株potassiumsolubilzingbacterium与参比的芽孢杆菌属bacilluspumilus同源相似度在99％以上。

解钾菌的解钾能力用解钾圈法和四苯硼钠法分别测定。

解钾圈法：挑取单菌落的菌株接种于平板固体解钾培养基中，每个平板上种植4个点，每个重复两次，点种后，倒置于30℃培养3d，根据解钾圈直径(d)与菌落直径(d)的比值r(d/d)大小确定各个菌株的解钾能力，r越大表示菌株溶解钾的能力越强。

菌株的解钾能力：菌株在以钾长石粉作为唯一钾源的固体培养基平板(如解钾固体培养基)上可以生长，且形成解钾圈，说明菌株对钾长石粉矿物质具有解钾效果。经十字交叉法测定菌落和解钾圈直径(如图1菌株解钾圈所示)，菌株菌落直径与解钾圈直径比d/d为2.30±0.38(数据表示为：平均值±标准差，n＝4)。

四苯硼钠法：所得各菌株在液体发酵的条件下，采用四苯硼钠法测定发酵液中钾离子的浓度。

在超净工作台内用接种环将所得菌株接种至已灭菌50ml液体nb培养基，置于30℃气浴恒温摇床(180r/min)，培养20h。

所得菌株在超净工作台内用无菌移液管接种至已灭菌的液体解钾菌培养基中(与上述的解钾菌培养基的区别在于没有添加琼脂)。置于37℃气浴恒温摇床(180r/min)，培养7天。取出所得菌液，4000r/min，离心20min。用无菌移液管移取2.0ml上清液至容量瓶中，定容至50ml，用于测定(表征)解钾菌细胞外物质解钾能力。

钾标准曲线绘制：用移液管分别吸取氯化钾标准溶液0.0，0.1，0.2，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0至50ml容量瓶中，分别准确移加1.0ml甲醛-edta掩蔽剂进行摇匀，再用移液管快速移加1.0ml四苯硼钠溶液，同时充分摇匀，并将其定容至50ml，各容量瓶中钾标准溶液浓度分别为0.0，0.2，0.4，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0mg/l。放置15min后摇匀，用分光光度计测420nm波长处的吸光度。以氯化钾浓度作为横坐标，以吸光度作为纵坐标，绘制标准曲线。

四苯硼钠法测定钾：将上述已定容至50ml的6个实施例的上清液，用移液管移加1.0ml甲醛-edta掩蔽剂摇匀，再用移液管快速移加1.0ml四苯硼钠溶液，同时充分摇匀，放置15min后摇匀。用分光光度计测上述实施例的上清液于420nm波长处的吸光度，下表是实施例5所示的数据。

如表2所示，菌株解钾效果：采用四苯硼钠法测定，菌株解钾效果与空白组进行对照，解钾率达170.19％。

表2菌株解钾效果测定结果

数据表示：平均值±标准差，n＝4，p＜0.01。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

序列表

<110>福建师范大学福清分校

<120>短小芽孢杆菌s1419及其在解钾上的应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1419

<212>dna

<213>短小芽孢杆菌s1419(bacilluspumilus)

<400>1

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